基因重組和基因工程

目的要求熟悉DNA重組的類型：同源重組、特異位點重組和轉(zhuǎn)座重組等。熟悉同源重組、特異位點重組、轉(zhuǎn)座、插入序列和轉(zhuǎn)座子、接合作用、轉(zhuǎn)化作用和轉(zhuǎn)導作用的概念；細菌的基因轉(zhuǎn)移的方式。掌握重組DNA技術(shù)的相關(guān)概念：重組DNA技術(shù)的基本原理和過程；目的基因的概念及種類。熟悉限制性內(nèi)切核酸酶的概念、識別位點及切割產(chǎn)生的末端；目的基因的獲取途徑；外源基因與載體的連接方式；重組DNA導入受體菌的方式；重組體的篩選方法。當前第1頁\共有116頁\編于星期五\7點1

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的

DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequently

inNature第一節(jié)當前第2頁\共有116頁\編于星期五\7點2什么是DNA重組？DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合。DNA片段在細胞內(nèi)、細胞間，甚至在不同物種之間進行交換，交換后的片段仍然具有復制和表達的功能當前第3頁\共有116頁\編于星期五\7點3DNA重組廣泛存在于各類生物：真核生物基因組間重組多發(fā)生在減數(shù)分裂時同源染色體之間的交換。原核生物來自不同親代兩組DNA之間可通過多種形式遺傳重組。意義：迅速增加群體遺傳多樣性、區(qū)分有利、不利突變、通過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息參與許多重要的生物學過程當前第4頁\共有116頁\編于星期五\7點4DNA重組的分類轉(zhuǎn)座(transposition)同源重組(homologousrecombination)位點特異的重組(site-specificrecombination)當前第5頁\共有116頁\編于星期五\7點5概念：發(fā)生在同源序列間的重組，通過鏈的斷裂（,配對）和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段交換的過程。又稱基本重組（generalrecombination)。是最基本的DNA重組方式一、同源重組是最基本的DNA重組方式指在同一物種不同個體間或不同物種間相同或相似的DNA序列

當前第6頁\共有116頁\編于星期五\7點6同源重組最初的證據(jù)來自細胞遺傳學對減數(shù)分裂時染色體行為的研究。真核生物在形成配子時，細胞染色體進行一次復制，細胞核進行兩次分裂，由此從雙倍體細胞產(chǎn)生單倍體細胞，故稱減數(shù)分裂。前期，參與聯(lián)會的同源染色體實際上已復制形成兩條姊妹染色體，從而出現(xiàn)有四條染色體構(gòu)成的四聯(lián)體。在四聯(lián)體的某些位置非姊妹染色單體之間可以發(fā)生交換。當前第7頁\共有116頁\編于星期五\7點7同源重組機制—Holliday模型（1）兩個同源染色體DNA排列整齊（任意兩個同源DNA片斷可以發(fā)生重組，但同源雙鏈DNA分子必須緊密接觸，方能交換）。

ＡＢＣＡ′B′C′

a′b′c′abc1234

當前第8頁\共有116頁\編于星期五\7點8（2）一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′（3）通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA，形成Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′當前第9頁\共有116頁\編于星期五\7點9片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)（4）Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：當前第10頁\共有116頁\編于星期五\7點105′3′5′5′5′3′3′3′DNA連接酶片段重組體5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)5′3′5′5′5′3′3′3′拼接重組體5′5′5′5′3′3′3′3′5′3′5′5′5′3′3′3′DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′當前第11頁\共有116頁\編于星期五\7點11片段重組體

（見模型圖右邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。

當前第12頁\共有116頁\編于星期五\7點12當前第13頁\共有116頁\編于星期五\7點13參與E.coli同源重組的主要酶RecA蛋白：結(jié)合單鏈DNA，形成的復合物，復合物可將同源雙螺旋中的互補順序“退火”，同時將另一條鏈排擠出去，形成所謂D環(huán)RecBCD：具有三種酶活性：①DNA解旋酶；②核酸外切酶；③單鏈內(nèi)切酶的活性。RuvC：特異的識別Holliday分支點，并改變DNA在Holliday分支點處的構(gòu)型，將兩條單鏈切斷，隨后由連接酶將切口連接.當前第14頁\共有116頁\編于星期五\7點14

