薄層色譜法標準操作規(guī)程

年4月19日薄層色譜法標準操作規(guī)程文檔僅供參考標準操作規(guī)程STANDARDOPERATIONPROCEDURE編號SOP-02-QC-014題目薄層色譜法標準操作規(guī)程版本號0.0生效日期12月1日編制部門QC簽名/日期審核部門QC經(jīng)理簽名/日期審核部門QA經(jīng)理簽名/日期批準質量副總經(jīng)理簽名/日期頒發(fā)部門質量保證部分發(fā)部門QC1目的：規(guī)范薄層色譜法的標準操作程序，使其操作過程規(guī)范化，避免人為錯誤。2適用范圍：適用于薄層色譜法的標準操作。3責任：QC人員對本SOP實施負責。4內容薄層色譜法系將供試品溶液點于薄層板上，在展開容器內用展開劑展開，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的標準物質按同法所得的色譜圖對比，亦可用薄層色譜掃描儀進行掃描，用于鑒別、檢查或含量測定。4.1.儀器與材料4.1.1.薄層板按支持物的材質分為玻璃板、塑料板或鋁板；按固定相種類分為硅膠薄層板、鍵合硅膠板、微晶纖維素薄層板、聚酰胺薄層板、氧化鋁薄層板等。固定相中可加入黏合劑、熒光劑。硅膠薄層板常見的有硅膠G、硅膠、硅膠H、硅膠、G、H表示含或不含石膏黏合劑。為在紫外光254nm波長下顯綠色背景的熒光劑。按固定相粒徑大小分為普通薄層板（10?40μm)和髙效薄層板(5?10μm)。在保證色譜質量的前提下，可對薄層板進行特別處理和化學改性以適應分離的要求，可用實驗室自制的薄層板。固定相顆粒大小一般要求粒徑為10?40μm。玻璃板應光滑、平整，洗凈后不附水珠。4.1.2.點樣器一般采用微升毛細管或手動、半自動、全自動點樣器材。4.1.3.展開容器上行展開一般可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽展開缸，展開時需能密閉。水平展開用專用的水平展開槽。4.1.4.顯色裝置噴霧顯色應使用玻璃噴霧瓶或專用噴霧器，要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細霧狀噴出；浸漬顯色可用專用玻璃器械或者適宜的展開缸代用；蒸汽熏蒸顯色可用雙槽展開缸或適宜大小的干燥器代替。4.1.5檢視裝置為裝有可見光、254nm、365nm紫外光光源及相應的濾光片的暗箱，可附加攝像設備供拍攝圖像用。暗箱內光源應有足夠的光照度。4.1.6.薄層色譜掃描儀系指用一定波長的光對薄層板上有吸收的斑點，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點，進行掃描，將掃描得到的譜圖和積分數(shù)據(jù)用于物質定性或定量的分析儀器。4.2.操作方法4.2.1.薄層板制備市售薄層板臨用一般應在110°C活化30分鐘。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板、塑料薄層板可根據(jù)需要剪裁，但須注意裁后的薄層板底邊的固定相層不得有破損。如在存放期間空氣中雜質污染，用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶劑在展開缸中上行展開預洗，晾干，110℃活化，置干燥器中備用。自制薄層板除另有規(guī)定外，將1份固定相和3份水(或加有黏合劑的水溶液，如0.2%?0.5%羥甲基纖維素鈉水溶液，或規(guī)定度的改性劑溶液）在研缽中按同一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地移動涂布進行涂布（厚度為0.2?0.3mm)，取下涂好薄層的玻板，置水平臺上于室溫下晾干后，在110℃烘30分鐘，隨即置于有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度，在反射光及透視光下檢視，表面應均勻、平整、光滑，而且無麻點、無氣泡、無破損及污染。4.2.2.點樣除另有規(guī)定外，在潔凈干燥的環(huán)境中，用專用的毛細管點樣于薄層板上，一般為圓點，位置應正確、集中。點樣：基線距底邊10～15mm,高效薄層板一般基線離底邊為8～10mm,圓點狀直徑一般不大于4mm，高效薄層板一般不大于2mm，接觸點樣時注意勿損傷薄層表面，點間距離可視斑點擴散情況以相鄰斑點互不干擾為宜，一般不少于8mm，高效薄層供試品間距不小于5mm。4.2.3.展開將點好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑的深度為距圓點5mm為宜，密閉。除另有規(guī)定外，一般上行展開8～15cm，高效薄層板上行展開5～8cm，溶劑前沿達到規(guī)定的展距，取出薄層板，晾干，待檢測。展開前如需要溶劑蒸氣預平衡，可在展開缸中加入適量的展開劑，密閉，一般保持15~30分鐘。溶劑蒸氣預平衡后。應迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，展開。