動物體外受精技術(shù)

動物體外受精技術(shù)第一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五目錄第一節(jié)體外受精技術(shù)概述第二節(jié)卵母細(xì)胞的體外成熟第三節(jié)體外受精方法第二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五試管嬰兒1978年7月26日，世界首例試管嬰兒“路易斯．布朗”在英國誕生，現(xiàn)已成為母親。轉(zhuǎn)基因試管牛我國首例轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀庇?999年2月19日在上海誕生第三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五1988年3月10日我國首例試管嬰兒第四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五根據(jù)資料回答下列問題：1.資料上用到了什么生物技術(shù)？

試管嬰兒技術(shù)（包括體外受精、早期胚胎培養(yǎng)）和胚胎移植技術(shù)。2.試管嬰兒和母親正常懷孕，生產(chǎn)的過程有何異同？相同之處：都通過有性生殖產(chǎn)生，在母體子宮內(nèi)發(fā)育形成胎兒。不同之處：受精作用在體外，并在體外發(fā)育成早期胚胎進(jìn)行胚胎移植。第五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)體外受精技術(shù)概述從狹義上講，體外受精是指將動物受精過程中的精卵結(jié)合在體外環(huán)境下完成的一種現(xiàn)象，包括自然條件下的體外受精和人為培養(yǎng)條件下的體外受精。通常所指的體外受精技術(shù)，即為將哺乳動物的精子和卵子置于體外適宜的培養(yǎng)條件下使之完成受精的一種技術(shù)。在生物學(xué)中，把體外受精胚胎移植到母體后獲得的動物稱試管動物(test-tubeanimal)從廣義上講，體外受精又包含卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)和受精卵的體外培養(yǎng)兩項密切相關(guān)的技術(shù)。一、體外受精技術(shù)的概念第六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五一、基本原理：人工模擬體內(nèi)環(huán)境（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），使初級卵母細(xì)胞成熟，同時使精子獲能，最終完成受精作用，并有計劃地保存胚胎。第七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五第八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五二、體外受精技術(shù)的發(fā)展概況哺乳動物體外受精的研究已有120多年的歷史。1878年，德國科學(xué)家Schenk首先開始哺乳動物體外受精的嘗試。1944年，Pock和Menkin進(jìn)行了人卵的體外受精研究。精子獲能現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，是哺乳動物體外受精發(fā)展史上的里程碑。1959年，美籍華人張明覺獲得了世界上第一批體外受精的試管小兔。此時，體外受精技術(shù)才真正得到承認(rèn)并為人們所接受。先后在近20余種動物進(jìn)行了體外受精的研究，有10余種動物獲得了體外受精的試管動物。目前，一套高效的牛胚胎體外生產(chǎn)程序已建立起來。第九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五我國體外受精技術(shù)的研究起步于80年代后期，但進(jìn)展很快，已先后在人和牛等8種動物取得成功。目前，人和牛的體外受精技術(shù)已達(dá)到國際先進(jìn)水平，每年約有近千例試管嬰兒誕生，數(shù)百頭試管牛出生。1990年我國錢菊芬獲得首例試管山羊旭日干、范必勤等獲得試管牛犢第十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五三、體外受精的意義體外受精技術(shù)對動物生殖機(jī)理研究、畜牧生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)和瀕危動物保護(hù)等具有重要意義；在家畜品種改良中，體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價而高效的手段，對充分利用優(yōu)良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度等有重要價值；是哺乳動物胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成部分；第十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五四、體外受精技術(shù)環(huán)節(jié)卵母細(xì)胞的獲得和體外成熟精子的體外獲能成熟卵母細(xì)胞與獲能精子的體外受精受精卵的體外培養(yǎng)受精卵的移植第十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五五、體外受精技術(shù)的應(yīng)用范圍（一）、基礎(chǔ)研究

