第二章基因工程制藥新

第三節(jié)基因工程制藥生產(chǎn)的基本過程一、工具酶的分離純化二、載體的分離純化三、外源DNA和目的基因的分離和獲得四、外源DNA與載體DNA的切割與連接五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮髁?、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長代謝的特點(diǎn)七、基因工程菌中試八、基因工程菌的擴(kuò)增和發(fā)酵生產(chǎn)九、基因工程藥物的分離和純化技術(shù)十、變性蛋白的復(fù)性十一、基因工程藥物的質(zhì)量控制十二、基因工程藥物的制造實(shí)例血紅蛋白基因血紅蛋白基因排列順序血紅蛋白的結(jié)構(gòu)血紅蛋白的運(yùn)送氧氣功能血紅蛋白的基因工程流程一、工具酶的分離純化（一）基因工程制藥所用到的工具酶

（二）關(guān)于限制酶（三）關(guān)于連接酶

（一）基因工程制藥所用到的工具酶限制性內(nèi)切酶 甲基化酶Klenow聚合酶

T4-DNA聚合酶T4-多核苷酸激酶 堿性磷酸酶核酸酶-S1 核酸酶-Bal31綠豆核酸酶 核糖核酸酶人外切核酸酶 DNA酶-1外切RNA酶-III 外切RNA酶-VIDNA聚合酶1

T4-DNA連接酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 T4-RNA連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶大腸桿菌-DNA連接酶

（二）關(guān)于限制酶1、宿主限制現(xiàn)象2、限制酶的定義3、限制酶的特征4、限制酶的作用5、基因工程所用到的限制酶6、影響限制酶作用的因素

1、宿主限制現(xiàn)象

病毒或噬菌體在宿主A細(xì)胞中生長良好,但在宿主B細(xì)胞中生長很差,原因是它的DNA受到宿主B的限制,這種現(xiàn)象是宿主控制性限制（restriction）與修飾(modification),簡稱（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。R/M體系：是由兩種酶活性配合完成的：一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶※當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。

※EcoB(大腸桿菌B株)的核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。

R/M體系的作用：保護(hù)自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解TGAN8TGCTACTN8ACGATGAN8TGCTACTN8ACGAECOB核酸酶甲基化酶CH3CH3CH3CH3噬菌體來源序列宿主來源序列※限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制?！捎赗/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。2、限制酶的定義

凡是能夠識(shí)別和切割DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶稱為限制酶。限制酶分為三個(gè)類型：（1）Ⅰ型限制酶-----由于其切點(diǎn)不固定，很難形成特異性的切割末端。（2）Ⅱ型限制酶-----是位點(diǎn)特異性酶，是基因工程理想的工具酶。（3）Ⅲ型限制酶-----對(duì)DNA的識(shí)別與切割點(diǎn)不同，不產(chǎn)生特異性DNA片段。3、限制酶的特征

具有專一性的識(shí)別位點(diǎn)。能夠形成固定的核苷酸單鏈末端。比較適合于進(jìn)行DNA結(jié)構(gòu)的分析和進(jìn)行基因重組。4、限制酶的作用（1）進(jìn)行DNA重組。（2）構(gòu)建新載體。（3）構(gòu)建基因文庫。（4）進(jìn)行DNA序列分析。（5）制備DNA放射性探針。5、基因工程所用到的限制酶通常是Ⅱ型限制酶，具體有以下幾種。EcoR-I

Hind-III

BamH-IPst-I Sst-I Sal-IAva-I Bcl-I Hind-IIHpa-I Bgl-II Cla-IHae-III Hha-I Hinf-IHpa-II Mbo-I Sma-IXba-I

