單核苷酸多態(tài)性及其應用詳解演示文稿

單核苷酸多態(tài)性及其應用詳解演示文稿當前第1頁\共有39頁\編于星期五\18點優(yōu)選單核苷酸多態(tài)性及其應用當前第2頁\共有39頁\編于星期五\18點Singlenucleotidepolymorphism當前第3頁\共有39頁\編于星期五\18點SNP的特征

SNP是人類可遺傳的變異中最常出現(xiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，在人類基因組中廣泛存在，人類DNA中每300-1000bp就有一個SNP.因此，一個人類個體大約攜帶300萬-1000萬個SNPs。當前第4頁\共有39頁\編于星期五\18點SNP的特征

一個SNP表示在基因組某個位點上一個核苷酸的變化，作為一種堿基的替換，大多數(shù)為轉(zhuǎn)換（C—T，G—A），也可能是顛換。具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占SNP總量的2／3左右。轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，而且在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，多是發(fā)生C—T的轉(zhuǎn)換，原因是CG中的C是甲基化的，它能自發(fā)的脫氨基而替換為胸腺嘧啶。當前第5頁\共有39頁\編于星期五\18點SNP大都表現(xiàn)為二等位基因（bialletic)多態(tài)性,即在該位置只存在兩種不同的堿基。位于染色體上某一區(qū)域的一組相關聯(lián)的SNP等位位點被稱作單倍型(haplotype)，相鄰SNPs的等位位點傾向于以一個整體遺傳給后代.當前第6頁\共有39頁\編于星期五\18點當前第7頁\共有39頁\編于星期五\18點根據(jù)SNP在基因組中的分布位置可分為:基因編碼區(qū)SNP(cSNP)基因調(diào)控區(qū)SNP(pSNP)基因間隨機編碼區(qū)SNP(rSNP)等三類。

因為編碼區(qū)內(nèi)的變異率占周圍序列的1/5，cRNP的總量顯著少于其他兩類SNPs。當前第8頁\共有39頁\編于星期五\18點

cSNP又可分為2種：同義cSNP(synonymouscSNP)：非同義cSNP(non-synonymouscSNP)當前第9頁\共有39頁\編于星期五\18點同義cSNP：SNP所導致的編碼序列改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；非同義cSNP：指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)的功能。這種改變常常是導致生物性狀改變的直接原因。位于基因調(diào)控區(qū)的SNP則會影響基因表達量的多少，因此，這兩類SNP在功能和疾病發(fā)生發(fā)展方面具有更重要的意義。當前第10頁\共有39頁\編于星期五\18點SNP的檢測方法

單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)

原理：單鏈DNA的折疊結(jié)構(gòu)是由單核苷酸序列決定的，當某一個堿基發(fā)生突變時，便會直接影響該鏈的構(gòu)象，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移率會發(fā)生改變。當前第11頁\共有39頁\編于星期五\18點SNP的檢測方法變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)

原理:當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性溫度一致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同的時間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。當前第12頁\共有39頁\編于星期五\18點SNP的檢測方法

Taqman法

以熒光共振能量傳遞(fluorescentresonanceenergytransfer,FRET)為基礎的檢測方法。在PCR反應中，將供者-受者染料對分別結(jié)合到Taqman探針的兩端，探針未與目標序列結(jié)合時，通過FRET作用使供者不發(fā)熒光；完全互補配對后，由于TaqDNA聚合酶具有5‘核酸酶的活性，可將供者從探針上切下來從而發(fā)出熒光。如果探針與目標序列中存在錯配堿基，就會減少探針與目標序列結(jié)合的緊密程度及TaqDNA聚合酶切割供者的活性，也就影響了供者的熒光釋放量，從而使堿基突變鏈和正常鏈得以區(qū)分。當前第13頁\共有39頁\編于星期五\18點

供者受者5‘

3‘

Taqman探針當前第14頁\共有39頁\編于星期五\18點

供者受者5‘

3‘

Taqman探針當前第15頁\共有39頁\編于星期五\18點

供者受者5‘

3‘

引物目標序列當前第16頁\共有39頁\編于星期五\18點受者5‘

3‘

引物

供者目標序列當前第17頁\共有39頁\編于星期五\18點SNP的檢測方法

分子信標(molecularbeacon)法

分子信標是一個U型的單鏈核苷酸探針（探針序列內(nèi)部可有一定程度的互補配對），在探針兩端也加上供者-受者染料對，U型探針使兩染料靠近，通過FRET作用使供者不發(fā)熒光。當探針與目標序列完全互補配對后，兩染料分離，使得供者的熒光亮增加，如果目標序列中存在錯配堿基，就會影響探針與其結(jié)合，從而影響到供者的熒光亮，使堿基突變鏈和正常鏈得以區(qū)分。當前第18頁\共有39頁\編于星期五\18點供者受者當前第19頁\共有39頁\編于星期五\18點

