細(xì)胞生物學(xué) 4第四次實(shí)驗(yàn)

第四次實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)九植物細(xì)胞骨架的制片技術(shù)及形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)十細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本的制備與形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)九植物細(xì)胞骨架的制片技術(shù)及形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握光鏡下細(xì)胞骨架的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.了解微絲的顯示方法。細(xì)胞骨架細(xì)胞質(zhì)骨架（cytoskeleton）指真核細(xì)胞中的蛋白纖維的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞質(zhì)骨架包括微絲（microfilament）、微管（microtubule）和中間纖維（intemediatefilament）。微絲確定細(xì)胞表面特征，使細(xì)胞能夠運(yùn)動(dòng)和收縮。微管確定膜性細(xì)胞器的位置和作為膜泡運(yùn)輸?shù)膶?dǎo)軌。中間纖維使細(xì)胞具有張力和抗剪切力。其它骨架成分：細(xì)胞核骨架、細(xì)胞膜骨架、細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞核（紫色）與細(xì)胞骨架

細(xì)胞骨架是由微管蛋白（黃色）形成的微管和由肌動(dòng)蛋白（藍(lán)色）形成的微絲等組成。實(shí)驗(yàn)原理

用TritonX-100溶液處理細(xì)胞時(shí)，可使細(xì)胞質(zhì)膜中和細(xì)胞質(zhì)中的全部脂質(zhì)和部分蛋白質(zhì)被溶解抽提，但細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)不受破壞而被保存。經(jīng)固定和考馬斯亮蘭（非特異性蛋白質(zhì)染料）染色后，可在光鏡下觀察到由微絲組成的纖維束（藍(lán)色）。實(shí)驗(yàn)用品1.材料：洋蔥2.藥品：

0.2MpH7.3磷酸緩沖液（PB）

0.01M磷酸鹽緩沖液（PBS）：0.2MPB50ml加0.15M氯化鈉50ml雙蒸水定至1LM-緩沖液：50mM

咪唑，0.5mM

氯化鎂，50mM

氯化鉀，1mMEGTA[乙二醇-雙-（2-氨基乙基醚）四乙酸]，0.1mMEDTA（乙二胺四乙酸），1mMDTT（二硫蘇糖醇），4mM

甘油

1%TritonX-100（用M-緩沖液配制）

3%戊二醛（用0.01MPBS配制）

0.2%考馬斯亮藍(lán)R250（用少許無(wú)水乙醇溶解，然后用12.5%三氯醋酸定容，裝瓶備用）3.用具：燒杯、剪刀、鑷子、手術(shù)刀、滴管、稱量瓶、顯微鏡、載玻片等實(shí)驗(yàn)方法1.用鑷子撕取若干片洋蔥鱗片的內(nèi)表皮（不要用靠近鱗片邊緣的表皮），剪成0.5×0.5cm大小，放入容器中，加入PBS，浸泡3min；2.吸去磷酸鹽緩沖液，加入1%TritonX-100，處理30min（28℃恒溫箱）。然后用M-緩沖液洗3～5次，每次5min；3.再加入3%戊二醛液，固定20min（28℃恒溫箱）；然后用PBS洗3～5次，每次5min；4.然后用0.2%考馬斯亮藍(lán)染色20min（在載玻片上進(jìn)行）；之后用PBS沖洗至水無(wú)色；5.制片，并觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

取內(nèi)表皮，置于載玻片上，加PBS浸2min

吸去PBS，加2~3滴1%TritonX-100，處理25min

吸去TritonX-100，用M-緩沖液洗3次，每次2min

吸去M-緩沖液，加2~3滴3%戊二醛，固定15min

用PBS洗3次，每次2min

吸去PBS，加2~3滴0.2%考馬斯亮藍(lán)，染色15min

用PBS洗2次，每次2min，吸干，鏡檢細(xì)胞骨架標(biāo)本觀察作業(yè)在顯微鏡下截取細(xì)胞骨架的圖片，并加以標(biāo)注。原理有絲分裂是真核生物體細(xì)胞的基本增殖方式。通過(guò)DNA的復(fù)制，以及染色體的分裂，實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)平均分配到兩個(gè)新的子細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)十細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本的制備與形態(tài)觀察有絲分裂的特點(diǎn)和意義