Xho-I6、影響限制酶作用的因素（1）DNA的純度（2）DNA的甲基化程度（3）DNA的結(jié)構(gòu)（4）反應(yīng)的溫度----最適溫度為37度（5）反應(yīng)的緩沖體系----反應(yīng)體系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白。它們具有激活酶、穩(wěn)定酶的作用。（三疲）關(guān)掃于連獎(jiǎng)接酶1、定貨義--掌--凡是蒼能夠篩催化DN錯(cuò)A片段5’-末端階的磷播?；c3’-末端避的羥梢基結(jié)合休成磷酸館二酯貌鍵的酶騙，稱狠為連恢接酶識(shí)。2、作朽用--閱--主要起用于進(jìn)（1）正擋常DN擱A的合裁成。盒（2）損濾傷DN阿A的修厚復(fù)。3、種庫類皇（1）DN雄A-連接筍酶--熱--廣泛嘗存在言于生引物細(xì)別胞之稈中，耕主要蟻取自胞于大則腸桿甘菌E.多co側(cè)li。拖（2）T4懼-D壇NA連接安酶--撲--來自痛于經(jīng)稍過T4符-噬菌馳體感琴染的聾大腸罵桿菌E.窯co肢li。（3鈔T4蜂-R音NA連接替酶--顫--催化買單鏈DN嶼A或RN腫A的5‘磷酸值與另握一單念鏈DN廁A或RN瞧A的3’羥基傷之間尊形成尸共價(jià)鑒連接蒸。二、液基因戴工程房誠載體托的分視離純荒化（一猜）定姓義（二際）基壺因工添程載唯體的桌必備肅條件（三也）基勇因工賴程載送體的蔑種類（一匙）定保義能夠路將目污的基堵因攜帶進(jìn)宿異主細(xì)宇胞、廚并可物使得回目的心基因肢能夠御在宿臭主體邁內(nèi)進(jìn)隸行自主汗性復(fù)川制的遺講傳因榜子，輸稱為御基因跑工程鵲載體借。（二讀）基教因工媽程載筐體的世必備循條件（1）具死有有眠效運(yùn)載能力清。寸（2）載徹體自嗓身能股夠獨(dú)立唯復(fù)制，并通且在佛宿主訴體內(nèi)呼進(jìn)垂行餓自主彈性復(fù)鞏制。打（3）載丙體在蕉攜帶西目的豪基因錯(cuò)之后赤，還機(jī)能夠觸在宿制主體謹(jǐn)內(nèi)進(jìn)饒行自主史性復(fù)逮制。侵（4）在障宿主霧體內(nèi)率，能遞夠控呆制外刑源基譜因的肉表達(dá)就活動(dòng)排。撐（5）能妨夠攜惰帶大色小不簡同的憤外源胳性目漲的基潛因。坡（6）鑒由定方談便、各裝卸雷技術(shù)烘簡單謝。勁（7）容隸易控更制、簽安全狹可靠常。（8）應(yīng)到具有挪靈活學(xué)的克隆鵝位點(diǎn)、并掠且有找方便別的篩選帽標(biāo)記。禍（9）應(yīng)羊具有免很強(qiáng)欺的啟動(dòng)里子。揀（10）應(yīng)鳥具有阻遏礙子，使趨啟動(dòng)浴子受廢到控婦制，姑因?yàn)槭餐庠雌不蚰母吆П砘歼_(dá)會(huì)熊抑制判宿主置細(xì)胞滲的生掀長、沫增殖怕，而集阻遏抱子可牙使宿鍬主細(xì)饅胞免咸受這鑰種影唐響。煎（11）應(yīng)駛具有肢很強(qiáng)秒的終止鎮(zhèn)子，以玩便重睬點(diǎn)克所隆外守源基寫因區(qū)盡段，蜻而不樸轉(zhuǎn)錄摸其它屈無關(guān)例基因款。勺（12）所潮產(chǎn)生里的mR篇NA必須鍋具有租翻譯椅的起鞋始信兄號(hào)，現(xiàn)即含勇有起勾始密醉碼AU遣G和SD序列掠，以嚴(yán)便轉(zhuǎn)奇錄之走后能倆夠順餅利于答進(jìn)行決翻譯炕。（三搞）基撈因工熟程載現(xiàn)體的專種類1、細(xì)晝菌質(zhì)紡粒2、真蜓核基根因病羊毒DN陸A3、λ噬菌太體DN豬A4、單律鏈DN是A噬菌陣體M1胳3載體5、人令工質(zhì)雞粒載克體--衡--科斯鉗質(zhì)粒6、酵母人工鴿染色癢體7、其密他載銜體1、細(xì)澇菌質(zhì)缸粒（1）質(zhì)前粒的悉定義（2）質(zhì)剪粒的飲特性（3）質(zhì)第粒的踐分類（4）質(zhì)精粒載務(wù)體的施具備距條件（5）常桌用的冬細(xì)菌輔質(zhì)粒（1）質(zhì)池粒的歉定義存在展于天予然細(xì)吼菌體今內(nèi)的駱一種睬獨(dú)立謀于細(xì)袖菌染銷色體城之外鋤的雙鏈稍環(huán)狀DN脈A，具弱有獨(dú)立酬復(fù)制的能輝力，述常帶擇有細(xì)謠菌的抗藥障基因。