如需使展開缸達到溶劑蒸氣飽和的狀態(tài)，則需在展開缸內壁貼與展開缸高、寬同樣大小的濾紙，一端浸入展開劑中，密閉一定時間，使溶劑蒸氣達到飽和再如法展開。必要時，可進行二次展開或雙向展開，進行第二次展開前，應使薄層板殘留的展開劑完全揮干。4.2.4.顯色與檢視有顏色的物質可在可見光下直接檢視，無色物質可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色，或加熱顯色，在可見光下檢視，有熒光的物質或顯色后可激發(fā)產(chǎn)生熒光的物質可在紫外光燈（365nm或254nm）下觀察熒光斑點。對于在紫外光下有吸收的成分，可用帶有熒光劑的薄層板（如硅膠板），在254nm紫外光下觀察熒光板面上的熒光猝滅物質形成的斑點。4.2.5.記錄薄層色譜圖像一般可用攝像設備拍攝，以光學照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層掃描儀記錄相應的色譜圖。4.3.系統(tǒng)適用性試驗按各品種下要求對檢測方法進行系統(tǒng)適用性試驗，即供試品和對照品對試驗條件進行試驗和調整，應符合規(guī)定的要求。4.3.1.比移值指基線至展開斑點中心的距離與基線至展開劑前沿的距離的比值。除另有規(guī)定外，雜質檢查時，各雜質斑點的比移值以在0.1-0.8之間為宜。4.3.2.檢出限指限量檢查或雜質檢查時，供試品溶液中被測物質能被檢出的最低濃度或量。一般采用已知濃度的供試品溶液或對照標準溶液，與稀釋若干倍的自身對照標準溶液在規(guī)定的色譜條件下，在同一薄層色譜板上點樣、展開、檢視，后者顯清晰可辨斑點的濃度或量作為檢出限。4.3.3.分離度鑒別時，供試品與標準物質色譜中的斑點均應清晰分離。當薄層色譜掃描法用于限量檢查和含量測定時，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度（R）的計算公式為：R=2式中為相鄰兩峰中后一峰與原點的距離為相鄰兩峰中前一峰與原點的距離為相鄰兩峰各自的峰寬除另有規(guī)定外，分離度應大于1.0在化學藥品雜質檢查的方法選擇時，將雜質對照品用供試品自身釋的對照溶液溶解制成混合對照溶液，也可將雜質對照品用待測組分的對照品溶液溶解制成混合對照標準溶液，還可采用供試品以適當?shù)慕到夥椒ǐ@得的溶液，上述溶液點樣展開后的色譜圖中，應顯示清晰分離的斑點。4.3.4.相對標準偏差薄層掃描含量測定時，同一供試品溶液在同一薄層板上平行點樣的待測成分的峰面積測量值的相對標準偏差應不大于5.0%；需顯色后測定的或者異板的相對標準偏差應不大于10.0%。4.4.測定法(1)鑒別按各品種項下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對照標準溶液，在同一薄層板上點樣、展開與檢視，供試品色譜圖中所顯斑點的位置和顏色（或熒光)應與標準物質色譜圖的斑點一致。必要時化學藥品可采用供試品溶液與標準溶液混合點樣、展開，與標準物質相應斑點應為單一、緊密斑點。(2)限量檢査與雜質檢査按各品種項下規(guī)定的方法，制備供試品溶液和對照標準溶液，并按規(guī)定的色譜條件點樣、展開和檢視。供試品溶液色譜圖中待檢查的斑點與相應的標準物質斑點比較，顏色(或熒光)不得更深；或照薄層色譜掃描法操作，測定峰面積值，供試品色譜圖中相應斑點的峰面積值不得大于標準物質的峰面積值。含量限度檢查應按規(guī)定測定限量?；瘜W藥品雜質檢查可采用雜質對照法、供試品溶液的自身稀釋對照法、或兩法并用。供試品溶液除主斑點外的其它斑點與相應的雜質對照標準溶液或系列濃度雜質對照標準溶液的相應主斑點比較，不得更深，或與供試品溶液自身稀釋對照溶液或系列濃度自身稀釋對照溶液的相應主斑點比較，不得更深。一般應規(guī)定雜質的斑點數(shù)和單一雜質量，當采用系列自身稀釋對照溶液時，也可規(guī)定估計的雜質總量。(3）含量測定照薄層色譜掃描法，按各品種項下規(guī)定的方制備供試品溶液和對照標準溶液，并按規(guī)定的色譜條件點樣、展開、掃描測定?；驅⒋郎y色譜斑點刮下經(jīng)洗脫后，再用適宜的方法測定。4.5.薄層色譜掃描法系指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中可吸收紫外光或可見光的斑點，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分數(shù)據(jù)用于鑒別、檢查或含量測定?？筛鶕?jù)不同薄層色譜掃描儀的結構特點，按照規(guī)定方式掃描測定，一般選擇反射方式，采用吸收法或熒光法。除另有規(guī)定外，含量測定應用市售薄層板。掃描方法采用單波長掃描或雙波長掃描。如采用雙波長掃描，應選用待測斑點無吸收或最小吸收的波長為參比波長，供試品色譜圖中待測斑點的比移值(值）、光譜掃描得到的吸收光譜圖或測得的光譜最大吸收和最小吸收應與對照標準溶液相符，以保證測定結果的準確性。薄層色譜掃描定量測定應保證供試品斑點的量在線性范圍內，必要時可適當調整供試品溶液的點樣量，供試品與標準物質同板點樣、展開、掃描、測定和