基層培訓(xùn)免疫學(xué)技術(shù)

（優(yōu)選）基層培訓(xùn)免疫學(xué)技術(shù)當(dāng)前第1頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)臨床免疫檢驗(yàn)是運(yùn)用免疫學(xué)基本的基本原理和技術(shù)，檢查臨床標(biāo)本中的微生物抗原、腫瘤抗原以及相應(yīng)的微生物抗體、自身抗體，為感染性性疾病、腫瘤、自身免疫病以及免疫缺陷提供診斷依據(jù)。當(dāng)前第2頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)免疫檢驗(yàn)分為兩個(gè)部分，一部分為利用免疫檢測(cè)原理檢測(cè)免疫活性細(xì)胞、抗原、抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子等免疫相關(guān)物質(zhì)，另一部分是利用免疫檢測(cè)原理檢測(cè)體液中微量物質(zhì)如激素、酶、血漿微量蛋白、血液藥物濃度、微量元素等。這些檢測(cè)結(jié)果為臨床上確定診斷、分析病情、調(diào)整治療方案和判斷預(yù)后等提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。當(dāng)前第3頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)第一節(jié)免疫學(xué)檢驗(yàn)原理、特點(diǎn)和方法

當(dāng)前第4頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)一、免疫學(xué)檢驗(yàn)原理（一）抗原抗體反應(yīng)是抗原與相應(yīng)抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)。它既可發(fā)生在體內(nèi)，也可發(fā)生在體外。在體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)即為體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)作用。體外的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，根據(jù)參與反應(yīng)的抗原的物理性狀（可溶性或顆粒性）以及參與反應(yīng)的條件（電解質(zhì)、補(bǔ)體等）不同，表現(xiàn)出不同的現(xiàn)象，如沉淀、凝集、細(xì)胞溶解、補(bǔ)體結(jié)合和毒素中和等。一般將檢查血清中病原微生物抗原和抗體的試驗(yàn)稱為血清學(xué)試驗(yàn)。當(dāng)前第5頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段。第一階段為特異性結(jié)合階段，此階段僅需數(shù)秒至數(shù)分鐘，但并不出現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)；第二階段為可見(jiàn)反應(yīng)階段，這一階段抗原抗體復(fù)合物在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)、pH、溫度和補(bǔ)體等的影響下，進(jìn)一步交聯(lián)聚集，出現(xiàn)凝集、沉淀、溶解和補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)。第二階段反應(yīng)較慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。這兩個(gè)階段不能嚴(yán)格劃分，所需的時(shí)間也受多種因素的影響。當(dāng)前第6頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（二）抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：1、特異性抗原抗體反應(yīng)的特異性（specificity）是指抗原分子上的抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)結(jié)合的特異性，由這兩個(gè)分子之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性決定的。形同鑰匙與鎖一樣，所以抗原抗體的結(jié)合是有高度特異性的。例如白喉抗抗毒素只能與相應(yīng)的外毒素結(jié)合，而不能與破傷風(fēng)外毒素結(jié)合。因此，在抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中，可以用已知的抗原或抗體來(lái)檢測(cè)特定的相對(duì)應(yīng)的抗體或抗原。當(dāng)前第7頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2、比例性比例性（proportionality）是指抗原與抗體特異性結(jié)合反應(yīng)時(shí)，生成肉眼可見(jiàn)結(jié)合物的量與反應(yīng)物濃度的關(guān)系，只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時(shí)，才出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。抗原抗體分子比例合適的范圍，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價(jià)帶。在此范圍抗原抗體結(jié)合充分，沉淀物形成得快而多。當(dāng)前第8頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)在等價(jià)帶的前后，由于抗體和抗原的過(guò)量，上清液中可測(cè)出游離的抗體或抗原，形成的沉淀物少。當(dāng)抗體過(guò)量時(shí)，稱為前帶，抗原過(guò)量時(shí)稱為后帶。因此，在抗原抗體反應(yīng)的試驗(yàn)中，如果沒(méi)有產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的抗原抗體復(fù)合物出現(xiàn)，一方面要考慮是否有抗原與相應(yīng)的抗體存在，另一方面還必須注意到兩者反應(yīng)的比例是否適當(dāng)。當(dāng)前第9頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)3、可逆性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性稱為抗原抗體結(jié)合的可逆性（reversibility）。由于抗原抗體的結(jié)合是分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合，故形成的復(fù)合物是不牢固的，在一定的條件下可以解離，所以說(shuō)抗原抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。當(dāng)前第10頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)抗原抗體復(fù)合物解離取決于兩方面的因素：一是抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親和力；二是環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響。親和力高的抗體與抗原表位在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不容易解離，反之，親和力低的抗體與抗原形成的復(fù)合物較易解離。環(huán)境因素中的過(guò)高或過(guò)低均可破壞離子間的靜電引力，使抗原抗體的結(jié)合力下降。增加離子強(qiáng)度，也可使靜電引力消失，降低抗原抗體的結(jié)合力，促使其解離。解離后的抗原和抗體仍然保持游離抗原、抗體的生物活性。