代謝物識別與結(jié)構鑒定

代謝物的結(jié)構鑒定在新藥開發(fā)過程的重要地位預防潛在的毒性測定是否和原藥具有相同的治療作用測定對其他治療有內(nèi)在的活性測定是否有代謝物和已知藥物相關當前第1頁\共有35頁\編于星期五\17點藥物代謝研究貫穿于創(chuàng)新藥物研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈的始終，并在藥物的發(fā)現(xiàn)及開發(fā)過程中起到越來越重要的作用。建立可靠的分析方法是研究藥物體內(nèi)代謝的前提。在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的許多階段，代謝物鑒定具有關鍵性作用。極性代謝物的分離和保留怎樣在復雜的數(shù)據(jù)中準確快速地找到代謝物怎樣對代謝物的結(jié)構進行確認，怎樣確定代謝位點A

CB

當前第2頁\共有35頁\編于星期五\17點聯(lián)用技術放射性示蹤當前第3頁\共有35頁\編于星期五\17點一、.聯(lián)用技術當前第4頁\共有35頁\編于星期五\17點聯(lián)用技術LC-MSLC-MS/MSGC-MSGC-MS/MSLC-NMR當前第5頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-MS聯(lián)用技術體內(nèi)代謝物研究過程中，因待測物濃度太低，提取其純品進行結(jié)構鑒定是不太可能的。應用LC-MS聯(lián)用技術可獲得復雜混合體中單一成分的質(zhì)譜圖，大大有利與藥物代謝物的分離與鑒定。當前第6頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-MS聯(lián)用技術隨著現(xiàn)代色譜聯(lián)用技術的發(fā)展，體內(nèi)多種微量代謝產(chǎn)物的分離、鑒定已成為一個連續(xù)過程，尤其是LC-MS樣品前處理簡單，一般不要求水解或衍生化處理，可直接用于藥物及其I，Ⅱ相等極性較大代謝產(chǎn)物的同時分離、鑒定。運用LC-MS技術不僅可避免復雜煩瑣的分離、純化代謝產(chǎn)物的工作，而且可分離鑒定難以辨識的體內(nèi)痕量代謝產(chǎn)物。當前第7頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-MS聯(lián)用技術