也缸存在稀于某運(yùn)些真劫核細(xì)皮胞（酵母啦的2μ環(huán)狀吐質(zhì)粒）質(zhì)粒粥載體(p廢la翼sm列id中)（2）質(zhì)集粒的甩特性獨(dú)立吐于細(xì)陸菌染潮色體慮之外順的環(huán)狀DN轟A或RN謊A。其遺狡傳特構(gòu)性屬沿于非染昂色體庸控制。能夠膝進(jìn)行自我俯復(fù)制。容易別在宿扛主體勇內(nèi)進(jìn)棗行轉(zhuǎn)移貌和遷牧移?？删幦写a宿匹主染花色體戴所不督具有環(huán)的基牛因。要能夠惠賦予新宿主踏額外據(jù)的遺翅傳特觀性：A、編倆碼產(chǎn)孩生抗生驅(qū)素酶的抗道性基帽因，B、編傻碼產(chǎn)技生糖酵逃解酶描系的基伍因，C、編善碼產(chǎn)滑生抗重伐金屬流酶的抗蹦性基編因。質(zhì)粒葬的復(fù)權(quán)制類共型◆嚴(yán)謹(jǐn)泄型（st卸ri奏ge啄nt跳p爸la戶sm平id庫)：復(fù)制旁與宿閑主染翁色體踢同步骨受宿兩主染牢色體電復(fù)制珍的限條制，博在宿慌主細(xì)孝胞中督拷貝怠數(shù)低導(dǎo)約１～抵３份蓮拷貝?！羲沙趬涡停╮e支la愈xe高d賭pl粘as筑mi壓d)錦:復(fù)制尸不受個(gè)宿主醬染色牛體復(fù)石制的限制章可獨(dú)周立復(fù)然制，毅在宿超主細(xì)棋胞中址拷貝數(shù)的高，躲宿主潤細(xì)胞械中質(zhì)起粒有10共-2我00拷貝?；蚶O工程且常用召載體。質(zhì)粒DN康A(chǔ)的構(gòu)燙型三種惰不同袖的構(gòu)恐型：當(dāng)其接兩條貓核苷懷酸鏈宜均保鴨持著出完整犁的環(huán)悶形結(jié)齊構(gòu)時(shí)加，稱嫂為共價(jià)頑閉合辜環(huán)形DN腰A(源cc黑cD傍NA地)，這組樣的DN艱A通常室呈現(xiàn)悲超螺閃旋的SC構(gòu)型面；如果是兩條濁多核鄭苷酸默鏈中錫只有患一條駱保持陽著完虜整的替環(huán)形菌結(jié)構(gòu)詞，另唐一條暖鏈出氧現(xiàn)有母一至彼數(shù)個(gè)廊缺口掏時(shí)，酬稱之則為開環(huán)DN舟A(詠oc昏DN稠A)；若質(zhì)惹粒DN甲A的雙韻鏈均飛發(fā)生捕斷裂至而形衫成線粒形分裝子，緩則通當(dāng)稱為L構(gòu)型。單鏈切割連接單鏈切割連接共價(jià)丈閉合提環(huán)形DN悅A（SC型）開環(huán)DN喉A（oc型）線性DN旋A（L型）環(huán)形袖雙鏈礙的質(zhì)叫粒DN脈A分子彩具有煌三種舅不同駕構(gòu)型（3）質(zhì)功粒的瘦分類F質(zhì)粒--甜--可使優(yōu)宿主A的部蓋分基犧因隨菜著F質(zhì)粒糖一起芒轉(zhuǎn)移脂到不師存在閉該質(zhì)天粒的膏另一冒宿主B的體謎內(nèi)。R質(zhì)粒--消--可編版碼宿主A的一幅種或李者數(shù)似種抗惹生素雜抗性困基因著，并劉能夠宰將它棍們帶到不存徹在該咸質(zhì)粒恭的另姥一宿主B的體坦內(nèi)，潮使得富宿主B也獲噸得同芳樣的務(wù)抗性災(zāi)。Co扶l質(zhì)粒--番--能編研碼大腸板桿菌捕毒素槳基因，通叫過表叼達(dá)之娘后產(chǎn)染生的命大腸偉桿菌身毒素慕可以鬧使得閉不帶Co具l質(zhì)粒襖的其寄它菌毅株死搏亡。（4）質(zhì)區(qū)粒載贏體具殃備條他件質(zhì)粒雪載體貫，也挖稱質(zhì)至粒克孩隆載玩體，未是指休用于齊實(shí)現(xiàn)允基因捕工程影操作最的質(zhì)末粒。踢必須牙具備陽以下欲條件纖：（1）其腸分子胞結(jié)構(gòu)帽中必戴須具譯有多稀個(gè)單蹄一限制偵酶的燥切割趕位點(diǎn)。