淺論RNAi沉默中期因子基因表達對胃癌細胞黏附和侵襲力的影響

淺論RNAi沉默中期因子基因表達對胃癌細胞黏附和侵襲力的影響【摘要】目的：探討中期因子(midkine，MK)基因小干擾RNA對胃癌細胞生物學行為的影響。方法：培養(yǎng)人胃癌BGC823、HGC27、MGC803及SGC7901細胞株，以熒光實時定量PCR方法檢測中期因子基因mRNA表達;篩選出中期因子表達最高者。采用中期因子基因小干擾RNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞株，分別以熒光實時定量PCR和免疫熒光方法觀察中期因子基因mRNA和蛋白水平，然后以四唑藍(MTT)比色法檢測細胞黏附性，以Boyden方法檢測癌細胞侵襲力。結(jié)果：4株胃癌細胞中，中期因子均有不同程度的表達，以胃癌BGC823細胞最高;以MKsiRNA轉(zhuǎn)染胃癌BGC823細胞后，癌細胞中期因子基因mRNA和蛋白水平明顯下降，且呈濃度依賴性;轉(zhuǎn)染組細胞黏附數(shù)量明顯下降，細胞侵襲力明顯下降。結(jié)論：中期因子基因在胃癌細胞黏附和侵襲中發(fā)揮著重要作用;以siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細胞，可抑制胃癌細胞黏附和侵襲能力。

【關(guān)鍵詞】胃癌;中期因子;RNA干擾;黏附;侵襲

[Abstract]Objective:Tostudytheeffectsofmidkine(MK)genesmallinterferingRNA(siRNA)onadhesionandinvasionofhumangastriccancercell.Methods:RealtimePCRwasusedtoevaluatetheMKmRNAexpressionofhumangastriccancercelllinesBGC823,HGC27,MGC803andSGCcellofMKhighestexpressionwastransfectedwithdifferentdoseofMKsiRNA.TheexpressionofMKmRNAandproteinwereweredeterminedbyrealtimequantitativePCRandimmumoflurescencecelladhesionwasevaluatedbyMTTassay,andinvasionwasexminedbyBoydenchamber,respectively.Results:CelllineBGC823showedthehighestelevationofMKmRNAinfourgastriccancercelllines.TheresultsfromrealtimequantitativePCRandimmumoflurescencemethodshowedthatMKmRNAandproteinreducedintimeanddosedependentmanners(;).Theadhesive,andinvasiveabilityofBGC823celltreatedwithMKsiRNAdecreasedcomparedwithcontrolgroups(,).Conclusion:MKgenemightplayanimportantroleinadhesionandinvasionofhumangastriccancercell.siRNAtargetedMKcouldeffectivelyinhibitadhesion,migration,andinvasionofhumangastriccancercell.

[Keywords]gastriccarcinoma;midkine;RNAinterference;adhesion;invasion

盡管胃癌的診斷和治療已經(jīng)有了長足的進步，但進展期胃癌的預(yù)后依然很差，5年生存率徘徊在20%～30%。己經(jīng)證實，胃癌的發(fā)生發(fā)展是多基因改變的結(jié)果。胃癌中特殊基因的表達異常在不同的細胞功能中發(fā)揮了重要作用，如細胞黏附、信號傳導(dǎo)、細胞分化、細胞增殖及轉(zhuǎn)移。更好地了解胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制將有利于胃癌的診治及預(yù)防。

許多研究表明生長因子不僅促進組織細胞的增殖，而且能誘導(dǎo)組織細胞的惡性轉(zhuǎn)化，在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮了重要的角色。中期因子(midkine，MK)基因是1988年Muramatsu等[1]在視黃酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎腫瘤細胞系HM1細胞cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的一種新基因，其后，在多種動物和人類中均已發(fā)現(xiàn)了中期因子基因。中期因子和另一種相似的細胞因子——多效生長因子(pleiotrophin，PTN)一起歸為一類新的肝素結(jié)合因子家族(heparinbindingfactorfamily)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，中期因子在許多腫瘤如食管癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝細胞癌、肺癌等多種癌細胞和組織中過表達，而在正常組織中表達很低或不表達[2-7]。因此，中期因子有可能作為腫瘤標志物在腫瘤的診斷、預(yù)后和治療中發(fā)揮作用。目前，關(guān)于中期因子與胃癌的關(guān)系研究較少。