當(dāng)前第11頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（三）影響抗原抗體反應(yīng)的因素影響抗原抗體反應(yīng)的因素較多，主要有兩方面：一是反應(yīng)物自身的因素，另一方面是反應(yīng)環(huán)境的因素。當(dāng)前第12頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)1、反應(yīng)物自身因素（1）抗原抗原的理化性狀、表面抗原決定簇的種類和數(shù)目均可影響抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果。如顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后產(chǎn)生凝集現(xiàn)象；可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象；單價(jià)抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后不出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。當(dāng)前第13頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（2）抗體①來(lái)源來(lái)源于不同動(dòng)物的免疫血清，其反應(yīng)性有差異。家兔等大多數(shù)動(dòng)物的免疫血清，由于具有較寬的等價(jià)帶，與相應(yīng)抗原結(jié)合易出現(xiàn)可見(jiàn)的抗原抗體復(fù)合物。馬、人的免疫血清等價(jià)帶窄，抗原不足或過(guò)剩，均易形成可溶性復(fù)合物。單克隆抗體一般不適合用于凝集和沉淀反應(yīng)。當(dāng)前第14頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)②濃度抗體的濃度往往是與抗原相對(duì)而言，二者合適的濃度才易出現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)結(jié)果。③特異性和親和力特異性與親和力是影響抗原抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素，它們共同影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確程度。診斷試劑應(yīng)盡可能選高特異性、高親和力的抗體，才能提高試驗(yàn)的可靠性。當(dāng)前第15頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2、反應(yīng)的環(huán)境條件（1）電解質(zhì)抗原抗體結(jié)合后，由親水性向疏水性轉(zhuǎn)換過(guò)程中必須要有電解質(zhì)參與才能進(jìn)一步使抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，破壞水化層，使復(fù)合物相互靠攏聚集，形成大塊凝集、沉淀。若無(wú)電解質(zhì)存在，則不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。在抗原抗體反應(yīng)中，通常使用0.85%NaCl溶液或各種緩沖液作抗原抗體的稀釋液及反應(yīng)液。當(dāng)前第16頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（2）酸堿度抗原抗體反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行，pH過(guò)低或過(guò)高都會(huì)影響抗原抗體的反應(yīng)。抗原抗體反應(yīng)中一般以pH6～9為宜。有補(bǔ)體參與的反應(yīng)pH為7.2～7.4，超過(guò)這個(gè)范圍會(huì)降低補(bǔ)體的酶活性而影響反應(yīng)。當(dāng)前第17頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（3）溫度抗原抗體反應(yīng)需要合適的溫度才有利于二者結(jié)合。一般以15～40℃為宜，最適溫度為37℃。在此范圍內(nèi)，溫度越高，抗原抗體分子運(yùn)動(dòng)越快，碰撞接觸機(jī)會(huì)越多，兩者結(jié)合反應(yīng)速度越快。但是如果溫度高于56℃，會(huì)導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物解離，甚至分子變性。溫度越低，反應(yīng)速度越緩慢，但抗原抗體結(jié)合越牢固，易于觀察。當(dāng)前第18頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（4）振蕩在抗原抗體反應(yīng)中，適當(dāng)?shù)恼駬u可促使抗原抗體分子的接觸，加速其反應(yīng)。當(dāng)前第19頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（四）抗原抗體反應(yīng)的類型隨著免疫學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，在原有經(jīng)典免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法基礎(chǔ)上，新的免疫學(xué)測(cè)定方法不斷出現(xiàn)，使免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)更特異、更敏感和更穩(wěn)定。目前根據(jù)抗原和抗體的性質(zhì)不同，反應(yīng)出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果的不同，以及反應(yīng)時(shí)參與的其他條件不同，將抗原抗體反應(yīng)分為五種類型。當(dāng)前第20頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（1）可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的沉淀反應(yīng)；（2）顆?？乖c相應(yīng)抗體結(jié)合發(fā)生的凝集反應(yīng)；（3）抗原抗體結(jié)合后激活補(bǔ)體所產(chǎn)生的溶細(xì)胞反應(yīng)；（4）細(xì)菌外毒素或病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合所致的中和反應(yīng)；（5）標(biāo)記免疫的抗原抗體反應(yīng)。每種反應(yīng)類型都包括若干實(shí)驗(yàn)技術(shù)。（見(jiàn)抗原抗體反列應(yīng)表1）當(dāng)前第21頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)表1抗原抗體反應(yīng)的類型和試驗(yàn)方法----------------------------------------------------------------------------------------反應(yīng)類型 實(shí)驗(yàn)方法 結(jié)果判斷---------------------------------------------------------------------------------------沉淀反應(yīng) 液相沉淀實(shí)驗(yàn) 觀察沉淀、檢測(cè)濁度 瓊脂凝膠擴(kuò)散 觀察和測(cè)定掃描沉淀線或環(huán) 凝膠電泳技術(shù) 觀察和測(cè)定掃描沉淀峰弧等凝集反應(yīng) 直接凝集實(shí)驗(yàn) 用裸眼、放大鏡或顯微鏡觀察紅細(xì)胞或膠乳顆粒的凝集現(xiàn)象 間接凝集實(shí)驗(yàn) 同上 凝集抑制實(shí)驗(yàn) 同上 協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn) 