（2）構(gòu)挪建重歇組質(zhì)鋸粒之暫后必慎須具租有轉(zhuǎn)化據(jù)功能。（3）分光子量愿較小繳，易再于操辨作。（4）宿竊主范尼圍較批為單取一、館無感鳥染性援。（5）常發(fā)用的扭細(xì)菌里質(zhì)粒pB捆R3載22罩p晌BH圖10覺pB儉H2上0pT猾R2扁62狠p處AT授15廳3遷p往Xf痕3Pm固k1樹6費(fèi)pG澤EM蝕-3梨Z扎p惱UC瓣19[A尚]、pB掏R3汽22質(zhì)粒[B布]、pU委C1媽9質(zhì)粒[C皆]、pG縮慧EM斑-3敘Z質(zhì)粒[A痕]、pB脅R3晚22質(zhì)粒①丹4巴36達(dá)3辰bp②含一絹個(gè)復(fù)史制點(diǎn)含一似個(gè)抗掘氨卞網(wǎng)青霉筑素基橋因(am辯pR)④一個(gè)傘抗四棵環(huán)素高基因(te衰tR)⑤am住pR和te喇tR抗性男基因獨(dú)內(nèi)各獵有一盤些限織制酶?jìng)涞拿嘎汕形欢劈c(diǎn)，棋供外辣源基訊因插竹入當(dāng)外都源基咽因插友入抗繞藥基勻因內(nèi)們，抗場(chǎng)藥基齡因失隊(duì)活。Am僻pR→A記mp敏感(Am斤pS)、Te肉tR→T守et敏感(Te層tS).pB魂R3釋22胳:人工虹構(gòu)建咐重要克質(zhì)粒優(yōu)點(diǎn)斷：具互有較共小的血分子造量．具有碗兩種斃抗生鉤素抗叫性基沸因，棚作為悠篩選競(jìng)標(biāo)記扔．具有回高拷抬貝數(shù)新．是松企弛型舒質(zhì)粒銅．[B懸]、pU鄉(xiāng)豐C系列平質(zhì)粒由pB種R3躁22和M1院3噬菌旬體構(gòu)扭建而酸成的輕雙鏈鬧質(zhì)粒柳載體欠；（1）26哥74朱bp；（2）卻有am激pR和位蛙于la禮cZ補(bǔ)+基因?yàn)I中靠解近5’端多絹克隆州位點(diǎn)(M歉CS墨)和來源利于pB徐R3瞇22質(zhì)粒呆的復(fù)澡制起奔始點(diǎn)（3）大環(huán)腸桿我菌β-半乳咬糖苷秩酶(l委ac夏Z)的啟及動(dòng)子挑及其章編碼跡該基穴因氨煙基端α-肽鏈毛的DN司A序列,此結(jié)辰構(gòu)特乏稱為la非cZ河+基因攔，便于花藍(lán)白糠篩選pU霸C質(zhì)粒觸優(yōu)點(diǎn)昆：１．直具有矮更小挨的分儉子，斧更高范的拷豈數(shù)２．右適于范組織壩化學(xué)蜜檢測(cè)灣重組湖體．[C案]、pG簽EM耕-3匯Z質(zhì)粒含一龜個(gè)am課pR基因抽和一頭個(gè)la斷cZ’編碼線基因;有多抖克隆耗位點(diǎn)染（MC跪S）;正選枝擇顏沿色標(biāo)漁記la需cZ’;有兩煉個(gè)來娃自噬袍菌體氏的強(qiáng)新啟動(dòng)片子PT7和PSP翁6,用于翁外源田基因告的高館效表猴達(dá)注意食：T7和SP拿6啟動(dòng)禮子特辟異性更地由巡壽噬菌辟體DN音A編碼架的RN蝕A聚合技酶所留識(shí)別搶，因倦此相這應(yīng)的裙受體導(dǎo)菌必堆須表每達(dá)噬坦菌體RN封A聚合把酶，如：E.童co凱liBL視21（DE躲3）等27北43禿b塵pMC伐Sla下cZ燒’PT7or德iAprpG異EM區(qū)-3屋ZPSP獎(jiǎng)62、真音核基別因病乞毒DN寶A（1）病熟毒載荒體的跳優(yōu)點(diǎn)（2）已夾經(jīng)研獵究的逗真核有基因盤病毒DN組A（1）病崗毒載皮體的啟優(yōu)點(diǎn)[A愚]、具恐有很嘉高的漁拷貝爸?jǐn)?shù)量嚷。[B蔬]、有賞強(qiáng)大給的啟皺動(dòng)子愿。[C喊]、可逢保證器目的驚基因蹤蝶的高赴效表蹈達(dá)。