四極質(zhì)譜儀（QMS）三重四極質(zhì)譜儀（TQMS）四極-線性離子阱質(zhì)譜儀（QTrap）四極-飛行時間質(zhì)譜儀（Q-TOFMS）離子阱-飛行時間質(zhì)譜儀（IT-TOFMS）代謝物鑒定中，常用的與LC聯(lián)用的質(zhì)譜儀器當前第8頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-MS特點樣品前處理簡單，無需衍生化，適用范圍廣將色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高檢測靈敏度、定性專屬性集于一身隨著接口裝置和離子化技術的發(fā)展成熟，該技術在體內(nèi)藥物分析中逐漸發(fā)展成為一種常規(guī)的分離檢測方法當前第9頁\共有35頁\編于星期五\17點實例大鼠尿中人參皂苷Rd及其代謝物的LC-MS研究當前第10頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-MS實例目的：探討人參皂苷Rd在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物及轉(zhuǎn)化途徑。方法：選擇SD大鼠6只,單劑量口服和靜脈給予人參皂苷Rd,分段收集給藥前和給藥后0～24h尿樣,將尿樣分時段合并后采用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮,以固相萃取小柱純化處理,采用高效液相色譜-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜進行檢測。結(jié)果：通過比較給藥前后的TOF總離子流圖,對尿中推測的代謝物和標準物質(zhì)的出峰時間及相關化合物選擇離子掃描二級質(zhì)譜圖進行了比較分析,結(jié)果在尿中發(fā)現(xiàn)了7種代謝產(chǎn)物,系統(tǒng)分析了這些代謝產(chǎn)物的代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律及可能結(jié)構。結(jié)論：大鼠尿中人參皂苷Rd的主要轉(zhuǎn)化途徑為氧化、水解、結(jié)合及異構化代謝反應。當前第11頁\共有35頁\編于星期五\17點離子源(ESI)電壓:-4kV,去簇電勢(DP):-15V,聚焦電勢(FP):-80V,去簇電勢2(DP2):-15V,霧化氣(NEB):0135L·min-1簾氣(CUR):0120L·min-1負離子方式檢測采用TOF掃描一級質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍:400～1200選擇離子掃描二級質(zhì)譜進行測定色譜柱流動相其他質(zhì)譜條件色譜與質(zhì)譜條件為甲醇(A)-10mol·L-1乙酸銨(B)40min內(nèi)由體積比50∶50線性梯度升至90∶10,40～55min維持A∶B=90∶10,等度洗脫15min流速:018mL·min-1分流比為1∶60柱溫為25℃,進樣量為20μLAgilentZorbaxSBC18(150mm×416mm,5μm)AgilentZorbaxSBC18(1215mm×211mm)預柱LC-MS實例當前第12頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-MS實例MetabolizationpathwayofG-Rd當前第13頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-MS實例FragmentpathwayofG-Rd當前第14頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-MS/MS聯(lián)用技術由于多數(shù)藥物的代謝物保留了原藥分子的骨架結(jié)構，或一些亞結(jié)構，因此，代謝物可能進行與原藥相似的裂解，丟失一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征離子，用MS/MS分別進行中性丟失掃描、母離子掃描以及子離子掃描，即可迅速找到可能的代謝物，并鑒定出結(jié)構。當前第15頁\共有35頁\編于星期五\17點實例LC-MS/MS法快速高效檢測尿液中尼古丁及其9種代謝物當前第16頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-MS/MS實例以氘代尼古丁、氘代可的寧、3-OH-氘代可的寧、氘代尼古丁葡萄糖醛酸復合物、氘代可的寧葡萄糖醛酸復合物、3-OH-氘代可的寧葡萄糖醛酸復合物作內(nèi)標,在LC-MS/MS的大氣壓化學電離(APCI)離子化模式下,建立了快速檢測吸煙者尿液中尼古丁及其9種代謝物的方法,并對19個實際樣品進行了測試和判別分析(DA).實驗前處理簡單,色譜運行時間僅為3.8min.結(jié)果表明,尼古丁及其代謝物的精密度在0.5%～5.5%之間,回收率在94%～109%之間,線性相關系數(shù)均大于0.995.DA分析充分區(qū)別開了不同量的吸煙者,進一步的相關性分析表明吸煙者24h尿液中的尼古丁及其9種代謝物含量與卷煙抽吸量的分析因子之間均有較強正相關性.當前第17頁\共有35頁\編于星期五\17點質(zhì)譜檢測采用APCI源正離子化模式氣簾氣壓力設置為0.17MPa霧化氣0.55MPa碰撞氣0.04MPa離子源溫度為550℃離子化電流設為3μA各代謝物的多反應監(jiān)測(MRM)參數(shù)見表色譜柱流動相其他質(zhì)譜條件色譜與質(zhì)譜條件流動相A為10mmol/L醋酸銨水溶液(pH6.8)流動相B為10mmol/L醋酸銨的甲醇溶液流速0.5mL/min梯度洗脫條件:起始A為85%,到0.02min為5%保持至0.3min,0.32min變?yōu)?5%保持至2min結(jié)束柱溫為35℃為ShisheidoMGII柱(2.0mm×50mm,3μm)LC-MS/MS實例當前第18頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-MS/MS實例當前第19頁\共有35頁\編于星期五\17點GC-MS聯(lián)用技術氣質(zhì)聯(lián)用技術是分析儀器中較早實現(xiàn)聯(lián)用技術的儀器。氣相色譜分離效率高、定量準確，然而不足的是定性較為困難，及時未知樣品純度較高，鑒定結(jié)構也不容易。質(zhì)譜具有靈敏度高、鑒別能力強、響應速度快的優(yōu)點，但欠缺的是對復雜得多組分樣品的分離能力。雖然商品化的GC-MS聯(lián)用儀器出現(xiàn)較早，在藥物代謝研究中的應用也較早，但GC法對樣品的極性和熱穩(wěn)定性有一定要求。因此，在GC-MS聯(lián)用技術分析前，樣品的預處理極為重要。其代謝物的熱穩(wěn)定性、揮發(fā)性、極性可能差異較大，需要根據(jù)具體情況對樣品先進行水解處理或衍生化處理。當前第20頁\共有35頁\編于星期五\17點實例GC-MS/MS法測定人頭發(fā)中的大麻酚類及其代謝物當前第21頁\共有35頁\編于星期五\17點GC-MS/MS實例目的：建立同時檢測頭發(fā)中Δ9-四氫大麻酚（THC）、大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）和Δ9-四氫大麻酸（THC-COOH）的分析方法。方法：頭發(fā)樣品加入氘代內(nèi)標Δ9-四氫大麻酸（THC-COOH-d3），經(jīng)堿水解后，以混合溶劑[V（正己烷）∶V（乙酸乙酯＝9∶1]進行提取，吹干，殘留物經(jīng)雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，用GC-MS/MS方法進行分析。結(jié)果：頭發(fā)中THC-COOH、THC、CBN和CBD的最低檢出限分別為4、4、10和20pg·mg-1，各化合物在0.04～5ng·mg-1呈良好的線性關系（r＞0.999），方法精密度、準確度均符合要求。結(jié)論：本方法選擇性強、靈敏度高，適用于頭發(fā)中CBD、CBN、THC及其代謝物THC-COOH的分析，并成功應用于實際案例中。當前第22頁\共有35頁\編于星期五\17點質(zhì)譜檢測采用MRM模式，以一級質(zhì)譜分析結(jié)果為基礎，選擇各目標物的分子離子，優(yōu)化碰撞能量CE），得到各目標物和內(nèi)標的二級質(zhì)譜圖。CBD、CBN、THC、THC-COOH