同上 抗球蛋白實(shí)驗(yàn) 同上---------------------------------------------------------------------------------------當(dāng)前第22頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)----------------------------------------------------------------------------------------補(bǔ)體參與反應(yīng) 補(bǔ)體溶血實(shí)驗(yàn)以裸眼或光電比色儀觀察測(cè)定溶血現(xiàn)象 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 同上中和反應(yīng) 病毒中和實(shí)驗(yàn) 病毒感染性喪失 毒素中和實(shí)驗(yàn) 外毒素毒性丟失標(biāo)記免疫 熒光免疫技術(shù) 檢測(cè)熒光 放射免疫技術(shù) 檢測(cè)放射性 酶標(biāo)免疫檢測(cè)酶底物顯色、發(fā)光、熒光 發(fā)光免疫技術(shù) 檢測(cè)發(fā)光 金標(biāo)免疫技術(shù) 觀察金顆沉淀線---------------------------------------------------------------------------------------當(dāng)前第23頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)二、免疫學(xué)檢驗(yàn)方法和應(yīng)用（一）凝集反應(yīng)顆粒性抗原或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，與相應(yīng)抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)。凝集試驗(yàn)應(yīng)用廣而且敏感度高，方法簡(jiǎn)便，迄今已成為通用的免疫學(xué)技術(shù)之一，廣泛用于細(xì)菌的鑒定和分型、抗原分析、測(cè)定抗體和診斷疾病等臨床檢驗(yàn)。在免疫檢驗(yàn)技術(shù)中，根據(jù)參與反應(yīng)的顆粒的不同，把凝集反應(yīng)分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)。而自身紅細(xì)胞凝集反應(yīng)試驗(yàn)和抗球蛋白參與的凝集試驗(yàn)是兩種特殊的凝集反應(yīng)。當(dāng)前第24頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)1、直接凝集反應(yīng)：細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體反應(yīng)，當(dāng)二者比例適當(dāng)時(shí)，出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應(yīng)。反應(yīng)中的抗原稱為凝集原，參與反應(yīng)的抗體稱為凝集素。常用的凝集試驗(yàn)有玻片法、試管法和微量血凝反應(yīng)板法。當(dāng)前第25頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（1）玻片凝集試驗(yàn)：多用于定性。用以知抗體診斷血清與受檢菌液在玻片上混勻，放置數(shù)分鐘后如抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)即出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。如沙門菌玻片凝集試驗(yàn)。（2）試管凝集試驗(yàn)：多用于半定量和定量試驗(yàn)，常用已知一定量的抗原（細(xì)菌、細(xì)胞等）與一系列稀釋的病人血清混合，在保溫放置后觀察結(jié)果，判定受檢血清有無(wú)相應(yīng)抗體以及效價(jià)，如肥達(dá)反應(yīng)。當(dāng)前第26頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2、間接凝集反應(yīng)：將可溶性抗原（或抗體）先吸附或偶聯(lián)與免疫無(wú)關(guān)大小適當(dāng)?shù)念w粒表面，使之成為致敏載體顆粒，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在條件下，出現(xiàn)特異性的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。其敏感度比直接凝集反應(yīng)高2～8倍，亦明顯高于沉淀反應(yīng)。在臨床上廣泛用于各種抗體和可溶性抗原的檢測(cè)。間接凝集反應(yīng)試驗(yàn)可分為：當(dāng)前第27頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（1）間接凝集試驗(yàn)：用抗原致敏載體以檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體。將可溶性抗原與載體顆粒結(jié)合，再與樣品中的抗體反應(yīng)，形成肉眼可見(jiàn)的凝集顆?；蚰瘔K者為陽(yáng)性。當(dāng)前第28頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（2）反向間接凝集試驗(yàn)：用已知特異性抗體致敏載體以檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗原。臨床上用于檢測(cè)HbsAg、AFP等。當(dāng)前第29頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（3）間接抑制試驗(yàn)：試劑為已知抗原致敏的顆粒載體和相應(yīng)的抗體，用于檢測(cè)標(biāo)本中與致敏抗原相同的抗原。檢測(cè)方法是將標(biāo)本與抗體試劑混合反應(yīng)，然后加入致敏載體，若出現(xiàn)凝集，說(shuō)明標(biāo)本中不存在相應(yīng)抗原，抗體試劑未被結(jié)合，仍與載體上的抗原反應(yīng)；如未出現(xiàn)凝集，則說(shuō)明標(biāo)本中含有相應(yīng)抗原，凝集反應(yīng)被抑制。當(dāng)前第30頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（4）協(xié)同凝集試驗(yàn)：其原理同反向間接凝集試驗(yàn)，但所用的載體是金黃色葡萄球菌，其細(xì)胞壁中有A蛋白（SPA），SPA具有能與特異性抗體IgG的Fc段結(jié)合的特性。當(dāng)這種葡萄球菌與IgG抗體連接時(shí)，就成為抗體致敏的顆粒載體，若與相應(yīng)抗原接觸，就會(huì)出現(xiàn)反向間接凝集反應(yīng)，常用于細(xì)菌、病毒、毒素及可溶性抗原的快速檢測(cè)。當(dāng)前第31頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)①間接血凝試驗(yàn)：是以紅細(xì)胞作為載體的間接凝集試驗(yàn)?？筛鶕?jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽(yáng)性反應(yīng)的強(qiáng)弱。在臨床檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，是經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)之一。②膠乳凝集試驗(yàn)：是以聚苯乙烯膠乳微粒為載體的間接凝集試驗(yàn)。③明膠凝集試驗(yàn)：即以明膠顆粒為載體的間接凝集試驗(yàn)。常用于血清中抗病毒抗體的檢測(cè)。當(dāng)前第32頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)