（2）已行經(jīng)研勻究的帥真核沉基因欠病毒DN趨A[A氧]、SV綁40病毒DN滑A[B昌]、牛智乳頭土瘤病賣毒[C女]、RN疤A病毒[D擴(kuò)]、昆備蟲桿些狀病展毒[E刻]、人雅痘病便毒DN池A[F編]、猴空錢泡病甘毒DN烏A[G愿]、人腺闖病毒DN溫A[H涉]、人牛頓痘病勺毒DN跳A[瀉I屑]、逆轉(zhuǎn)嘴錄病析毒載箏體[A顏]、SV販40病毒DN聲A（A1）、SV吐40病毒DN樹A的特清性（A2）、SV瞧40病毒DN滔A的基傭因組（A3）、SV很40病毒DN士A載體鍋的構(gòu)喝建（A4）、SV禾40病毒DN透A載體谷的使愚用方牛法（A1）、SV資40病毒DN徹A的特河性為環(huán)狀丈雙螺棉旋結(jié)構(gòu)蹦。其叉宿主雁為動(dòng)棕物細(xì)厭胞。SV臺(tái)40病毒洪有二熊種表渣達(dá)方鉤式：某（1）游躺離表懲達(dá)方壘式，SV琴40肌DN銷A+外源守性DN靠A，形脹成重河組DN傳A，進(jìn)樂入宿魄主體柳內(nèi)，參以重留組DN秤A的方撲式表摔達(dá)。碧（2）結(jié)業(yè)合表疤達(dá)方鳥式，綁重組DN液A整合到宿椅主染指色體暑的DN魔A之中藏，與雅染色歡體基競(jìng)因一著起表口達(dá)。（A2）、SV夕40病毒DN時(shí)A的基篇因組（A3）、SV輛40病毒DN貸A載體甲的構(gòu)比建（A4）、SV爽40病毒DN歲A載體輝的使曬用方蕉法[G探]、腺倒病毒（G1湊）、腺病風(fēng)毒DN刑A載體（G2撤）、腺病丈毒DN堪A載體揭的特輪點(diǎn)3、λ噬菌姿體DN惱A（1）λ噬菌艱體DN膏A的特騙性（2）λ噬菌幅體DN逆A的改朝造（3）λ噬菌蹦體DN藏A的體湯外包畝裝（4）λ噬菌卵體載鈴體的丈構(gòu)建（5）λ噬菌嘗體載獸體的廣使用（6）λ噬菌便體載崇體的吧優(yōu)點(diǎn)（1）λ噬菌恢體DN界A的特停性λ噬菌俯體DN悉A為雙鏈魄的DN香A病毒，宿方主是投大腸寺桿菌甩。已發(fā)似現(xiàn)λ噬菌照體DN智A可編紅碼61個(gè)基叢因。[A屑]、λ噬菌鉛體DN肅A在宿課主體賠內(nèi)的鄉(xiāng)豐生活繳方式[B偽]、λ噬菌岔體DN熔A的結(jié)習(xí)構(gòu)[A還]、λ噬菌告體DN悼A在宿欲主體抓內(nèi)的覆生活拿方式（1）溶解源方菌式：λ噬菌臂體DN謊A整合膛到大宣腸桿算菌的DN裹A中，懲伴隨核大腸喂桿菌DN事A的復(fù)莖制而笛復(fù)制序，這錦種方項(xiàng)式是λ噬菌項(xiàng)體DN爸A作為堪基因碧工程有載體熄的理吸論依口據(jù)。（2）溶鉤菌方乳式：λ噬菌橫體感刻染大由腸桿譽(yù)菌后窮，終肥止了士大腸消桿菌溫染色敏體DN砍A所控拾制的覺遺傳頓信息寸表達(dá)泄，并思進(jìn)一園步分繡解大翠腸桿恐菌DN柴A，最刪后導(dǎo)揀致大莖腸桿語菌完士全溶善解。[B繩]、λ噬菌歉體DN佳A的結(jié)蠻構(gòu)λ噬菌敞體基錦因組基因規(guī)組長還度：耀約為50精kb的雙籮鏈DN總A分子隊(duì)，實(shí)兇際大額小為48絮50意2b暗p。DN騾A是線物狀雙鞏鏈分然子帶蘿有單粱鏈的尾互補(bǔ)撈末端愧，末帖端長12個(gè)核才苷酸切，稱嚷為粘賊性末根端（co炮s序列）。搏當(dāng)噬壟菌體廳感染無宿主凱細(xì)胞奴后，粉雙鏈DN斯A分子型通過co藝s而成被環(huán)狀愚。61個(gè)基嗎因，夾每個(gè)娘基因尸平均弱為10逼00記bp，其輝中32個(gè)較振為重涉要，羽它們衛(wèi)的分芬布和吧排列厚與其樸功能鴉有一噸定關(guān)想系?；驈椊M分期為二需部分均：棟（1）其休中一竿半基機(jī)因，濱控制蠟著生織命活劍動(dòng)周信期。紙（2）另籍一半侵基因井，可冶被外仿源性孫目的娘基因伴所取烤代，而不御影響酬噬菌今體的劇生命竄活動(dòng)蛋。基因往組分灣為幾蒸個(gè)不摧連續(xù)館的區(qū)恰域，撿三個(gè)聾片段羅組成帖：（1）左抗臂，19爭.6榜kb，含尖噬菌潑體頭融、尾思蛋白蘋質(zhì)編堵碼基必因，A～J的12基因晝都是勢(shì)構(gòu)成尊外殼督蛋白能的基瓶因。（2）中墓央片長段，12甚kb～24婦kb，含PL控制re姿d和ga猴m基因傻。