本研究以胃癌細胞為模型，以小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)介導(dǎo)的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)下調(diào)癌細胞中期因子表達，旨在探討中期因子基因在人胃癌細胞黏附、侵襲中的可能作用。

1材料和方法

材料

人胃癌BGC823、HGC27、MGC803及SGC7901細胞株，由本院組織細胞生物庫凍存。MKsiRNA正義鏈序列：5′AGGACUAGACGCCAAGCCUTT3′，由美國Dharmacon公司合成。RPMI1640購自Gibco公司;Trizol、實時PCR擴增試劑盒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司;鼠抗人MK及β肌動蛋白抗體購自SantaCruz公司;MTT購自Sigma公司;基膜基質(zhì)Matrigel購自BectonDickinson公司。

方法

細胞培養(yǎng)

胃癌細胞在含10%胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)的RBMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。待對數(shù)生長期時，收取細胞，進行以下試驗。

胃癌細胞MKmRNA檢測

采用熒光實時定量RTPCR方法檢測中期因子mRNA。

細胞總RNA提取及cDNA合成

根據(jù)說明書，分別采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

定量RT

PCR采用熒光實時定量PCR檢測。收集細胞，以Trizol抽提細胞總RNA,取總RNA1μg，以O(shè)ligodT(15mer)為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此cDNA鏈2μl為模板進行PCR擴增，步驟參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。引物序列上游：5′GCGCGCTACAATGCTCAGT3′，下游：5′CCCTTCCCTTTCTTGGCTTT3′。FAM探針：5′CATGGGTGCCCCGACGTTGC3′TAMRA。PCR反應(yīng)條件：95℃，預(yù)變性3min，95℃30s，52℃45s，72℃45s;35個循環(huán)后，72℃再延伸7min。反應(yīng)后生成熔解曲線。MK基因表達值以2-ΔΔCt表示。

siRNA轉(zhuǎn)染

借助于LipofectamineTM2000進行轉(zhuǎn)染，具體操作參照說明書進行。轉(zhuǎn)染前1d，將×105對數(shù)期生長的細胞接種于24孔培養(yǎng)板，1ml/孔，培養(yǎng)過夜。次日進行轉(zhuǎn)染。細胞分組：①空白對照組(ConA)：未經(jīng)任何處理的胃癌細胞;②空載對照組(ConB)：即脂質(zhì)體對照組;③錯配對照組(ConC);④siRNA組：10%FBS的RPMI1640中含不同濃度的已用脂質(zhì)體包埋的siRNA。

轉(zhuǎn)染后中期因子基因mRNA及蛋白水平檢測

mRNA水平

采用熒光實時定量RT-PCR方法檢測，方法同上。

蛋白水平

采用免疫熒光法檢測。將胃癌細胞接種到預(yù)先放置蓋玻片的培養(yǎng)皿中，細胞和蓋玻片表面完全吸附后，用PBS洗2次，丙酮固定。PBS振洗后吹干。滴加MK單克隆抗體(1∶1000)覆蓋整個切片，4℃過夜。PBS振洗3次后吹干。滴加1∶50稀釋的FITC標記的二抗，37℃保溫30min。PBS振洗2次后用蒸餾水振洗。50%緩沖甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察，拍照，熒光強度掃描。

胃癌細胞黏附力檢測

參照文獻方法進行，部分步驟有改動。96孔培養(yǎng)板的每個孔鋪以50μl基質(zhì)膠(1∶20稀釋)，然后每孔加入含10mg/ml小牛血清白蛋白的無血清RPMI1640培養(yǎng)液50μl，作用1h。每孔加入2×104的懸浮細胞，放入CO2培養(yǎng)箱中。作用1h后，沒有黏附到培養(yǎng)板上的細胞被洗掉，已經(jīng)黏附的細胞被胰酶消化，然后計細胞數(shù)。黏附力=siRNA組細胞黏附數(shù)/ConA細胞黏附數(shù)×100%。

采用Boyden小室模型檢測癌細胞侵襲能力

Boyden小室上下室之間鋪聚碳酸醋微孔濾膜(孔徑8μm)，濾膜上包被有Matrigel。用無血清培養(yǎng)基準備單細胞懸液，并調(diào)整濃度為×104/ml。細胞以500μl無血清培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)小室的上層，小室下層加入500μl含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化物。在37℃，5%CO2，飽和濕度條件下分別培養(yǎng)72h后，用棉拭子去除上室底部基質(zhì)膠并移除未侵襲細胞;接著固定30min，PBS漂洗2次;HE染色30min。隨機選擇5個100倍顯微視野統(tǒng)計總細胞數(shù)，以侵襲細胞的相對數(shù)目表示腫瘤細胞的侵襲能力。每組設(shè)3個平行樣本，取其平均值，進行統(tǒng)計學分析。