間接凝集試驗(yàn)的應(yīng)用間接凝集試驗(yàn)具有敏感、快速、操作簡(jiǎn)便和不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，既可以檢測(cè)抗原，又可以檢測(cè)抗體。已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。特別是對(duì)某些疾病的診斷治療和效果的觀察有著重要的參考價(jià)值。當(dāng)前第33頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（1）抗體的檢測(cè)用于檢測(cè)微生物、寄生蟲(chóng)等感染所產(chǎn)生的抗體及自身抗體和藥物抗體。如檢測(cè)沙門菌抗體和類風(fēng)濕因子等。（2）抗原的檢測(cè)用于在臨床上用反向間接凝集試驗(yàn)檢測(cè)甲胎蛋白抗原和乙型肝炎病毒流行病學(xué)調(diào)查。在婦產(chǎn)科常用膠乳凝集試驗(yàn)檢測(cè)孕婦尿中的絨毛膜促性腺激素（HCG）抗原。以診斷早期妊娠。當(dāng)前第34頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（二）沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)是可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下發(fā)生特異性結(jié)合而產(chǎn)生沉淀的現(xiàn)象。沉淀反應(yīng)中的抗原多為蛋白質(zhì)、多糖等可溶性物質(zhì)?？乖c相應(yīng)抗體再介質(zhì)中或固相表面發(fā)生特異性結(jié)合，可分為兩個(gè)階段，第一階段為抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，在幾秒或幾十秒內(nèi)就可完成，出現(xiàn)可溶性小附和物，十分快速，但肉眼不可見(jiàn)。在免疫比濁法中可以測(cè)定免疫復(fù)合物形成的速率，稱為速率比濁法。第二階段則形成大的可見(jiàn)的免疫復(fù)合物，需要幾十分鐘到數(shù)小時(shí)才能完成。如沉淀線或沉淀環(huán)。沉淀反應(yīng)的常用試驗(yàn)方法有：當(dāng)前第35頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)1、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（1）絮狀沉淀試驗(yàn)：將抗原和抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在下，抗原與抗體結(jié)合形成絮狀沉淀物。（2）免疫濁度測(cè)定：是將光學(xué)測(cè)量?jī)x器與分析檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，對(duì)各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物及其它小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定的方法。當(dāng)前第36頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)其原理是：當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)比例結(jié)合時(shí)，在特殊緩沖液中快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。采用透射比濁或散射比濁的方法，根據(jù)所測(cè)的吸光度值可推算出待測(cè)抗原的量。免疫濁度測(cè)定又可分為速率比濁法和終點(diǎn)比濁法。其優(yōu)點(diǎn)是可以準(zhǔn)確定量，校正曲線比較穩(wěn)定，簡(jiǎn)便快捷，無(wú)污染，易于自動(dòng)化，也適合于大批量標(biāo)本的檢測(cè)，在臨床檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用。當(dāng)前第37頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)：利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原抗體濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢?jiàn)的沉淀線或沉淀環(huán)。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的方式和特性，發(fā)展為以下幾種實(shí)驗(yàn)技術(shù)：（1）單向擴(kuò)散試驗(yàn)：在瓊脂凝膠中混入一定量的抗體，使待測(cè)抗原溶液從局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見(jiàn)的沉淀環(huán)。當(dāng)前第38頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（2）雙向擴(kuò)散試驗(yàn)：在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在最適當(dāng)?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線，觀察沉淀線的位置、形狀及對(duì)比關(guān)系，可作抗原和抗體的定性分析。（3）免疫電泳技術(shù)：是將瓊脂內(nèi)電泳與免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一種常用的一種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。有對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、交叉免疫電泳、免疫電泳、固相免疫電泳等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。當(dāng)前第39頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（三）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：是經(jīng)典途徑的抗原抗體反應(yīng)之一，應(yīng)用綿羊紅細(xì)胞和溶血?jiǎng)┳髦甘緞⒘藱z測(cè)抗原抗體與補(bǔ)體結(jié)合的方法，如檢測(cè)梅毒的華氏試驗(yàn)（現(xiàn)已被淘汰）。凡是能激活補(bǔ)體的IgG、IgM類抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合的反應(yīng)都可以用本法檢測(cè)。目前主要用于病毒性傳染病診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及一些自身抗體、腫瘤相關(guān)抗原等的檢測(cè)。當(dāng)前第40頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（四）免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是將多種可以微量或超微量檢測(cè)的示蹤物（如熒光素、放射性核素、酶、化學(xué)或生物發(fā)光劑）對(duì)抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，制成標(biāo)記物，加入抗原抗體反應(yīng)體系中與相應(yīng)未標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行反應(yīng)，使免疫反應(yīng)結(jié)果可被靈敏地進(jìn)行分析測(cè)定?？梢圆粶y(cè)定免疫復(fù)合物本身，僅對(duì)其中的標(biāo)記物進(jìn)行測(cè)定就可確定待測(cè)物質(zhì)的含量。因此，免疫標(biāo)記技術(shù)具有高度特異性和高度敏感性，由于它具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、操作簡(jiǎn)便、易于商品化和自動(dòng)化的特點(diǎn)，現(xiàn)已發(fā)展成為生物活性物質(zhì)分析重要的方法之一。當(dāng)前第41頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)1、放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)是利用放射性核素的靈敏性和精確性與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合而創(chuàng)建的一類免疫測(cè)定技術(shù)。常用的放射性核素有125I和131I等，主要有兩種基本類型：（1）放射免疫分析：是最經(jīng)典的模式，是以放射性核素標(biāo)記的抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記的抗原競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體為基本原理來(lái)測(cè)定抗原含量的分析方法。（2）免疫放射分析：是用放射性核素標(biāo)記的過(guò)量抗體方法?？贵w與待測(cè)抗原直接結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離結(jié)合與游離標(biāo)記抗體的非競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析。當(dāng)前第42頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)放射免疫技術(shù)由于其測(cè)定的靈敏度高，特異性強(qiáng)、精密度好，而且可對(duì)抗原和半抗原進(jìn)行測(cè)定，對(duì)儀器設(shè)備條件要求不高，所以廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。其缺點(diǎn)是：放射性污染和危害；常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期短、不易快速及自動(dòng)化檢驗(yàn)等，已逐步被其它標(biāo)記免疫分析方法所取代。當(dāng)前第43頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2、熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)是將免疫學(xué)反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來(lái)的一種方法，是最早發(fā)展的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。其原理是利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本的待測(cè)抗原特異性地結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，透過(guò)濾光板發(fā)出一定波長(zhǎng)的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，然后借助熒光顯微鏡觀察底物片上的熒光染色形態(tài)，判斷待測(cè)抗原或抗體。當(dāng)前第44頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)熒光免疫技術(shù)在臨床檢驗(yàn)上常用作細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)的檢驗(yàn)以及自身抗體的檢測(cè)。免疫熒光間接染色法可用于測(cè)定血清中的抗體，如免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的檢測(cè)是梅毒特異性診斷方法之一。間接免疫熒光試驗(yàn)是當(dāng)前公認(rèn)的最有效的檢測(cè)瘧疾抗體的方法。當(dāng)前第45頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)3、酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)是經(jīng)典標(biāo)記免疫技術(shù)之一，是以酶標(biāo)記抗體或抗原為主要試劑的一種標(biāo)記免疫分析技術(shù)。酶免疫技術(shù)是利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用，提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)檢測(cè)敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。臨床常用的酶免疫技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（見(jiàn)第三章第3節(jié)）當(dāng)前第46頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)酶免疫測(cè)定除具有高度的敏感性和特異性，酶標(biāo)記試劑比較穩(wěn)定，而且易與其他相關(guān)技術(shù)偶聯(lián)，因此發(fā)展迅速。市場(chǎng)上各種符合質(zhì)量要求的商品試劑盒（提供有包被好的的固相載體、酶標(biāo)記物及其底物和洗滌液等全套試劑成分）和自動(dòng)或半自動(dòng)檢測(cè)儀上不斷研究發(fā)明問(wèn)世，極大地促進(jìn)了酶免疫測(cè)定技術(shù)的普及。特別是固相載體酶免疫技術(shù)與膠體金技術(shù)等的結(jié)合，使市場(chǎng)上出現(xiàn)了一大批適用于家庭及床旁檢測(cè)的快速試劑盒，大大方便了人群的自我保健和臨床的快速診斷。ELISA則應(yīng)用更為廣泛，幾乎所有的可溶性抗原抗體系統(tǒng)均可用以檢測(cè)。當(dāng)前第47頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)該技術(shù)的檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好，酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便安全易行，而且容易與其他技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法等。因此，酶免疫技術(shù)在方法學(xué)上的研究重點(diǎn)除與其他標(biāo)記免疫技術(shù)一樣需制備高純度抗原和高親和力的特異性抗體外，還包括：選擇高活性的純化標(biāo)記用酶；試驗(yàn)有效的交聯(lián)試劑和交聯(lián)反應(yīng)，制備高質(zhì)量的酶標(biāo)記物；選用適宜的酶作用底物系統(tǒng)；確定有效的分離結(jié)合/游離反應(yīng)物的方法；篩選操作步驟以及研究自動(dòng)化測(cè)定技術(shù)等。當(dāng)前第48頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)4、金標(biāo)免疫技術(shù)是以膠體金為標(biāo)記物的免疫標(biāo)記技術(shù)。（見(jiàn)第三章第4節(jié)）當(dāng)前第49頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)第二節(jié)