（3）右胡臂，9k池b～11顆kb，含λD友NA復(fù)制司和溶剛菌有霜關(guān)蛋善白編買碼基羅因。您與裂牲解有全關(guān)的S和R基因局、與DN緞A復(fù)制移有關(guān)較的O基因稼和P基因套等分嶺別聚獸集在貪一起挎。噬菌懲體左濫右兩禁臂包催含了λ復(fù)制鐮和成烤熟所贈(zèng)必須諒的全且部機(jī)乳能蛋廟白編況碼，回而中央字片段丸為非進(jìn)必需謎區(qū)，即弓位于J基因永和N基因拿之間度的片腦段可滿被其判他大皇腸桿催菌DN責(zé)A片段彎所替析換。λ噬菌廢體基娃因組非必北需區(qū)（2）λ噬菌清體DN秀A的改銳造野生探型λ噬菌雀體DN瞧A分子茅較大寒，其蚊結(jié)構(gòu)紡基因隱也很圈復(fù)雜長，并肉且常笑常容狀納不礙下分連子量朽更大邪的外辭源性術(shù)目的雙基因DN寶A片段國。需善要對(duì)半其進(jìn)偉行改水造。改造掘方法熟：（1）遺傳靈學(xué)方窮法--狀--撲--轉(zhuǎn)-將λ噬菌傭體DN殼A交替少地在安不含殼質(zhì)粒倆的大稀腸桿仔菌、夸和含蹈質(zhì)粒竭的大桃腸桿卸菌的州宿主貌內(nèi)生偽長，傘來刪繞去其舟過多買的限躬制酶葛位點(diǎn)子。（2）體外鑼刪除丹法--獸--粒--耍-將λ噬菌衰體DN筍A在體暢外進(jìn)乘行限岔制酶檔消化患，再吐將未融被切控割部它分經(jīng)慎過蛋眾白質(zhì)乘包裝脊后，登去感葡染大鄉(xiāng)豐腸桿咬菌。治經(jīng)過器幾代箭連續(xù)訓(xùn)培養(yǎng)熄之后恥，λ噬菌少體DN晶A就會(huì)躁失去坐不需屢要的遺限制室酶位伐點(diǎn)。（3）λ噬菌封體DN避A的體伯外包優(yōu)裝[A貓]、體逝外包塑裝的勸作用[B可]、λ噬菌妥體DN雪A包裝購的原臺(tái)理[C房誠]、λ噬菌倘體DN矮A的包青裝過屈程[A映]、體藥外包嶺裝的域作用λ噬菌岡體DN嫂A連接仆上外壁源性被目的余基因腎，就朵成為鮮重組DN還A分子回，但趨是，敬重組扭之后扁的DN助A分子寧必須穴經(jīng)過包裝，加亡上蛋白印質(zhì)外損殼形成蹲完整漏的病弟毒顆犁粒，朗才具娘有感染宿主兆的能般力。[B少]、λ噬菌脆體DN浮A包裝雅的原旱理λ噬菌圍體DN西A的頭部四蛋白+重組DN覆A分子+λ噬菌大體DN項(xiàng)A尾部西蛋白，在包適當(dāng)質(zhì)條件繭下混亮合，毛就能她夠自蜘動(dòng)地收包裝襖成完會(huì)整的λ噬菌擊體病卵毒顆支粒。（4）λ噬菌旨體載側(cè)體的懶構(gòu)建（A）縮短籌長度（B）改造片酶切棍位點(diǎn)（C）增加濃選擇俊標(biāo)記（A）縮短臭長度插入鉆型載卸體：①失去旱了非徐必需魄區(qū)②僅腔保留仇了Ec腹oR株Ⅰ的單剖一切箱點(diǎn)③切遠(yuǎn)點(diǎn)又永位于止報(bào)告競(jìng)基因稍上，悅故在柿切開DN況A并插司入外沈源基膀因后槳，報(bào)竟告基詠因失炭活，冰即可的依此機(jī)進(jìn)行征重組慢體的豬篩選④可朵插入歪長度期為10在kb的外使源DN沾A只含枯一個(gè)伐限制曠性位按點(diǎn)可全供插造入外禍源DN亦A的載題體，形這類λ噬菌否體載那體稱插概入型勿載體。注意顆：λ噬菌貨載體搜作為訂載體勿，其奴重組膽噬菌世體DN洋A大小址只能憤：37敗kb姜~跪5次1k踢b。λ噬菌鍋體載得體是動(dòng)主要守用于cD心NA文庫唱構(gòu)建如，也算經(jīng)常牲用于塑外源研目的術(shù)基因補(bǔ)的克估隆。置換型載邁體置換徐型載那體：捐可被思外源DN文A置換饒的λ噬菌裁體非晌必需閥區(qū)兩毯側(cè)有販一對(duì)遭限制朝性酶炮切位霧點(diǎn)的坑載體瘡，稱陪為置腹換型句載體腹。適用艱基因炮組克加隆特殊沉性質(zhì)煙：中間吼區(qū)域訓(xùn)約長18譽(yù)kb，這默一段DN健A可以嘉被外京源置監(jiān)換而銅不會(huì)熔影響λp偉ha煉ge裂解外生長瞇的能感力。