形蟲(chóng)三磷酸核苷水解酶基因的克隆與序列分析

形蟲(chóng)三磷酸核苷水解酶基因的克隆與序列分析【摘要】目的:克隆并分析我國(guó)剛地弓形蟲(chóng)三磷酸核苷水解酶的編碼基因。方法:采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增弓形蟲(chóng)RH株的NTPase基因，克隆入pGEM-TEasy載體，轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切與測(cè)序鑒定，并對(duì)獲得的NTPase基因及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果:PCR擴(kuò)增得到特異的弓形蟲(chóng)NTPase基因序列，測(cè)序結(jié)果表明，獲得的弓形蟲(chóng)NTPase-Ⅱ基因全長(zhǎng)1812bp，編碼的603個(gè)氨基酸與Genebank報(bào)道的氨基酸序列同源性為100%。經(jīng)DNAStar預(yù)測(cè)NTPase-Ⅱ存在6個(gè)潛在抗原表位。結(jié)論:成功克隆出序列正確的弓形蟲(chóng)NTPase-Ⅱ基因，為其相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】弓形蟲(chóng)核苷水解酶克隆序列分析

Abstract:Objective:Tocloneandanalyzethenucleosidetriphosphatehydrolase(NTPase)geneofToxoplasmagondii.Methods:TheNTPasegenewasamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)fromRHstrainofToxoplasmagondiiandclonedintopGEM-TEasyvector.PositivecloneswerescreenedandidentifiedbyBglⅡ、HindⅢdigestionandsequenced.TheDNAsequenceanditsdeducedproteinsequencewereanalyzed.Results:TheNTPasegenewasspecificallyamplified,DNAsequenceanalysisshowedthatthelengthofclonedgenewas1812basepair.Thehomologyofthisdeducedaminoacidssequencewas100%tothatintheGenebank.Conclusion:TheNTPase-Ⅱgeneissuccessfullycloned,providingbasisforthefutureresearchaboutthisgene.

Keywords:Toxoplasmagondii;NTPase;cloning;sequencing

剛地弓形蟲(chóng)是專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會(huì)致病性原蟲(chóng)，呈世界性分布。三磷酸核苷水解酶為分布于弓形蟲(chóng)速殖子表面一種主要特異性抗原[1，2]，其對(duì)蟲(chóng)體在宿主細(xì)胞內(nèi)的寄生和繁殖都具有重要的作用。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于弓形蟲(chóng)病診斷和疫苗候選抗原的研究主要集中在P30和P22抗原[4-6]，而對(duì)NTPase的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，我們對(duì)弓形蟲(chóng)RH株的NTPase基因進(jìn)行擴(kuò)增與克隆，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

蟲(chóng)株和試劑弓形蟲(chóng)RH株由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院寄生蟲(chóng)病研究所惠贈(zèng)；DH5α為本室保存；pGEM-TEasy載體購(gòu)自Promega公司。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶BglⅡ、HindⅢ和基因組DNA提取試劑盒均為大連寶生物產(chǎn)品；2×PCRMasterMix試劑盒購(gòu)自上海晶美生物技術(shù)有限公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自寧波中鼎生物技術(shù)公司；200bpMarker及DNA凝膠回收試劑盒為上海生物工程技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

模板DNA制備弓形蟲(chóng)RH株速殖子連續(xù)在小鼠體內(nèi)傳代，感染3d后無(wú)菌操作抽取腹水，蟲(chóng)體用生理鹽水洗滌3次，加入與蟲(chóng)體混懸液等量的淋巴細(xì)胞分離液，800r/min離心8min后加速至2000r/min離心10min，收集中層蟲(chóng)體，按DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提弓形蟲(chóng)基因組DNA，用分光光度法測(cè)定DNA的濃度和純度。

PCR擴(kuò)增根據(jù)弓形蟲(chóng)NTPase參考核苷酸序列和表達(dá)載體克隆位點(diǎn)內(nèi)切酶圖譜分析結(jié)果，采用PrimerDesigner引物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì)引物，由上?；瞪锛夹g(shù)公司合成，引物序列上游引物：5‘-GAAGATCTACAGACTCATCGTCACTCCG-3‘，下游引物：5‘-GCAAGCTTTCACAGATTGTGAGAATATCC-3‘。采用2×PCRMasterMix試劑盒擴(kuò)增NTPase基因，PCR反應(yīng)總體積為50μl：其中含有模板DNA5μl，上下游引物各1μl。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃5min×1；95℃45s，58℃45s，72℃60s×30；72℃10min×1。%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定并切膠回收。

T-A克隆及測(cè)序回收的PCR產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體16℃過(guò)夜連接。連接體系為10μl：純化的PCR產(chǎn)物3μl，2×buffer5μl，pGEM-TEasyVector1μl，T4DNA連接酶1μl。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，吸取200μl轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)菌涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，篩選陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性重組子經(jīng)培養(yǎng)和提取質(zhì)粒后，分別進(jìn)行BglⅡ和HindⅢ雙酶切及PCR鑒定，并送上海基康生物技術(shù)公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN軟件與Genebank公布的弓形蟲(chóng)NTPase基因序列進(jìn)行比較，并推導(dǎo)其編碼的氨基酸序列。對(duì)獲得的基因及其氨基酸序列的同源性、保守功能域、二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果從弓形蟲(chóng)RH株DNA模板中擴(kuò)增獲得預(yù)期大小的目的條帶。