免疫膠乳試驗(yàn)及應(yīng)用

當(dāng)前第50頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)一、膠乳凝集試驗(yàn)原理及方法（一）原理：膠乳凝集試驗(yàn)是以聚苯乙烯膠乳顆粒為載體的間接凝集試驗(yàn)。使用抗原或抗體致敏膠乳顆粒，再用此致敏膠乳檢測(cè)相應(yīng)的抗體或抗原。膠乳凝集試驗(yàn)所用的膠乳顆粒是人工合成的載體，均一性較好，性能比紅細(xì)胞穩(wěn)定，但與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力及凝集性能不如紅細(xì)胞，因此膠乳凝集試驗(yàn)敏感性不如血凝試驗(yàn)。當(dāng)前第51頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（二）

試驗(yàn)方法：1、膠乳凝集試驗(yàn)：在反應(yīng)板的一格中，先加受檢標(biāo)本一滴，再加致敏膠乳一滴，連續(xù)搖動(dòng)2～3min觀察結(jié)果。膠乳凝集者為陽(yáng)性。不凝集者為陰性。同時(shí)作陰、陽(yáng)性對(duì)照。2、膠乳凝集抑制試驗(yàn)：先加受檢標(biāo)本一滴，再加一滴相應(yīng)抗血清混勻，再加一滴致敏膠乳抗原，連續(xù)搖動(dòng)2～3min觀察結(jié)果。膠乳凝集者為陰性，不凝集者為陽(yáng)性。當(dāng)前第52頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（三）

注意事項(xiàng)：1、受檢標(biāo)本和試劑的加入順序應(yīng)遵照規(guī)定的步驟，否則無(wú)法判定結(jié)果。2、試劑一般保存在4～6℃較為適宜，膠乳試劑不能冷凍，試驗(yàn)前取出待接近室溫時(shí)的溫度再使用。3、此試驗(yàn)一般作定性檢測(cè)，嚴(yán)格的操作也能達(dá)到半定量的要求。滴加標(biāo)本和試劑時(shí)，液滴大小應(yīng)均勻一致，每滴約50μl。當(dāng)前第53頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)二、抗鏈球菌溶血素“O”的測(cè)定（一）試驗(yàn)原理：在受檢者血清標(biāo)本中，加入適量的溶血素“O”。如標(biāo)本中含有高單位抗體，中和后則有多余的抗體存在，與溶血素“O”致敏的膠乳試劑反應(yīng)，可出現(xiàn)清晰而均勻的凝集顆粒。當(dāng)前第54頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（二）

試驗(yàn)步驟：1、將溶血素“O”貯存液用生理鹽水稀釋到每ml含5和2.5結(jié)合單位的兩種了應(yīng)用液。2、血清標(biāo)本56℃30min滅活后用生理鹽水作1：50稀釋。3、在膠乳試驗(yàn)反應(yīng)板上滴入稀釋血清標(biāo)本1滴，再滴加2.5結(jié)合單位應(yīng)用液1滴，輕輕搖動(dòng)3min，使其均勻。4、滴加ASO膠乳1滴，輕輕搖動(dòng)8min，有清晰凝集者為陽(yáng)性。5、將陽(yáng)性血清用5結(jié)合單位應(yīng)用液重復(fù)試驗(yàn)，有清晰凝集者為強(qiáng)陽(yáng)性。當(dāng)前第55頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（三）