包裝痕限制肥：λp芳ha胸ge頭部清外殼笑蛋白楊容納DN陷A能力宇上限≤10點(diǎn)5%，下亞限≥75級(jí)%。包進(jìn)裝范統(tǒng)圍[5儲(chǔ)1k顧b,崇3萄6k別b]救.只有λD永NA的長良度大母于野辭生型λph碎ag晴e部DN群A長度嫩的75％而映不超畏過其10錯(cuò)5％時(shí)每，才籌能被散包裝輸成ph助ag斑e顆粒贊，當(dāng)DN談A的長旬度短晃于野繼生型斯的75倦%或超縫過10嘴5%時(shí)，ph百ag鋸e活性煩就急亮劇下弓降，故要助求λ載體DN啄A和外瓣源DN涼A長度商之和衛(wèi)在36～51悼kb之間御。λ載體位必要查區(qū)是28懷kb挑,理論繩上克訓(xùn)隆能鑒力為23漏kb碗.（B）改造橡酶切暖位點(diǎn)野生稼型的λ-吼DN曬A鏈上嚇有5個(gè)Ec加oR爐I位點(diǎn)具和7個(gè)Hi唉nd晝II輕I位點(diǎn)燦，不搬利于衣重組搬操作逆，必牧須刪沖除至1薯-隨2個(gè)。為了弓便于舅各種給來源兵的DN據(jù)A片段多的克余隆，已還需競(jìng)要增卡加一全些單潤一的濾酶切樂位點(diǎn)左。（C）增加類選擇伯標(biāo)記加裝本選擇只標(biāo)記la員cZ（5）λ噬菌己體載基體的跨使用重組λDN睜A的構(gòu)建(酶切塘，連溪接）λ噬菌醋體的體外艙包裝λ噬菌肝體侵染大腸氏桿菌重組λDN喝A的分離（6）λ噬菌聲體載科體的曾優(yōu)點(diǎn)容量駛大，裝略載能吉力可轉(zhuǎn)達(dá)23誓kb，便欲于構(gòu)禁建基擁因文涂庫重組銅子篩閉選較霧為方在便DN軋A提取嬸操作紅較為比簡便4：單過鏈DN另A噬菌供體M1賄3載體M1晌3噬菌磚體（M1存3擇ph腔ag撿e）是晌一種膏大腸習(xí)桿菌或雄性掘特異甲絲狀辮噬菌砌體，遺傳毒物質(zhì)豎是環(huán)昨狀單挎鏈DN才A,全長堅(jiān)約6.堂5k蜻b。宿主龍是絲狀朵大腸佩桿菌。它柳是單做鏈DN怎A噬菌撿體中類的一全個(gè)典包型的盛代表寫。M1民3感染絡(luò)細(xì)菌洋后，甚經(jīng)過稠復(fù)制辣轉(zhuǎn)變希為雙禮鏈的上復(fù)制帥型（RF）。灶復(fù)制柱型M1威3可用糠作克更隆載智體。噬菌侍體M1喂3感染引宿主挨之后側(cè)，在疲含有蛇異丙勿基硫嫁代半窯乳糖今苷（IP艇TG）的X-留ga拔l培養(yǎng)朵基中懂生長環(huán)時(shí)，熄會(huì)形盛成藍(lán)京色噬派斑。木通過揮藍(lán)色迅噬斑闊的出伏現(xiàn)可妖以顯眉示噬濕菌體M1渴3的存破在。感染怒宿主協(xié)之后悔，噬折菌體M1烈3所釋文放的公單鏈DN伍A可用蹦于制倘作放射飼性標(biāo)剝記探瘡針，用說來檢旋測(cè)RN故A的結(jié)攝構(gòu)。M1愿3噬菌漆體的告組成胡和結(jié)努構(gòu)M1檔3噬菌秤體顆廊粒是配絲狀匠的，示只感榴染雄軋性大碰腸桿挎菌。田感染近宿主涂后不舞裂解誤宿主悟細(xì)胞憤，而哈是從罰感染示的細(xì)紙胞中月分泌壁出噬惜菌體扒顆粒僵，宿卸主細(xì)吹胞仍最能繼既續(xù)生灰長和賓分裂檔。M1騙3噬菌揭體的輔外型督呈絲天狀M1痕3噬菌勝體由散外殼翼包裝趙蛋白館和正丟鏈DN肢A組成M1肆3餅DN護(hù)A全長64拖07個(gè)核佳苷酸M1怒3棋DN兄A上至業(yè)少有11個(gè)基騙因27住00個(gè)外儉殼蛋話白分領(lǐng)子M1勾3噬菌瀉體不租裂解駕宿主訓(xùn)細(xì)胞皮，但待抑制怖其生玻長M1逮3噬菌贏體的蠢組成億和結(jié)發(fā)構(gòu)單鏈DN灶A(yù)，由64鏟07堿基悠組成揮。90昨%以上膏的序認(rèn)列可糕編碼敲蛋白讓質(zhì)，傳共有11個(gè)編危碼基暗因基因宰間的殃間隔區(qū)區(qū)多蚊為幾好個(gè)堿擊基。較大君的間兔隔位于價(jià)基因Ⅷ/爐Ⅲ以及冶基因Ⅱ/所Ⅳ之間義，其葛間有呢調(diào)節(jié)仔基因壤表達(dá)慨和DN勝A合成鞋的元賭件。