統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)資料以x±s表示，以SPSS統(tǒng)計軟件分析。用Levene法進行方差齊性檢驗。若方差齊，用單因素方差分析，組間及組內(nèi)比較用LSDt檢驗;若方差不齊，用GamesHowell法進行分析。

2結(jié)果

胃癌細胞株中期因子基因mRNA表達水平

熒光定量PCR結(jié)果顯示熔解曲線具有單峰特異性。見圖1。熒光實時定量RTPCR結(jié)果顯示，MKmRNA在MGC803、SGC7901、HGC27及BGC823分別為±、±、±、±。BGC823細胞株中MKmRNA水平最高。故后續(xù)試驗以BGC823細胞為模型。圖1中期因子基因熔解曲線

siRNA轉(zhuǎn)染對胃癌BGC

823細胞MK基因mRNA和蛋白水平的影響定量PCR和免疫熒光結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染組細胞中期因子mRNA以及蛋白水平明顯下降，且呈濃度和時間依賴性(，)。見圖2，圖3。圖2siRNA轉(zhuǎn)染對胃癌BGC823細胞中期因子基因mRNA的影響圖3siRNA轉(zhuǎn)染對胃癌BGC823細胞中期因子水平的影響

中期因子基因siRNA轉(zhuǎn)染對胃癌細胞黏附力的影響

結(jié)果顯示，與ConA對照組比較，MKsiRNA轉(zhuǎn)染組細胞黏附明顯受到抑制，且呈濃度依賴性()，而脂質(zhì)體對照組(ConB)無明顯變化。見圖4。圖4中期因子基因siRNA轉(zhuǎn)染對胃癌BGC823細胞黏附力的影響

siRNA轉(zhuǎn)染對BGC823細胞侵襲能力的影響

Boyden小室上室細胞穿過膜上Matrigel到膜的下室面，其數(shù)量反映了細胞侵襲能力的大小。Boyden小室結(jié)果顯示，與對照組比較，MKsiRNA組穿過濾膜的細胞數(shù)明顯下降，且呈濃度依賴性()。見圖5。圖5中期因子siRNA轉(zhuǎn)染對胃癌細胞侵襲力的影響

3討論

中期因子是肝素結(jié)合生長因子家族的成員。人中期因子基因定位于，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。其啟動子區(qū)域有視黃酸反應(yīng)元件，因此視黃酸可誘導(dǎo)胚胎瘤細胞系和某些組織中期因子的表達。成熟的中期因子是一種分泌性蛋白，在妊娠中期胎兒組織中分布廣泛，出生后表達水平降低。在正常成人組織中，中期因子在小腸黏膜高表達，在甲狀腺中度表達，在肺、結(jié)腸、胃、腎及脾組織中微弱表達，而在肝臟完全不表達。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，中期因子高表達于多種人類惡性腫瘤，如乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細胞瘤和Wilm′s瘤等。本研究采用熒光實時定量PCR方法檢測4株胃癌細胞中期因子基因表達，發(fā)現(xiàn)BGC823細胞中期因子表達最高。進一步以BGC823細胞為模型，采用中期因子基因siRNA轉(zhuǎn)染該細胞后，分別以熒光實時定量PCR和免疫熒光方法檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組胃癌細胞MKmRNA和蛋白水平明顯下調(diào)，且呈時間和濃度依賴性。

癌的侵襲與轉(zhuǎn)移是一個多因素、多步驟、多階段的復(fù)雜過程。其中細胞黏附和侵襲是關(guān)鍵步驟。本實驗通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)胃癌BGC823細胞中中期因子基因表達，并觀察癌細胞黏附和侵襲力的變化。結(jié)果顯示，中期因子基因表達下調(diào)后，癌細胞黏附和侵襲力明顯下調(diào)，且呈濃度依賴性。

本研究結(jié)果提示，中期因子基因在人胃癌細胞黏附、侵襲中發(fā)揮著重要的作用，以該基因為靶點開展胃癌的靶向治療，將會有助于胃癌的綜合治療。

【參考文獻】

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