臨床意義1、陰性者≤250u，陽(yáng)性者ASO在330～500u，強(qiáng)陽(yáng)性者ASO在625u以上。2、正常健康人ASO水平隨地區(qū)、年齡、氣候、季節(jié)、環(huán)境條件不同而異，通常成人在250u以內(nèi)，3歲以下兒童在100u以內(nèi)者均屬正常。3、A群溶血性鏈球菌感染后，80%～85%的患者ASO升高。3～5周達(dá)最高值，兩個(gè)月后開(kāi)始下降，6～12個(gè)月恢復(fù)到正常水平。用于診斷急性風(fēng)濕熱和慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。當(dāng)前第56頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（四）注意事項(xiàng)：1、患者標(biāo)本應(yīng)新鮮，如被細(xì)菌污染或嚴(yán)重溶血者，可影響結(jié)果，引起假陽(yáng)性。2、高血脂標(biāo)本，試管或試劑被膽固醇污染均可出現(xiàn)假陽(yáng)性。3、所用器具應(yīng)清潔，取量要準(zhǔn)確。當(dāng)前第57頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)4、溶血素“O”單位標(biāo)定不準(zhǔn)，常可影響結(jié)果。每次試驗(yàn)應(yīng)取一個(gè)已知的ASO單位的標(biāo)本為對(duì)照，如出現(xiàn)偏高或偏低的結(jié)果，應(yīng)重新測(cè)定溶血素“O”的結(jié)合量。5、鏈球菌溶血素“O”在pH6.5時(shí)活性最強(qiáng)，偏酸或偏堿均可影響結(jié)果。6、膠乳試劑不可冰凍，放置4℃冰箱可保存一年。不同膠乳商品試劑有不同要求，操作前應(yīng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。當(dāng)前第58頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)三、類風(fēng)濕因子RF的檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是由自身抗體-免疫復(fù)合物引起的自身免疫性疾病。多發(fā)于青壯年，女性多于男性?；颊哂捎诟腥尽⒀装Y等原因產(chǎn)生了變性IgG。變性IgG成為自身抗原，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了各種抗變性IgG抗體，即類風(fēng)濕因子RF。變性IgG與類風(fēng)濕因子結(jié)合，形成中等大小的免疫復(fù)合物，沉積于關(guān)節(jié)等部位，激活補(bǔ)體，引起慢性漸進(jìn)性免疫炎癥性損害，嚴(yán)重時(shí)可累及心、肺和血管等，免疫學(xué)檢查血清和關(guān)節(jié)滑膜液中出現(xiàn)類風(fēng)濕因子。當(dāng)前第59頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（一）試驗(yàn)原理：膠乳凝集法，將熱凝聚IgG包被于聚苯乙烯膠乳顆粒表面，如待測(cè)血清中含有RF，與相應(yīng)抗原結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。（二）試驗(yàn)步驟：按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，待測(cè)血清預(yù)先56℃30min滅活，再用0.1mol/L，pH8.2甘氨酸緩沖液作1：20～1：80稀釋，取各稀釋度血清一滴，加于反應(yīng)板上，滴加RF膠乳試劑一滴，充分混勻并輕輕搖動(dòng)反應(yīng)板，3min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽(yáng)性，當(dāng)前第60頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（三）臨床意義正常人用本法檢測(cè)常為陰性。陽(yáng)性主要見(jiàn)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。另外，干燥綜合征、冷球蛋白血癥、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、肝硬化、慢性肝炎等疾病也可陽(yáng)性。因此RF對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者并不具有嚴(yán)格的特異性，RF陽(yáng)性不能作為診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的惟一標(biāo)準(zhǔn)。盡管在多種疾病RF可陽(yáng)性，但是滴度均較低，隨RF滴度增加。對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷特異性也增高。多種疾病RF測(cè)定陽(yáng)性率如表2。當(dāng)前第61頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)表2多種疾病RF測(cè)定陽(yáng)性率-----------------------------------------------疾病RF測(cè)定陽(yáng)性率-----------------------------------------------類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎79.6%系統(tǒng)性紅斑狼瘡30%干燥綜合征95%皮肌炎80%硬皮病80%混合性結(jié)締組織病25%-----------------------------------------------當(dāng)前第62頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)注意事項(xiàng)：本法檢測(cè)出陽(yáng)性主要為IgM類RF，陽(yáng)性血清可連續(xù)雙倍稀釋測(cè)效價(jià)。每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。其它見(jiàn)膠乳凝集法注意事項(xiàng)。當(dāng)前第63頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)第三節(jié)