1.再現(xiàn)體內(nèi)受精過程2.研究珍稀動物的早期胚胎發(fā)育3.研究細(xì)胞膜融合現(xiàn)象和機(jī)理第十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（二）、應(yīng)用研究

1.治療人類不孕癥2.為胚胎移植產(chǎn)業(yè)開辟大量胚胎來源3.家畜品種改良4.保種5.其他用途第十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)卵母細(xì)胞的獲得與體外成熟一、卵母細(xì)胞的采集方法獲得足夠數(shù)量的卵母細(xì)胞是生產(chǎn)試管動物的前提。1.卵母細(xì)胞的離體采集（1）卵泡抽吸法：用注射器套上12~16號針頭穿刺卵泡而將卵母細(xì)胞抽吸出來。注射器保持一定負(fù)壓，針頭從卵泡側(cè)面刺入，一次進(jìn)針抽吸卵巢皮質(zhì)多個卵泡，避免污染。優(yōu)缺點(diǎn)：回收速度快，不易造成污染；容易損傷卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞第十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（2）卵泡剝離法：用無菌眼科剪刀或刀片，自卵泡周圍，將周圍組織分離，取下完整的圓形卵泡，放到加油培養(yǎng)液的平皿中，切開卵泡，卵泡液帶著卵母細(xì)胞流出。優(yōu)缺點(diǎn)：程序較為復(fù)雜，但是對卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的損傷小。（3）切剖法：用平行排列成組的剃須刀片縱橫切割卵巢，回收液體放在撿胚皿中，37度培養(yǎng)箱靜止10min，用注射器吸取上清，鏡檢卵母細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：回收效率較高。第十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（4）卵巢解剖法：用手術(shù)刀片將卵巢切為兩半，去掉中間髓質(zhì)部分，露出卵泡，然后用刀片劃破卵泡，在培養(yǎng)液中反復(fù)沖洗，采集其中的卵母細(xì)胞。優(yōu)缺點(diǎn)：回收速度相對較慢，容易造成污染；能保持卵母細(xì)胞周圍卵泡細(xì)胞的完整性，回收率相對比較高。第十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五2.卵母細(xì)胞的活體采集（1）腹腔鏡法：在腹壁切開一個小口，插入腹腔鏡、操作桿和穿刺針，通過操作桿和穿刺針的配合將卵母細(xì)胞吸出。優(yōu)缺點(diǎn)：比較直觀，容易掌握；工作量大，對母牛的損傷較大，不能頻繁手術(shù)。（2）B超超聲波法：將供體母畜牢牢固定在保定架內(nèi)，普魯卡因麻醉，將帶有超聲波探頭和采卵針的采卵器插入到陰道子宮頸一側(cè)穹窿處。而后術(shù)者通過直腸將卵巢貼在探頭上，根據(jù)B超屏幕上顯示的卵泡位置進(jìn)行穿刺，而將卵母細(xì)胞取出。優(yōu)缺點(diǎn)：不用進(jìn)行手術(shù)，操作速度較快，對母牛損傷小，可頻繁反復(fù)采卵，也可對妊娠母牛進(jìn)行采卵；操作技術(shù)較難掌握，并需要昂貴的超聲設(shè)備。第十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五牛卵巢牛卵巢中采卵第十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五B超活采儀第二十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五第二十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五活體采集的牛卵母細(xì)胞第二十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五合格卵母細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)：放射冠細(xì)胞擴(kuò)散良好，質(zhì)地均一，放射冠細(xì)胞間透明；透明帶清晰；卵母細(xì)胞圓形，直徑大小適中，細(xì)胞質(zhì)質(zhì)地均勻，色澤柔和，透明度適中。2、體外成熟的卵母細(xì)胞1）卵母細(xì)胞來源（1）卵巢來源：從屠宰場宰殺的母畜獲得卵巢，38°C生理鹽水中保溫，宰殺后2小時內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗室。圖－1成熟卵母細(xì)胞圖二、卵母細(xì)胞的分類第二十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（2）采集卵母細(xì)胞－卵丘細(xì)胞復(fù)合物：用38℃生理鹽水洗滌卵巢2次，左手持卵巢，右手持注射器，如圖所示，抽取3－5mm卵泡的卵泡液及卵母細(xì)胞－卵丘細(xì)胞復(fù)合物，置于20ml試管內(nèi)，靜置待檢。