和THC-COOH-d3的MS/MS見表色譜柱柱溫其他質(zhì)譜條件色譜與質(zhì)譜條件程序升溫：100℃保持1.5min，以升溫速率25℃/min升溫至280℃保持5min分流比2∶1；載氣：氦氣進樣口溫度：250℃檢測器溫度：250℃進樣量：1μL。HP-1MS石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.1μm）GC-MS/MS實例當前第23頁\共有35頁\編于星期五\17點GC-MS/MS實例當前第24頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-NMR聯(lián)用技術近年來，LC-MS雖然得到普及推廣，但MS本身不能提供足夠的分子結(jié)構信息，因此在實際使用LC-MS鑒定藥物代謝物結(jié)構時，往往需要借助核磁共振（NMR）的數(shù)據(jù)，才能順利完成工作。目前，在儀器分析領域中NMR能夠提供最大量的分子結(jié)構信息，但該法要求樣品為純品，即在做NMR分析前必須做大量的分離、純化工作，這不利于樣品的快速分析。如果在核磁共振儀器前配置一套色譜分離設備，使樣品被LC分離后，直接進入NMR中進行掃描測定，就可以大大簡化分析程序，提高樣品分析速度。因此，將高分離能力的色譜與能提供最豐富結(jié)構信息的NMR在線聯(lián)用是非常有意義的。當前第25頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-NMR聯(lián)用技術但HPLC和NMR的聯(lián)用并不是兩種技術的簡單組合：NMR的檢測靈敏度明顯低于常規(guī)的HPLC的檢測器，且作為HPLC流動相的混合溶劑往往產(chǎn)生多重強溶劑峰而影響溶質(zhì)峰的正確而檢測。由于技術上的原因，如NMR靈敏度低、液相色譜使用的氘代溶劑十分昂貴，溶劑信號對樣品的干擾等等使該聯(lián)用技術受到限制。近年來LC/NMR聯(lián)用技術在研究藥物代謝產(chǎn)物,特別是Ⅱ相代謝產(chǎn)物方面表現(xiàn)出了非常誘人的前景,有關研究報告相繼發(fā)表。當前第26頁\共有35頁\編于星期五\17點LC-NMR實例布洛芬在人體內(nèi)代謝物的研究便是一個很好的例子,健康男性注射400mg布洛芬后,收集0～4小時的尿液,經(jīng)HPLC/NMR聯(lián)用技術分析,圖譜中清晰地顯示出5個代謝產(chǎn)物:2-羥基布洛芬葡萄糖醛酸、2-羧基布洛芬葡萄糖醛酸、2-羥基布洛芬、2-羧基布洛芬和布洛芬葡萄糖醛酸。采用停止流動模式技術可以得到純的2-羥基布洛芬的1H-NMR圖譜。當前第27頁\共有35頁\編于星期五\17點二、放射性示蹤當前第28頁\共有35頁\編于星期五\17點放射性同位素示蹤技術是利用放射性核素及其標記物作為示蹤劑來研究生物體內(nèi)各種物質(zhì)吸收、分布、代謝、排泄(ADME)規(guī)律的一門科學。當前第29頁\共有35頁\編于星期五\17點放射性示蹤原理把用放射性核素標記的物質(zhì)A引入動物體，經(jīng)過一段時間，從排出物或組織中分離出另一化合物B，含有相當數(shù)量的上述標記核素，即可確定A在動物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變?yōu)锽.當前第30頁\共有35頁\編于星期五\17點與被示蹤的物質(zhì)有同一性，即放射性核素與其同種元素的非放射性核素在化學和生物學行為上具有高度一致性，不致擾亂和破壞體內(nèi)外生理過程的平衡狀態(tài)放射性示蹤一與被示蹤的物質(zhì)有可區(qū)別性，放射性核素的原子核不斷衰減，發(fā)出能被放射性探測儀所探測的射線，從而實現(xiàn)對標記物的定量及定位。二放射性同位素得以廣泛應用于活性物質(zhì)示蹤主要依賴于其最重要的兩個特點當前第31頁\共有35頁\編于星期五\17點放射性示蹤靈敏度高專屬性強適用性廣檢測方法簡便在藥物ADME研究中得到了廣泛的應用。放射性同位素示蹤技術在藥物ADME研究中發(fā)揮著十分重要的作用，美國FDA已將放射性同位素標記藥物給藥后的藥動學數(shù)據(jù)作為新藥安全性評價的重要依據(jù)，并制定了相關指南當前第32頁\共有35頁\編于星期五\17點放射性同位素示蹤劑的選擇在藥物ADME的研究中，常用的