酶聯(lián)免疫技術(shù)及應(yīng)用

當(dāng)前第64頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)一、酶免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原為主要試劑的方法，是標(biāo)記免疫技術(shù)中使用最廣泛的一種方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、酶標(biāo)記物有效期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。當(dāng)前第65頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（一）原理和分類酶是催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)，它具有高效性和專一性的特點(diǎn)。酶免疫分析技術(shù)是將酶的催化放大作用和抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合的一種微量分析技術(shù)。酶標(biāo)記抗原或抗體后，既不影響抗原或抗體免疫反應(yīng)的特異性，也不改變酶本身的活性。免疫反應(yīng)進(jìn)行以后，酶還能催化相應(yīng)的底物顯色，最后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)顏色的深淺來(lái)進(jìn)行定性或定量分析。顯色反應(yīng)顯示酶的存在，表示結(jié)合或游離的酶標(biāo)抗原或抗體的量的變化。當(dāng)前第66頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)根據(jù)反應(yīng)過(guò)程中是否將結(jié)合的酶標(biāo)記物和游離的酶標(biāo)記物分離，把酶免疫分析技術(shù)分為兩類：非均相酶免疫測(cè)定和均相酶免疫測(cè)定。非均相酶免疫測(cè)定抗原抗體反應(yīng)平衡后，將游離的酶標(biāo)記物和與抗原抗體結(jié)合的酶標(biāo)記物分離開(kāi)，再通過(guò)底物顯色進(jìn)行測(cè)定。其代表技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。而均相酶免疫測(cè)定由于免疫反應(yīng)后酶活性的改變，不需將游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物分開(kāi)。主要用于小分子物質(zhì)的測(cè)定。當(dāng)前第67頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（三）常用的標(biāo)記酶和底物（1）辣根過(guò)氧化物酶（HRP）其分子量較小，溶解性好，易于提取，來(lái)源廣泛；酶和酶標(biāo)記物性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱、耐有機(jī)溶劑作用，易于保存，價(jià)格低廉；易于標(biāo)記，標(biāo)記后活性損失很小。因此HRP是ELISA中應(yīng)用最廣的標(biāo)記用酶。當(dāng)前第68頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)HRP底物種類很多，主要有鄰苯二胺（OPD）和四甲基聯(lián)苯胺（TMB），前者由于顯色不穩(wěn)定，對(duì)機(jī)體有一定致癌性，已逐漸被TMB所替代。（2）堿性磷酸酶（ALP）和酶底物（3）β-半乳糖苷酶（β-Gal）和酶底物，常用于均相免疫測(cè)定。當(dāng)前第69頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（四）固相載體除均相酶免疫測(cè)定外，各種酶免疫測(cè)定最后都需要分離結(jié)合的酶標(biāo)記物和游離的酶標(biāo)記物。固相抗體（抗原）是最有效和簡(jiǎn)便的分離方法，因此抗體（抗原）固相載體是固相酶免疫測(cè)定必不可少的組成成分。當(dāng)前第70頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（1）塑料制品：抗體或蛋白質(zhì)抗原可通過(guò)非共價(jià)或物理吸附機(jī)制結(jié)合到塑料制品表面，材料經(jīng)濟(jì)、方法簡(jiǎn)便，目前，聚苯乙烯微量反應(yīng)板是ELISA常用的固相載體。（2）免疫微球：由聚苯乙烯材料制成的塑料微球或顆粒，其直徑常為微米或毫米，塑料微球與抗原或抗體偶聯(lián)后，結(jié)合容量大，可以均勻地分散到整個(gè)溶液中，極大地增加了反應(yīng)面積，因此反應(yīng)速度快，洗滌、分離也方便。當(dāng)前第71頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（3）微孔濾膜載體：是一種多孔性薄膜過(guò)濾材料，如醋酸纖維素膜、玻璃纖維素膜和尼龍膜等。廣泛應(yīng)用于定性或半定量斑點(diǎn)ELISA、免疫金標(biāo)滲濾試驗(yàn)等。當(dāng)前第72頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（五）免疫吸附劑是指于固相載體結(jié)合的抗原或抗體。將抗原或抗體固相化的過(guò)程稱為包被。目前廣泛使用的聚苯乙烯固相載體多采用吸附方式包被抗原或抗體。

當(dāng)前第73頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（一）原理和類型酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）就是以酶作為標(biāo)記物、以免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定方法。ELISA測(cè)定試劑主要包括固相包被的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和酶反應(yīng)的底物等。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體保持其免疫學(xué)活性，抗原或抗體的酶結(jié)合物既保留其免疫學(xué)活性，有保留酶的活性。當(dāng)前第74頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)在測(cè)定過(guò)程中，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)在固相支持物上進(jìn)行，用洗滌的方法使固相載體形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分離，反應(yīng)結(jié)果是以酶與底物作用后顯色來(lái)判斷的。顯色的深淺與臨床標(biāo)本中待測(cè)物的濃度成正比或反比關(guān)系。所以可以根據(jù)顯色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，可極大地放大反應(yīng)結(jié)果，從而使檢測(cè)方法達(dá)到很高的敏感度。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型：當(dāng)前第75頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)1、雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下：（1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合抗體及雜質(zhì)。（2）加待測(cè)標(biāo)本，與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，標(biāo)本讓中的抗原與固相抗體結(jié)合（孵育），形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其它未結(jié)合物質(zhì)。當(dāng)前第76頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（3）加酶標(biāo)抗體。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合（孵育）。形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)，固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中待測(cè)抗原的量相關(guān)。（4）加底物顯色。復(fù)合物上的酶催化底物生成有色產(chǎn)物根據(jù)顯色的深淺可進(jìn)行該抗原的定性或定量（酶標(biāo)儀比色或比濁）。當(dāng)前第77頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)在臨床檢驗(yàn)中，雙抗體夾心法適用于檢測(cè)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HbsAg）、甲胎蛋白（AFP）、絨毛膜促性腺激素（HCG）等。不能用于半抗原等小分子的測(cè)定。當(dāng)前第78頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2、間接法測(cè)抗體間接法是檢測(cè)抗體常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（即酶標(biāo)二抗）檢測(cè)已與固相抗原結(jié)合受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：（1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合抗原及雜質(zhì)（2）加稀釋的受檢血清。血清中的特異性抗體與固相抗原結(jié)合（孵育），形成固相抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下抗原抗體復(fù)合物。其它免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過(guò)程中被洗去。當(dāng)前第79頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（3）加酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白（酶標(biāo)抗抗體）。它與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合（孵育），形成固相抗原-受檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，從而使該抗體間接標(biāo)記上酶。清洗后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中待測(cè)特異性抗體的量相關(guān)。（4）加底物顯色。顯色的深淺與標(biāo)本中待測(cè)特異性抗體的量相關(guān)（比色或比濁）。當(dāng)前第80頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)此法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)來(lái)進(jìn)行傳染病的診斷。主要缺點(diǎn)是待測(cè)標(biāo)本需要經(jīng)過(guò)稀釋后才能進(jìn)行測(cè)定，否則血清中高濃度的非特異性IgG和其它干擾物質(zhì)回引起陰性本底過(guò)高，造成假陽(yáng)性。