供者受者當前第20頁\共有39頁\編于星期五\18點焦磷酸測序法焦磷酸測序法(pyrosequencing)是一種不依賴平板膠或毛細管電泳，不依賴DNA的熒光標記/激發(fā)/檢測體系的序列分析技術(shù)，適用于已知序列的DNA片段進行驗證分析，適用于已知SNP的序列驗證及基因分型。當前第21頁\共有39頁\編于星期五\18點焦磷酸測序法主要是由四種酶催化同一反應體系中的酶級聯(lián)反應:包括DNA聚合酶、硫酸化酶、螢光素酶和雙磷酸酶;反應底物為adenosine5‘phosphosulfate(APS)和螢光素。反應體系還包括待測序的DNA單鏈和測序引物。當前第22頁\共有39頁\編于星期五\18點在每一輪測序反應中，加入一種dNTP。如該dNTP與模板配對，聚合酶就可以催化該dNTP摻入到引物鏈中并釋放焦磷酸基團(PPi)。摻入的dNTP和釋放的焦磷酸的物質(zhì)的量相等，反應時dATP由deoxyadenosinealfa-thiotriphosphale(dATPaS)替代．因為DNA聚合酶對dATPaS的催化效率比對dATP的催化效率高，且dATP是螢光素酶的底物，dATPctS不是。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，其物質(zhì)的量和焦磷酸一致。當前第23頁\共有39頁\編于星期五\18點

ATP驅(qū)動螢光素酶介導的螢光素向氧化螢光素(oxyluclferin)的轉(zhuǎn)化，氧化螢光素發(fā)出與ATP含量成正比的可見光信號。光信號由CCD攝像機檢測并通過相應的軟件得到反映。每個峰的高度(光信號）與反應中摻入的核苷酸數(shù)成正比，ATP和未摻入的dNTP由雙磷酸酶降解，猝滅光信號，并再生反應體系，加入另一種dNTP進行下一輪反應。隨著以上過程的循環(huán)進行，互補DNA鏈合成，DNA序列信號峰確定。該技術(shù)分析系統(tǒng)自動化程度高，通量大，速度快，易于建立標準化操作，適合大規(guī)模SNP研究及基因分型。當前第24頁\共有39頁\編于星期五\18點當前第25頁\共有39頁\編于星期五\18點SNP的檢測方法

動態(tài)等位基因特異性雜交法(dynamicallelespecifichybridization,DASH)用生物素標記一條引物進行目的DNA擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)生物素結(jié)合于鏈親和素包裹的微孔板壁，不帶生物素標記的鏈用堿洗掉。加入探針和熒光染料，熒光染料SYBRGreenⅠ可特異性地插入ＤＮＡ雙鏈中，在激發(fā)光的作用下發(fā)出熒光，而在單鏈ＤＮＡ中則不能；探針和ＰＣＲ產(chǎn)物單鏈雜交后，在ＤＡＳＨ儀中微孔板持續(xù)緩慢升溫，同時連續(xù)檢測各孔中熒光強度，將溫度及各孔中對應的熒光強度輸入計算機,ＳＮＰ基因型與探針完全匹配的樣品在較高溫度才解鏈,因此在較高溫度才得到d(Fluorescence)/dt峰;與探針不完全匹配的樣品則在較低溫度時就得到d(Fluorescence)/dt峰，雜合子則得到兩個峰。當前第26頁\共有39頁\編于星期五\18點PCR擴增當前第27頁\共有39頁\編于星期五\18點鏈親和素包裹的微孔板

+

堿變性當前第28頁\共有39頁\編于星期五\18點持續(xù)緩慢升溫當前第29頁\共有39頁\編于星期五\18點

當前第30頁\共有39頁\編于星期五\18點SNP的檢測方法

變性高效液相色譜(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography,DHPLC)

原理當前第31頁\共有39頁\編于星期五\18點當前第32頁\共有39頁\編于星期五\18點當前第33頁\共有39頁\編于星期五\18點當前第34頁\共有39頁\編于星期五\18點當前第35頁\共有39頁\編于星期五\18點SNP的檢測方法

ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質(zhì)譜分析法(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-flightmassspectrometry)原理：適當大小的有機分子晶體(介質(zhì))用接近其吸收光譜的激光瞬時激發(fā)，會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移及解吸附過程。如將低濃度的蛋白質(zhì)或核酸分子加入介質(zhì)溶液中并加以干燥，蛋白質(zhì)或核酸分子將嵌入到介質(zhì)晶體中。將該晶體放入質(zhì)譜儀的真空小室，用瞬時(納秒)強激光激發(fā)，晶體中的蛋白質(zhì)或核酸分子就會解吸附，轉(zhuǎn)變成氣相的離子態(tài)，此時可通過質(zhì)譜分析這些離子。當前第36頁\共有39頁\編于星期五\18點SNP的檢測方法

DNA芯片技術(shù)（DNAchip）

將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上，彼此之間重疊1個堿基，并覆蓋全部所需檢測的基因，將熒光標記的正常DNA和突變DNA分別與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在1個堿基的差異，正常和突變的DNA將會得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過共聚集顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號，即可確定是否存在突變，該方法快速簡單、片動化程度高，具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ瑢⒃诨蛲蛔儥z測中心發(fā)揮非常重要的作用。當前第37頁\共有39頁\編于星期五\18點SNP的應用

SNP作圖

利用SNP圖譜搜尋遺傳致病基因

SNP在藥物設計中的作用

SNP在法醫(yī)學中