內(nèi)切酶(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′當前第15頁\共有116頁\編于星期五\7點15Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體當前第16頁\共有116頁\編于星期五\7點16①不需要特異DNA序列，而是依賴兩個分子間序列的相同或相似性（同源性）；②同源雙鏈DNA分子必須緊密接觸，相對應方才能交換（聯(lián)會）③重組時，兩個DNA片段必須有一個發(fā)生斷裂或有一段單鏈缺失（空隙）。同源重組特點：當前第17頁\共有116頁\編于星期五\7點17二、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組有四種方式細菌可以通過多種途徑進行細胞間基因轉(zhuǎn)移，并通過基因重組適應隨時改變的環(huán)境。這種遺傳信息的流動不僅發(fā)生在種內(nèi)，也發(fā)生在種間如果被轉(zhuǎn)移基因與內(nèi)在基因部分同源就可以發(fā)生同源重組當前第18頁\共有116頁\編于星期五\7點18（一）接合作用當細菌的細胞通過性菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細胞轉(zhuǎn)移至另一細胞的過程稱為接合作用(conjugation)。細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。可自主復制供體細胞被定義為雄性受體細胞被定義為雌性當前第19頁\共有116頁\編于星期五\7點19能夠促使DNA轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒稱為致育因子，F(xiàn)因子(Ffactor)與接合功能有關(guān)的蛋白質(zhì)（性菌毛等）均由F因子編碼。當前第20頁\共有116頁\編于星期五\7點20當前第21頁\共有116頁\編于星期五\7點21當前第22頁\共有116頁\編于星期五\7點22F質(zhì)粒DNA可以通過重組整合到受體的染色體中，使受體菌成為高頻重組（Hrf)菌株若F質(zhì)粒的DNA未能完整地進入受體菌，則受體菌不能轉(zhuǎn)化為F+F質(zhì)粒的DNA可以被切割出來，有時可攜帶宿主菌的染色體DNA，稱作F?因子，F(xiàn)?因子攜帶的基因可在受體菌表達。當前第23頁\共有116頁\編于星期五\7點23（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細菌獲得新的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化作用(transformation)。當前第24頁\共有116頁\編于星期五\7點24具有攝取周圍環(huán)境中游離DNA分子能力的細菌稱為感受態(tài)細胞很多細菌在自然條件下就有吸收外源DNA的能力（如固氮菌、鏈球菌等），雖然感受態(tài)經(jīng)常是瞬間的。當前第25頁\共有116頁\編于星期五\7點25自然條件下感受態(tài)的形成需要10多種蛋白質(zhì)參與實驗室：高濃度的Ca2+處理使細菌形成感受態(tài)當前第26頁\共有116頁\編于星期五\7點26①.游離DNA與細胞表面DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，②.其中一股鏈被核酸酶降解，另一股鏈被吸收當前第27頁\共有116頁\編于星期五\7點27當前第28頁\共有116頁\編于星期五\7點28（三）轉(zhuǎn)導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（受體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導作用(transduction)。通過噬菌體（病毒）將細菌（細胞）基因從供體轉(zhuǎn)移到受體當前第29頁\共有116頁\編于星期五\7點29λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)當前第30頁\共有116頁\編于星期五\7點30

當前第31頁\共有116頁\編于星期五\7點31轉(zhuǎn)導過程當前第32頁\共有116頁\編于星期五\7點32（四）細胞融合細胞質(zhì)膜融合導致基因轉(zhuǎn)移、重組實驗室：溶菌酶除細菌細胞壁，人工促使原生質(zhì)體融合，引起廣泛的重組。當前第33頁\共有116頁\編于星期五\7點33三、位點特異重組，即特異位點間發(fā)生的整合位點特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。原核生物中，有時基因重組依賴于小范圍的同源序列的聯(lián)會，重組只限于該小范圍內(nèi)，只涉及特定位點的同源區(qū)，這類重組稱作～當前第34頁\共有116頁\編于星期五\7點34當前第35頁\共有116頁\編于星期五\7點35λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端重復序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌體DNA的整合當前第36頁\共有116頁\編于星期五\7點36（二）細菌的特異位點重組如果一個DNA分子上兩個特異位點之間發(fā)生重組，其后果有兩種可能性：即兩個位點之間的節(jié)段或被丟失，或被顛倒。倘若基因重組發(fā)生在調(diào)節(jié)基因或基因調(diào)控區(qū)，就會影響某些基因的“開關(guān)”機制。有些生物能夠利用這種重組倒置來控制基因的表達。當前第37頁\共有116頁\編于星期五\7點37①兩端各有一個14bp的反向重復序列（特異重組位點-hix），二者方向相反。②中間是hin基因，編碼特異的重組酶-倒位酶，催化H片段倒位重組。③hin基因兩端各有一個啟動子（P)，其中一個啟動子啟動hin基因表達產(chǎn)生倒位酶，另一個啟動子正向啟動鄰近的H2和rH1基因表達，分別產(chǎn)生H2鞭毛蛋白和H1阻遏蛋白。阻抑蛋白可抑制遠方H1基因的表達。因而結(jié)果是H2表達而H1不表達。H片段的組成和功能：當前第38頁\共有116頁\編于星期五\7點38沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。當前第39頁\共有116頁\編于星期五\7點39hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅(qū)動hin基因表達，另一正向時驅(qū)動H2和rH1基因表達，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因。當前第40頁\共有116頁\編于星期五\7點40H2鞭毛素阻遏蛋白Hin轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1