當(dāng)前第81頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)3、雙抗原夾心法測(cè)抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原包被固相載體和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。此法待測(cè)標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，故其敏感度高于間接法。臨床檢驗(yàn)中，抗-HBs的檢測(cè)常用此法。當(dāng)前第82頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)4、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體其原理為待測(cè)標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中的抗體含量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體越少，因此，陽(yáng)性結(jié)果顯色程度要淺于陰性結(jié)果。如抗-HBc的檢測(cè)常用此法。當(dāng)前第83頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)5、捕獲法捕獲法（亦稱反向間接法）ELISA，主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測(cè)定。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體一般僅適用于檢測(cè)IgG型抗體，IgM型抗體的檢測(cè)用于傳染病的早期診斷，如果用競(jìng)爭(zhēng)法，即酶標(biāo)記的抗人IgM作為酶標(biāo)二抗進(jìn)行間接ELISA測(cè)定，這樣標(biāo)本中同時(shí)存在的不同濃度的IgG型抗體將與IgM抗體競(jìng)爭(zhēng)，使結(jié)合在固相抗原上的IgM抗體相應(yīng)減少。另外，標(biāo)本中如含有類風(fēng)濕因子，也會(huì)產(chǎn)生干擾。當(dāng)前第84頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)因此一般間接法測(cè)定IgM抗體不能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。而捕獲法是用抗人IgM抗體包被固相載體，以捕獲待測(cè)血清中的IgM，然后加入抗原，此抗原只于特異性的IgM結(jié)合，繼續(xù)加入酶標(biāo)記的特異性抗體，最后與底物作用，顯色深淺與標(biāo)本中特異性的IgM成正比。捕獲法常用于病毒性感染的早期診斷，如甲型肝炎病毒（HAV）IgM抗體的檢測(cè)。當(dāng)前第85頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)6、其他ELISA如應(yīng)用生物素-親和素放大系統(tǒng)的ELISA，利用酶催化底物發(fā)熒光的酶聯(lián)免疫熒光測(cè)定（ELFIA），以及酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光測(cè)定（ELICLA）等。新方法不僅進(jìn)一步提高了測(cè)定靈敏度、特異性，而且使ELISA技術(shù)在提高自動(dòng)化程度的同時(shí)，也便于單份樣本測(cè)定，尤其適用于急診、社區(qū)診所及家庭化驗(yàn)。當(dāng)前第86頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)第四節(jié)金標(biāo)記免疫分析技術(shù)

當(dāng)前第87頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)金標(biāo)記免疫分析技術(shù)是一種以膠體金作為示蹤物，用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，在20世紀(jì)70年代初期始創(chuàng)。由于膠體金能與多種生物大分子結(jié)合，已成為繼熒光素、放射性核素和酶之后在免疫標(biāo)記技術(shù)中常用的一種非放射性核素示蹤物。由于它使用簡(jiǎn)便、快速，所以已廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)工作中。膠體金與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）的結(jié)合物，又稱膠體金標(biāo)記物。當(dāng)前第88頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)一、膠體金的結(jié)構(gòu)膠體金是氯金酸在還原劑作用下，聚合成一定大小的金顆粒，并形成帶負(fù)電的疏水溶液，由于靜電作用而形成穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。二、膠體金的性狀（一）膠體金的穩(wěn)定性膠體金顆粒大小多在1～100nm，微小金顆粒均勻地、穩(wěn)定地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液，因而具有膠體的多種特性，特別是對(duì)電解質(zhì)的敏感性。當(dāng)前第89頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)（二）膠體金呈色性不同大小的膠體金呈色有一定的差別。最小的膠體金（2～5nm）是橙黃色的；中等大小的膠體金（10～20nm）是酒紅色的；較大顆粒的膠體金（30～80nm）則是紫紅色的。根據(jù)這一特點(diǎn)，用肉眼觀察膠體金的顏色可粗略估計(jì)金顆粒的大小。（三）

光吸收性膠體金在可見(jiàn)光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，這個(gè)吸收峰的波長(zhǎng)（λmax）在510～550nm范圍內(nèi)，隨膠體金顆粒大小而變化。當(dāng)前第90頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)三、膠體金免疫測(cè)定技術(shù)（一）斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)1、原理斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA）是以硝酸纖維素薄膜（NC膜）為固相載體，將抗體（或抗原）點(diǎn)加固定在上面，當(dāng)待測(cè)標(biāo)本滴加在膜上時(shí)，標(biāo)本中所含的抗原被膜上抗體捕獲，其后加入膠體金標(biāo)記的抗體，它與已結(jié)合在膜上的抗原發(fā)生反應(yīng)，形成固相抗體-抗原-膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物，因膠體金本身呈紅色，陽(yáng)性反應(yīng)即在膜中央顯示紅色斑點(diǎn)。當(dāng)前第91頁(yè)\共有102頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2、雙抗體夾心法操作和反應(yīng)步驟（1）將標(biāo)記有抗體濾膜片的扁平塑料小盒打開(kāi)，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，在塑料小孔內(nèi)滴加含待測(cè)抗原在標(biāo)本1～2滴，待完全滲入盒內(nèi)。（2）在小孔內(nèi)滴加膠體金標(biāo)記抗體試劑1～2滴，待完全滲入盒內(nèi)。（3）

在小孔內(nèi)滴加洗滌液2～3滴，待完全