特點(diǎn)：染色體復(fù)制一次，細(xì)胞分裂一次，結(jié)果1個(gè)細(xì)胞變?yōu)?/p>

2

個(gè)細(xì)胞，且兩個(gè)子細(xì)胞與母細(xì)胞遺傳物質(zhì)在質(zhì)量上和數(shù)量上完全一致。

意義：保證了物種遺傳的連續(xù)性和穩(wěn)定性。

維持了個(gè)體的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。細(xì)胞有絲分裂為了便于描述人為地劃分為六個(gè)時(shí)期：間期（interphase）；前期(prophase)；前中期(premetaphase);中期(metaphase)；后期(anaphase)；末期(telophase)。間期

包括G1期、S期和G2期。

G1期：

是從細(xì)胞分裂完成到DNA開(kāi)始復(fù)制的時(shí)期，有大量RNA和蛋白質(zhì)形成；S期：

是DNA進(jìn)行復(fù)制階段，DNA含量加倍；G2期：

合成與有絲分裂有關(guān)的物質(zhì)。前期①染色質(zhì)凝縮，②分裂極確立與紡錘體開(kāi)始形成，③核仁解體，④核膜消失。前期開(kāi)始的標(biāo)志：第一個(gè)特征：染色質(zhì)開(kāi)始濃縮、凝集形成染色體。第二個(gè)特征：細(xì)胞骨架解聚，有絲分裂紡錘體開(kāi)始裝配。前期中期所有染色體排列到赤道板上，標(biāo)志著細(xì)胞分裂已進(jìn)入中期。后期2條姐妹染色體單體分開(kāi)并移向兩極。末期

從染色單體到達(dá)兩極，至形成兩個(gè)新細(xì)胞為止的時(shí)期。涉及子核的形成和胞質(zhì)分裂兩個(gè)方面。細(xì)胞有絲分裂周期植物細(xì)胞的細(xì)胞周期1.植物細(xì)胞的細(xì)胞周期與動(dòng)物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞周期非常相似，含有G1期、S期、G2期和M期四個(gè)時(shí)期。2.植物細(xì)胞不含中心體，但在細(xì)胞分裂時(shí)可以正常組裝紡錘體。3.植物細(xì)胞以形成中板的形式進(jìn)行胞質(zhì)分裂。植物細(xì)胞有絲分裂實(shí)驗(yàn)用品1.材料洋蔥根尖2.器材顯微鏡、解剖針、鑷子、蓋玻片、載玻片、培養(yǎng)皿等3.試劑

70%乙醇、45%醋酸、改良?jí)A性品紅染液實(shí)驗(yàn)方法1.取材：將洋蔥置于盛有水的小燒杯上，使其鱗莖浸入水中，室溫培養(yǎng)3～5d，每天換水。待其根尖長(zhǎng)到2～3cm時(shí)，切取1cm左右的根尖。2.預(yù)處理：將根尖浸入蒸餾水中，放置冰箱（4℃）中處理24h。減緩細(xì)胞的有絲分裂，使處在分裂期的細(xì)胞數(shù)量增多，便于觀察。也可用秋水仙素進(jìn)行處理。3.固定：取出材料，放入卡諾氏固定液中固定3h左右。固定液用量約為材料體積的15倍以上，若固定不好，會(huì)影響以后的步驟。實(shí)驗(yàn)方法4.解離：將固定的根尖用清水漂洗幾次，然后用1mol/L的HCl

在60℃處理30min左右?；蛴?mol/L的HCl

室溫處理5～10min。5.染色和制片：將解離后的根尖用水漂洗3次，放在載玻片上，用鑷子輕輕搗碎。用堿性品紅染色5～10min后，用吸水紙吸去多余的染料，蓋上蓋玻片，用鉛筆或橡皮頭輕輕敲打，使細(xì)胞彼此離散。6.鏡檢：在顯微鏡下觀察根尖細(xì)胞，如果細(xì)胞染色過(guò)深，可加上45%的醋酸（或95%乙醇），進(jìn)行分色處理。分色時(shí)，一般是在蓋玻片的一邊滴加45%的醋酸，另一邊用吸水紙吸去多余的液體。如果細(xì)胞重疊比較嚴(yán)重，可用橡皮頭再次輕輕敲打，直至細(xì)胞在玻片上呈淡淡的云霧狀為止。

注意：敲打時(shí)不要使細(xì)胞在玻片上發(fā)生扭動(dòng)，而使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。根尖分區(qū)示意圖

roottip.Examinethesquarecellsjustinsidetherootcap.Thisistherootmeristem(embryonictissue)wheremitosisisoccurring.Fartheruptherootistheelongationzone,wherecellsarelongrectangles;thesecellsarenotundergoingmitosis.顯微觀察低倍鏡下