H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變當前第41頁\共有116頁\編于星期五\7點41四、轉(zhuǎn)座重組大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移動的DNA序列可以分為：插入序列和轉(zhuǎn)座子兩類。由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。當前第42頁\共有116頁\編于星期五\7點42轉(zhuǎn)座子中包含一些基因，這些基因可以使轉(zhuǎn)座子從原來的DNA鏈位置上斷裂開來，然后再插入到另外的DNA鏈位置上。當插入到一個新的位置后，轉(zhuǎn)座子對附近基因的功能會造成一定的影響，在離開該位置時，它又有可能把一些附近的基因也一起帶走。轉(zhuǎn)座子的這種行為有點“唯我獨尊”，是基因的自私性的一種表現(xiàn)。當前第43頁\共有116頁\編于星期五\7點43插入序列(insertionsequences,IS)組成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列轉(zhuǎn)座二個分離的反向重復(invertedrepeats,IR)序列一個轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因當前第44頁\共有116頁\編于星期五\7點44插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)當插入序列轉(zhuǎn)座時，宿主靶部位雙鏈被交錯切開，經(jīng)修復后形成短的正向重復靶序列通常是任意的但交錯切開的長度是固定的。當前第45頁\共有116頁\編于星期五\7點45插入序列的復制性轉(zhuǎn)座當前第46頁\共有116頁\編于星期五\7點46轉(zhuǎn)座子(transposons)—可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子組成：

反向重復序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因當前第47頁\共有116頁\編于星期五\7點47細菌的可流動性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復序列(箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、β-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列IS10L當前第48頁\共有116頁\編于星期五\7點48由轉(zhuǎn)座子介導的轉(zhuǎn)座當前第49頁\共有116頁\編于星期五\7點49第二節(jié)

重組DNA技術(shù)

又稱DNA克隆或分子克隆DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone當前第50頁\共有116頁\編于星期五\7點50重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗。1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。1973年美國斯坦福大學的科學家構(gòu)建第一個重組DNA分子。1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉。當前第51頁\共有116頁\編于星期五\7點51一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆當前第52頁\共有116頁\編于星期五\7點52技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)（即DNA克?。?/p>

細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮?/p>

當前第53頁\共有116頁\編于星期五\7點53應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

DNA克隆當前第54頁\共有116頁\編于星期五\7點54生物技術(shù)工程:基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程等目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。當前第55頁\共有116頁\編于星期五\7點55（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶當前第56頁\共有116頁\編于星期五\7點56重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基當前第57頁\共有116頁\編于星期五\7點57限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：當前第58頁\共有116頁\編于星期五\7點58與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類：作用：當前第59頁\共有116頁\編于星期五\7點59Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG當前第60頁\共有116頁\編于星期五\7點60BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口當前第61頁\共有116頁\編于星期五\7點61來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶：當前第62頁\共有116頁\編于星期五\7點62有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶當前第63頁\共有116頁\編于星期五\7點63名稱識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’MboⅠ

5’…▼GATC...3’NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’限制性內(nèi)切核酸酶當前第64頁\共有116頁\編于星期五\7點64（三）目的基因(targetgene)cDNA(complementaryDNA)指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互補的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應可合成雙鏈cDNA?；蚪MDNA(genomicDNA)指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。當前第65頁\共有116頁\編于星期五\7點65（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA當前第66頁\共有116頁\編于星期五\7點66克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。當前第67頁\共有116頁\編于星期五\7點67載體的選擇標準：能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。當前第68頁\共有116頁\編于星期五\7點68質(zhì)粒

(plasmid)特點:能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。當前第69頁\共有116頁\編于星期五\7點69當前第70頁\共有116頁\編于星期五\7點70