M1巡壽3噬菌爆體的賽基因削組M1農(nóng)3噬菌仁體的桶基因饅組編碼3類蛋杠白質(zhì)打：①復(fù)制憤蛋白攜（基蜜因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ）②形態(tài)桐發(fā)生掠蛋白芬（基辜因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ）③結(jié)構(gòu)添蛋白昏（基鄙因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）M1帶3噬菌藏體載授體的叉構(gòu)建M1突3噬菌估體作公為載齒體的泡重要它特點(diǎn)：①M(fèi)1粱3噬菌梁體的蘇感染扁與釋善放不挽會(huì)殺粘死宿呼主菌握，僅碗導(dǎo)致椅宿主擱菌生捎長緩熄慢；②M1拳3噬菌舉體DN旁A在宿練主菌糟內(nèi)既欠可以逮是單猾鏈也晴可以旬是雙船鏈，通過慢感染賺或轉(zhuǎn)腦化的艱方法賤能將M1籌3噬菌鉛體DN濟(jì)A導(dǎo)人話宿主撥菌中；③M1貞3噬菌具體的左包裝領(lǐng)不受DN舒A大小略的限戒制，其她噬菌美體顆故粒的懇大小均可隨DN員A的大拜小而閃改變碎，即粱使DN清A的大徹小比病本身DN鎖A的大幅小超現(xiàn)出6倍，雁仍能笑進(jìn)行喚包裝稠。⑤M1撈3噬菌閑體在詢用作夜載體詳時(shí)是利用享其雙退鏈狀鳥態(tài)的RF別D題NA：單鏈DN英A的酶廚切和瀉連接夕是比分較困罵難的勾。⑥外源練片段術(shù)插入鐮位點(diǎn)會(huì)在基因Ⅱ和基兇因Ⅳ之間趟的50攀8b餡p間隔丸區(qū)--德--M1映3不像λ噬菌豪體基困因組辯那樣羅含有溜較大次的可里替代憶區(qū)。湯它的漫基因手組中鍬絕大夏多數(shù)到為必挽需基傘因，筒只有驅(qū)兩個(gè)凝間隔婚區(qū)可買用來侵插入兵外源DN影A（基因Ⅱ/扔Ⅳ和基窮因Ⅷ/纏Ⅲ之間）。5：人晉工質(zhì)濕粒載托體--科斯戲質(zhì)粒19埋78年Co坊ll的in造s和Ho創(chuàng)hn構(gòu)建筐一種倍新型猛的大袍腸桿五菌克歌隆載狹體，鈔命名鑰為co汁sm刑id亭(柯斯喇質(zhì)粒)，又而叫粘粒?？滤垢褓|(zhì)粒判（co貪sm蛾id）=殘co額s序列+質(zhì)粒悼。實(shí)際濟(jì)是質(zhì)否粒的陰衍生吊物，宿它是份用正黃常的載質(zhì)粒鴿同λ噬菌緞體的co曠s位點(diǎn)香構(gòu)成妻。[A莖]、科偶斯質(zhì)拒粒的棄基本陣組成[B負(fù)]、科邀斯質(zhì)賽粒的翼特性[C冷]、科聰斯質(zhì)暈粒的躬用途Co服s質(zhì)粒凍（考艱斯質(zhì)瓣粒Co妄sm蹦id）[A膏]、科揉斯質(zhì)雙粒的厚基本怎組成（1）含納有λ噬菌賓體DN更A的粘筍性末陶端序姑列（CO波S序列摟）。（2）含塊有質(zhì)突粒的遠(yuǎn)一個(gè)態(tài)復(fù)制可起始雙區(qū)。（3）含帖有質(zhì)惠粒的耍一個(gè)眉抗藥紀(jì)性標(biāo)蘆記。（4）具紋有多參種限踩制性盡內(nèi)切諒酶的嘉單一渣性切候點(diǎn)?？滤沽奄|(zhì)粒pH蔑C7窗9系由質(zhì)湊粒pB孩R3爪22和λ噬菌滴體的co闖s位點(diǎn)辰的一杠段DN構(gòu)A構(gòu)成付。包裝色時(shí)，co笑s位點(diǎn)址打開券而產(chǎn)咸生λ噬菌農(nóng)體的票粘性達(dá)末端含。由目于pH搖C7霉9有pB奶R3蘋22羊DN簡A，所澇以也攔就有剪氨芐料青霉五素抗夜性和救四環(huán)用素抗貫性兩湯個(gè)標(biāo)秋記。凡具盼有co額s位點(diǎn)佛的任軍何DN頑A分子過只要浮在長祖度相腔當(dāng)于夫噬菌偶體基磁因組巾，就歡可以緒同外陳殼蛋發(fā)白結(jié)獨(dú)合而托被包晌裝成澇類似λ