選擇3~5mm卵泡的原因是：更大卵泡的閉鎖比例可能較高，更小卵泡的發(fā)育程度可能低。第二十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五鏡檢卵母細(xì)胞－卵丘復(fù)合物：用吸管吸取經(jīng)靜置后試管底部的混合物于平皿中，用吸管鋪平，在實(shí)體顯微鏡下用吸管檢出卵母細(xì)胞－卵丘復(fù)合物，置于另一平皿中，用洗滌液在實(shí)體顯微鏡下洗滌2次，在洗滌過程中要剔除不合格的卵母細(xì)胞－卵丘復(fù)合物。選擇合格的卵母細(xì)胞－卵丘復(fù)合物非常重要，否則將降低卵母細(xì)胞的成熟比例。第二十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五卵母細(xì)胞－卵丘復(fù)合物分類標(biāo)準(zhǔn)a、分類依據(jù)：卵母細(xì)胞的直徑、形狀、質(zhì)地的均勻度、色澤；透明帶的完整性；卵丘細(xì)胞圍繞卵母細(xì)胞的完整性、數(shù)量、擴(kuò)散程度、色澤。一般分為4級，1、2級為合格；3、4級為不合格。第二十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五一級：卵母細(xì)胞：直徑120μm，圓形，質(zhì)地均勻。卵丘細(xì)胞：包圍卵母細(xì)胞數(shù)層、緊密、完整，質(zhì)地均勻。二級：卵母細(xì)胞：直徑120μm，圓形，質(zhì)地均勻。卵丘細(xì)胞：包圍卵母細(xì)胞數(shù)層、緊密，但不完整，質(zhì)地均勻。三級：卵母細(xì)胞：直徑太大或太小，橢圓形，質(zhì)地均勻。卵丘細(xì)胞：包圍卵母細(xì)胞單層或無、不緊密、不完整，質(zhì)地均勻。四級：卵母細(xì)胞：直徑太大或太小，橢圓形，質(zhì)地不均勻。卵丘細(xì)胞：包圍卵母細(xì)胞單層或無、不緊密、不完整，質(zhì)地不均勻。第二十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五退化的卵母細(xì)胞可用卵母細(xì)胞第二十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五三、卵母細(xì)胞的體外成熟未成熟的卵母細(xì)胞的核在細(xì)胞中央，成熟過程中遷移到動物極質(zhì)膜下，核變得膨大，改稱發(fā)生泡，接著進(jìn)行第一次成熟分裂，減數(shù)分裂的完成標(biāo)志著卵母細(xì)胞核的成熟（1）細(xì)胞核成熟第二十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（2）細(xì)胞質(zhì)的成熟顯著的蛋白質(zhì)合成發(fā)生在生發(fā)泡破裂前后，這些新合成的蛋白質(zhì)不僅與卵細(xì)胞自身成熟有關(guān)（激活成熟促進(jìn)因子），而且與卵母細(xì)胞輸精后的發(fā)育能力直接有關(guān)，所以細(xì)胞質(zhì)成熟的質(zhì)量如何直接影響到早期胚胎的發(fā)育能力胞質(zhì)成熟主要表現(xiàn)為細(xì)胞器變化和紡錘體的形成卵母細(xì)胞成熟后期細(xì)胞器完成重新組裝，如高爾基體消失，線粒體分布核的周圍，胞質(zhì)內(nèi)有PAS陽性的囊膜和脂滴第三十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（3）細(xì)胞膜和透明帶的成熟細(xì)胞膜穩(wěn)定性發(fā)生改變，膜微絨毛發(fā)生重排，表現(xiàn)密集而有彎曲，并從透明帶內(nèi)退出或斷裂透明帶外層呈網(wǎng)狀，變軟第三十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五三、卵母細(xì)胞的體外成熟方法1.成熟培養(yǎng)液的選擇

用于卵母細(xì)胞體外成熟的基礎(chǔ)培養(yǎng)液有TCM199、Ham’sF-10等，添加胎犢血清（FCS）和犢牛血清（NCS）比添加牛血清蛋白（BSA）效果較高?？商砑觝CG和PMSG，促進(jìn)卵母細(xì)胞的體外成熟。2.成熟培養(yǎng)的時間對于大多數(shù)家畜來說，卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)時間一般采用22～24h，但豬的卵母細(xì)胞多采用40～44h，馬的卵母細(xì)胞多采用30～36h。兔僅需12～15h。第三十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五3.成熟培養(yǎng)的溫度和氣相環(huán)境（1）溫度牛、豬、羊、馬的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)溫度均采用38～39℃。（2）氣相環(huán)境一般都采用5％CO2，來維持培養(yǎng)液的酸堿度；第三十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五4.成熟培養(yǎng)系統(tǒng)（1）開放培養(yǎng)系統(tǒng)體積：將1～2ml成熟培養(yǎng)液置于平皿或五孔培養(yǎng)板中，然后放入50～200枚卵母細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：簡單；同時培養(yǎng)大量的卵母細(xì)胞；培養(yǎng)結(jié)果不受石蠟油質(zhì)量的影響缺點(diǎn)：滲透壓的變化較大；容易污染第三十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（2）微滴培養(yǎng)系統(tǒng)體積：將成熟培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿中做成50～500μl的微滴