序列測(cè)定及推導(dǎo)的氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

物理化學(xué)性質(zhì)預(yù)測(cè)：測(cè)定的弓形蟲(chóng)NTPase編碼區(qū)基因長(zhǎng)1812bp，A+T含量為%，G+C含量為%，預(yù)測(cè)編碼603個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為，Mr為66900，其中含80個(gè)堿性氨基酸，78個(gè)酸性氨基酸，275個(gè)非極性疏水性氨基酸，170個(gè)極性氨基酸。獲得的NTPase編碼基因及推導(dǎo)的氨基酸序列見(jiàn)圖2。

同源性分析：用NCBI的BLASTN程序?qū)蜗x(chóng)NTPase編碼基因序列進(jìn)行核苷酸的同源性分析，結(jié)果顯示獲得的基因序列與GenBank上提交的NTPase-Ⅱ基因同源性達(dá)100%。

抗原表位預(yù)測(cè)：用DNAStar軟件對(duì)弓形蟲(chóng)NTPase-Ⅱ可能的抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，NTPase-Ⅱ氨基酸序列中存在6個(gè)潛在的抗原表位。

保守功能域分析：用Expasy的ScanProsite程序分析推導(dǎo)的弓形蟲(chóng)NTPase-Ⅱ氨基酸序列的保守功能域，發(fā)現(xiàn)在206～221位氨基酸具有GDA1/CD39家族的核苷磷酸酶標(biāo)志。氨基酸序列中還存在cAMP、cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(aa82～85)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(aa207～210、317～320、341～344、354～357、409～412、422～425、444～447、465～468、475～478、593～596)、N末端十四?；稽c(diǎn)(aa47～52、208～213、239～244、254～259、303～308、324～329)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(aa5～7、13～15、26～28、50～52、74～76、223～225、273～275、379～381、465～467、475～477)、酰胺化位點(diǎn)、N末端糖基化位點(diǎn)、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：用Expasy的predictprotein預(yù)測(cè)，弓形蟲(chóng)NTPase-Ⅱ的氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋與β片層和卷曲環(huán)之比為∶∶，屬于混合型，核心氨基酸與暴露殘基之比為∶，卷曲環(huán)區(qū)與平均柔曲性高峰區(qū)基本一致。

3討論

弓形蟲(chóng)NTPase是弓形蟲(chóng)在宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下獲得嘌呤的寄生機(jī)制而產(chǎn)生的，對(duì)弓形蟲(chóng)的寄生和繁殖都具有重要的作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲(chóng)產(chǎn)生的NTPase在二巰基化合物的激活作用下，能連續(xù)水解所有的三磷酸核苷和三磷酸脫氧核苷至單磷酸形式。感染宿主細(xì)胞的弓形蟲(chóng)速殖子即是利用NTPase分解宿主細(xì)胞來(lái)源的ATP，以合成維持自身生存所必需的嘌呤核苷酸。

NTPase蛋白有NTPase-Ⅰ和NTPase-Ⅱ兩種亞型，組成兩亞型的628個(gè)氨基酸中只有16個(gè)殘基不一樣，兩亞型的編碼基因有31個(gè)堿基不同且均不含有內(nèi)含子。NakajimaK等曾報(bào)道，使用NTPase-ELISA試驗(yàn)血清學(xué)診斷急性弓形蟲(chóng)病與Sabin-Feldman標(biāo)準(zhǔn)染色試驗(yàn)具有很好的相關(guān)性，且NTPase兩亞型間的抗原性并無(wú)明顯區(qū)別。Kikuchi等制備的特異性抗NTPase單克隆抗體6C6可與弓形蟲(chóng)強(qiáng)毒力株和非毒力株的4種不同的NTPase異構(gòu)酶分子均發(fā)生反應(yīng)，即6C6可識(shí)別4種NTPase異構(gòu)酶的共同表位[10]。NTPase-Ⅱ亞型存在于弓形蟲(chóng)的所有蟲(chóng)株中，且具有強(qiáng)抗原性和較好的免疫反應(yīng)性。本實(shí)驗(yàn)成功克隆出NTPase-Ⅱ基因，其測(cè)序結(jié)果與Genbank登陸序列L39079比較，核苷酸序列同源性高達(dá)100%，說(shuō)明NTPase-Ⅱ?yàn)楦叨缺Ｊ鼗?。本?shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)得NTPase-Ⅱ蛋白具有6個(gè)潛在的抗原表位，為我們今后表達(dá)重組NTPase蛋白用于弓形蟲(chóng)感染的免疫診斷和疫苗候選抗原的篩選奠定了基礎(chǔ)。

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