蛋白質(zhì)工程演示文稿

蛋白質(zhì)工程演示文稿當(dāng)前第1頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)優(yōu)選蛋白質(zhì)工程當(dāng)前第2頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)第一節(jié)蛋白質(zhì)工程的理論基礎(chǔ)蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測當(dāng)前第3頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)一蛋白質(zhì)工程的概念基于對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識，進(jìn)行分子設(shè)計，通過基因工程途徑定向地改造蛋白質(zhì)或創(chuàng)造合乎人類需要的新的突變蛋白質(zhì)的理論或?qū)嵺`活動。（1）確定蛋白質(zhì)化學(xué)組成、空間結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關(guān)系；（2）通過定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化等技術(shù)，合成具有特定氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。當(dāng)前第4頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)二蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)：多肽鏈的氨基酸殘基的排列順序二級結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助于氫鍵或離子鍵沿一維方向排列成具有周期性結(jié)構(gòu)的圖象。三級結(jié)構(gòu)：指整個蛋白質(zhì)多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，側(cè)鏈基團(tuán)通過次級鍵或疏水鍵的相互作用進(jìn)一步盤曲折疊，形成具有一定規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)。四級結(jié)構(gòu)：由兩條以上的多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，多肽鏈之間沒有共價鍵連接而是借疏水作用等次級鍵締合在一起形成的高級空間結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第5頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)當(dāng)前第6頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)氨基酸的聚合形成肽鏈當(dāng)前第7頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元:二硫鍵的折疊當(dāng)前第8頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元:氫鍵的折疊當(dāng)前第9頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元:離子鍵的折疊當(dāng)前第10頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元每四個氨基酸殘基間的氫鍵構(gòu)成多肽鏈

a螺旋當(dāng)前第11頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)單元由不同多肽鏈上氨基酸殘基間的氫鍵構(gòu)成多肽鏈

b折疊當(dāng)前第12頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)肽鏈的完整空間構(gòu)象當(dāng)前第13頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)當(dāng)前第14頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，而空間結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的功能。結(jié)構(gòu)域：蛋白質(zhì)多肽鏈上一段在三維結(jié)構(gòu)上可以明顯區(qū)分和相對獨(dú)立并具有一定生物學(xué)功能的基本單位。

模體（基序）：組成結(jié)構(gòu)域的基本二級結(jié)構(gòu)單位當(dāng)前第15頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)的加工修飾:磷酸化修飾當(dāng)前第16頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)的加工修飾:羧基化修飾幾種參與凝血的蛋白因子（如VIII和IV因子）需要在其谷酰胺側(cè)鏈上的g-羧基化修飾后，才能擁有蛋白酶的活性，這一修飾過程依賴與維生素K的存在。當(dāng)前第17頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)的加工修飾:甲基化修飾肌肉中的一些蛋白質(zhì)以及細(xì)胞色素C中的Lys會受到單甲基和二甲基化修飾；鈣調(diào)蛋白會受到三甲基化修飾；所有C末端以Glu結(jié)尾的蛋白質(zhì)，其Glu會受到甲基化修飾。當(dāng)前第18頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)的加工修飾:N-糖基化O-糖基化糖基化修飾當(dāng)前第19頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)的加工修飾:其它類型的修飾當(dāng)前第20頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)三蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測一級結(jié)構(gòu)：測序儀與數(shù)據(jù)庫高級結(jié)構(gòu)預(yù)測：

X射線晶體衍射法核磁共振法（NMR）當(dāng)前第21頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)蛋白質(zhì)一級序列數(shù)據(jù)庫PIR：由國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會（NBRF）建立MIPS：Martinsried的蛋白質(zhì)序列研究所收集和處理的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)SWISS-PROT

：蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，由Geneva大學(xué)和EMBL共同合作開發(fā)TrEMBL：翻譯的EMBL

NRL-3D：除序列信息外，也包括對二級結(jié)構(gòu)，活性位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)和修飾位點(diǎn)等信息。當(dāng)前第22頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)第二節(jié)蛋白質(zhì)工程關(guān)鍵技術(shù)定點(diǎn)突變定向進(jìn)化其他技術(shù)當(dāng)前第23頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)一定點(diǎn)突變寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變盒式突變當(dāng)前第24頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)遺傳信息傳遞的中心法則DNA（基因）DNA（基因）mRNA蛋白質(zhì)生物代謝物質(zhì)復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯代謝基因組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)蛋白組學(xué)代謝組學(xué)逆轉(zhuǎn)錄中心法則當(dāng)前第25頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)1.寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變

用含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下啟動DNA分子進(jìn)行復(fù)制的過程寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變的Kunkel改進(jìn)：載體：RF－M13DNA載體

菌株：dUTP酶和N－尿嘧啶脫核苷酶雙缺陷的菌株。原理：dUTP酶缺陷導(dǎo)致胞內(nèi)dUTP上升，部分取代dTTP進(jìn)入新生DNA鏈中，使得M13單鏈DNA大約1％的T被U取代。另一鏈合成后，將雙鏈DNA導(dǎo)入正常大腸桿菌，N－尿嘧啶糖基化酶除去DNA鏈上的尿嘧啶堿基，原M13模板鏈被降解，突變鏈因不含U被保留下來。當(dāng)前第26頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)當(dāng)前第27頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)

2.PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變當(dāng)前第28頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)當(dāng)前第29頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)3.盒式突變利用一段人工合成的含基因突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列。突變的寡核苷酸鏈成對存在，不會出現(xiàn)異源雙鏈的情況。全部轉(zhuǎn)化質(zhì)粒都是突變體。當(dāng)前第30頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)二、定向進(jìn)化先隨機(jī)突變，再定向選擇。如在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用Taq酶不具有3－5端糾錯的功能，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因引入突變，構(gòu)建突變序列庫，再憑借定向的選擇方法，定向選出所需性質(zhì)的突變酶。當(dāng)前第31頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)1.易錯PCR

在PCR反應(yīng)中，降低一種dNTP的含量，使PCR容易出錯，達(dá)到隨機(jī)突變的目的。當(dāng)前第32頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)2.DNA改組用DNAaseI

先將一個DNA片段消化成許多小片段，然后不加引物進(jìn)行PCR，使得消化后DNA小段之間重新按多種組合方式連接重組，然后利用原來整片段DNA兩端的引物進(jìn)行加引物的PCR擴(kuò)增，以便得到一系列改組后的突變DNA序列。當(dāng)前第33頁\共有35頁\編于星期三\15點(diǎn)3.體外隨機(jī)引發(fā)重組

以單鏈DNA為模板，