，覆石蠟油。優(yōu)點(diǎn)：滲透壓比較穩(wěn)定；不易污染缺點(diǎn)：對培養(yǎng)液中的脂溶性物質(zhì)有稀釋作用；成本較高；培養(yǎng)結(jié)果易受石蠟油質(zhì)量的影響，目前很少用。第三十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（3）密閉培養(yǎng)系統(tǒng)體積：將卵母細(xì)胞置于1～2ml成熟培養(yǎng)液的試管中，加蓋膠塞。優(yōu)點(diǎn)：不需要CO2培養(yǎng)箱，可用恒溫水??；方便運(yùn)輸缺點(diǎn)：pH值不如前者穩(wěn)定適合需要再卵母細(xì)胞的運(yùn)輸途中進(jìn)行成熟時應(yīng)用。第三十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)：CO2培養(yǎng)箱第三十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)：CO2培養(yǎng)箱第三十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五三、卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量的評定1.形態(tài)觀察法：主要通過顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞的形態(tài)來判斷是否成熟。2.固定染色法：將卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞用0.1%的透明質(zhì)酸酶去掉，然后在醋酸酒精的固定液中固定24~28h，最后用含1%間苯二酚蘭染色觀察。分為7個階段：（1）生發(fā)泡期（GV期）卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中可見到一個大而圓的細(xì)胞核（俗稱生發(fā)泡），核膜清晰，界限明顯。生發(fā)泡：生長期的卵母細(xì)胞核內(nèi)核仁增大增多、合成活躍，細(xì)胞核膨大，稱為生發(fā)泡。第三十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（2）生發(fā)泡破裂期（GVBD）

核膜變得模糊，核膜的一側(cè)出現(xiàn)缺口，染色質(zhì)隱約可見。(3)終變期（DK期）染色質(zhì)變短、變粗，隨即分布在細(xì)胞核區(qū)。（4）中期Ι(MI期)染色體成對排列在赤道板上，并可隱約見到紡錘體。（5）后期Ι（AnaI期）同源染色體開始分開，但兩組染色體分開的距離不大。第四十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（6）末期Ι(TelI期)同源染色體分開的距離加大，形成極體的一組染色體向質(zhì)膜靠近，但此時極體尚未排出。(7)中期Ⅱ(MⅡ期)卵周隙中可見到極體，與相鄰的胞質(zhì)中可見到整齊排列的染色體。與MΙ期的染色體相比，MⅡ期的染色體小而致密。第四十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五3.受精和胚胎發(fā)育潛能的評定：是評定卵母細(xì)胞體外成熟方法最為重要的一項指標(biāo)。體外受精后的受精卵（分）裂率體外培養(yǎng)的胚胎發(fā)育率第四十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五可用卵母細(xì)胞成熟卵母細(xì)胞第四十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)體外受精的方法1.配子的來源（1）卵子輸卵管卵卵泡卵（2）精子體內(nèi)獲能的精子體外獲能的精子第四十四頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五2.精子制備的方法：（1）懸浮法：是根據(jù)精子運(yùn)動上游的特性而將高活力的精子與死精子以及其他精漿成分分開。將精液置于含有1~1.5ml獲能液或受精液的試管底部，在培養(yǎng)箱中孵育10~30min，吸取上層液體，然后離心洗滌1~2次，即可獲得高活力的潔凈精子。優(yōu)缺點(diǎn)：適用于精子活力較差的精液，但是精子的可利用率則大大降低。（2）玻璃棉過濾：采用玻璃柱層過濾分離，可有效的出去品質(zhì)較差精液中的死精子。