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列當前第71頁\共有116頁\編于星期五\7點71當前第72頁\共有116頁\編于星期五\7點72酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他當前第73頁\共有116頁\編于星期五\7點73二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導入受體細胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達

當前第74頁\共有116頁\編于星期五\7點74以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程當前第75頁\共有116頁\編于星期五\7點75（一）目的基因的獲取化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)(見第22章)當前第76頁\共有116頁\編于星期五\7點76化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。當前第77頁\共有116頁\編于星期五\7點77組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫獲取目的基因當前第78頁\共有116頁\編于星期五\7點78限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫用隨機切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫當前第79頁\共有116頁\編于星期五\7點79mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復制從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT當前第80頁\共有116頁\編于星期五\7點80（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。當前第81頁\共有116頁\編于星期五\7點81（三）外源基因與載體的連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接當前第82頁\共有116頁\編于星期五\7點82BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接當前第83頁\共有116頁\編于星期五\7點83不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。當前第84頁\共有116頁\編于星期五\7點84平端連接

限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端適用于：當前第85頁\共有116頁\編于星期五\7點85目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連當前第86頁\共有116頁\編于星期五\7點86在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。同聚物加尾連接當前第87頁\共有116頁\編于星期五\7點875′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′當前第88頁\共有116頁\編于星期五\7點88由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。

人工接頭(linker)連接當前第89頁\共有116頁\編于星期五\7點89人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ當前第90頁\共有116頁\編于星期五\7點90受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導入受體菌當前第91頁\共有116頁\編于星期五\7點911.直接選擇法(1)抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等（五）重組體的篩選當前第92頁\共有116頁\編于星期五\7點921.直接選擇法(1)抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等（五）重組體的篩選當前第93頁\共有116頁\編于星期五\7點93(插入失活法)抗藥性標記選擇當前第94頁\共有116頁\編于星期五\7點94α互補利用α互補原理篩選重組體pUC18當前第95頁\共有116頁\編于星期五\7點95

原位雜交當前第96頁\共有116頁\編于星期五\7點96

Southern印跡當前第97頁\共有116頁\編于星期五\7點97雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學方法當前第98頁\共有116頁\編于星期五\7點98重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細胞篩篩選重組體

當前第99頁\共有116頁\編于星期五\7點99熟悉蛋白質(zhì)的分子組成特點；氨基酸的化學結(jié)構(gòu)、分類、三字符號及理化性質(zhì)；肽及多肽鏈的兩端；谷胱甘肽。掌握蛋白質(zhì)一至四級結(jié)構(gòu)的概念、要點、主要化學鍵及模體(motif)、結(jié)構(gòu)域(domain)、分子伴侶(chaperon)的概念。掌握蛋白質(zhì)重要的理化性質(zhì)。熟悉蛋白質(zhì)分離和純化的方法及其原理。當前第100頁\共有116頁\編于星期五\7點100掌握核酸的分類、生物學功能、分子組成、化學結(jié)構(gòu)特點。掌握核酸一級結(jié)構(gòu)的概念及連接鍵。掌握DNA的堿基組成及Chargaff規(guī)則、DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)要點。熟悉DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)、核小體的組成。掌握RNA的分類、mRNA的結(jié)構(gòu)特點、tRNA一級結(jié)構(gòu)及二級結(jié)構(gòu)的特點、rRNA的功能。掌握DNA的變性、DNA的復性及分子雜交。當前第101頁\共有116頁\編于星期五\7點101掌握酶的概念。熟悉酶的分子組成：全酶的組成、輔酶與輔基、金屬離子的作用、維生素構(gòu)成的輔酶與輔基。掌握酶活性中心的概念、活性中心的必須基團。掌握酶促反應的特點：高效性、特異性、可調(diào)節(jié)性。掌握影響酶的反應動力學因素、米-曼氏方程式、Km與Vm的意義、酶的最適溫度、最適pH、可逆性抑制作用的概念、類型及其特點。熟悉不可逆性抑制作用的概念、類型及其特點。掌握酶原及酶原激活的概念、酶共價修飾的概念、同工酶的概念及特點。熟悉酶原激活的機理；酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)；化學修飾調(diào)節(jié)的特點；乳酸脫氫酶同工酶的種類、分布、功能及臨床意義。當前第102頁\共有116頁\編于星期五\7點102重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交當前第103頁\共有116頁\編于星期五\7點103表達體系的建立：表達載體的構(gòu)建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化（