優(yōu)缺點(diǎn)：制備時間較短，但是器材來源和成本較高，未廣泛應(yīng)用。第四十五頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（3）哌可密度梯度離心：根據(jù)形態(tài)正常的精子密度高于異常，經(jīng)平衡離心后，形態(tài)正常的精子將聚集于高密度的哌可區(qū)域，從而分離得到高收精力的正常精子。常用哌可密度梯度為30%和45%，平衡離心10min(300g)。優(yōu)缺點(diǎn)：可分離高質(zhì)量的精子，且精子的利用率較高，但是精子體外受精結(jié)果受哌可質(zhì)量的影響（4）離心洗滌法：取0.1~0.2ml的精液置于離心管中，然后加入5~10ml的獲能液或受精液，離心5min(300g)，去掉上清液后，再加入5~10ml的獲能液或受精液離心洗滌一次，即可用于受精優(yōu)缺點(diǎn)：簡單，精子利用率高，但對精子沒有分選作用，不宜用于精子活力差和受精力較低的精液。第四十六頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五3.精子獲能處理精子獲能過程：在雌性生殖道分泌的某些物質(zhì)（如淀粉酶）以及雌激素的作用下，使與精子頂體結(jié)合的去能因子失去或失活而使精子得以獲能。其結(jié)果可以引起膜的通透性增加，鈣離子進(jìn)入精子內(nèi)部，激活腺苷酸環(huán)化酶，抑制磷酸二酯酶，誘發(fā)cAMF的濃度升高，進(jìn)而導(dǎo)致膜蛋白重新分布，使膜的穩(wěn)定性進(jìn)一步下降。第四十七頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五常用方法：（1）與血清白蛋白的溶液長時間孵育：可除去精子質(zhì)膜中的部分膽固醇和鋅離子，降低膽固醇在精子質(zhì)膜中的比例，進(jìn)而改變精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致精子獲能。優(yōu)缺點(diǎn)：時間較長，且誘發(fā)精子獲能的作用不強(qiáng)，目前只作為精子獲能的一種輔助手段。第四十八頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（2）與含有卵泡液的培養(yǎng)液進(jìn)行孵育：卵泡液中含有血清的大分子物質(zhì)，且含有誘發(fā)精子獲能和頂體反應(yīng)的因子，故可用此方法進(jìn)行獲能處理。（3）使用鈣離子載體：其能直接誘發(fā)鈣離子進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)，提高細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，從而導(dǎo)致精子的獲能。常用的載體為A23187。（嚙齒動物、家兔和豬）（4）使用肝素：肝素是一種高度硫酸化的氨基多糖類化合物，與精子結(jié)合后，引起鈣離子進(jìn)入精子細(xì)胞內(nèi)部而導(dǎo)致精子獲能。（牛、羊）第四十九頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五4.體外受精的方式有四種組合：（1）輸卵管卵子＋體內(nèi)獲能精子（2）輸卵管卵子＋體外獲能精子（3）體外培養(yǎng)的卵泡卵＋體內(nèi)獲能精子（4）體外培養(yǎng)的卵泡卵＋體外獲能精子第五十頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五第五十一頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五5.體外受精的培養(yǎng)系統(tǒng)（1）.微滴法：在塑料培養(yǎng)皿中用受精液做成20~40μl的微滴，上覆蓋石蠟油，每滴放入體外成熟的卵母細(xì)胞10~20枚及獲能精子（1.0~1.5μl）*106個/ml，在培養(yǎng)箱中孵育6~24h。優(yōu)點(diǎn)：受精液及精液的用量均較少，體外受精效果好；缺點(diǎn)：受精結(jié)果易受石蠟油影響，操作相對繁瑣，成本較高。第五十二頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五（2）四孔培養(yǎng)板法：沒空加入500μl受精液和100~150枚體外成熟卵母細(xì)胞，然后加入獲能處理的精子1.0~1.5μl）*106個/ml，在培養(yǎng)箱中孵育6~24h。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，不受石蠟油的影響缺點(diǎn)：精子的利用率相對較低，體外受精結(jié)果不穩(wěn)定。第五十三頁，共五十九頁，編輯于2023年，星期五二、輔助受精技術(shù)1.概念是借助于顯微操作儀使精子和卵子在體外完成受精過程的技術(shù)，又稱顯微受精。2.方法（1）透明帶修飾法是指運(yùn)用物理或化學(xué)方法對卵母細(xì)胞的透明帶進(jìn)行打孔、部分切除或撕開缺口，為精子進(jìn)入卵黃周隙打開通道，然后把卵子與一定濃度的精子共培養(yǎng)以完成受精過程。目前，僅在小鼠上取得成功。優(yōu)點(diǎn)：對卵子損傷小缺點(diǎn)：