重組DNA技術(shù)的基本工具課件-【高效備課精研+知識(shí)精講提升】 高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

第三章

基因工程人教版·選擇性必修3水母的綠色熒光蛋白基因基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因熒光魚(yú)基因的結(jié)構(gòu)和功能1.基因與DNA的關(guān)系？2.基因的基本單位是什么？基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段DNA平面結(jié)構(gòu)DNA立體結(jié)構(gòu)CH2

HOHHHHH堿基

磷酸

5’4’3’2’1’脫氧核苷酸記憶再挖掘3.基因的功能？?jī)?chǔ)存、傳遞、表達(dá)遺傳信息復(fù)制子代DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯控制蛋白質(zhì)合成復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯DNARNA逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制蛋白質(zhì)記憶再挖掘基因的結(jié)構(gòu)和功能◎科技探索之路：基因工程發(fā)展歷程P681944年艾弗里等人證明了DNA可以在同種生物的不同個(gè)體之間轉(zhuǎn)移。1950年埃特曼發(fā)明了一種測(cè)定氨基酸序列的方法。1958年梅塞爾森和斯塔爾用實(shí)驗(yàn)證明了DNA的半保留復(fù)制。1953年沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。1961年尼倫伯格和馬太破譯了第一個(gè)編碼氨基酸的密碼子。1967年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，并可以在細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。1970年科學(xué)家在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶（簡(jiǎn)稱限制酶）。20世紀(jì)70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)。1972年，伯格成功構(gòu)建了第一個(gè)體外重組DNA分子。1973年，證明質(zhì)粒可以作為基因工程的載體，構(gòu)建重組DNA，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使外源基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，基因工程正式問(wèn)世。1977年，桑格等科學(xué)家發(fā)明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成儀的問(wèn)世為體外合成DNA提供了方便。1982年，第一個(gè)基因工程藥物-重組人胰島素被批準(zhǔn)上市。1983年，科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。1984年，我國(guó)科學(xué)家朱作言領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)培育出世界上第一條轉(zhuǎn)基因魚(yú)。1985年，穆里斯等人發(fā)明了PCR。1990年，人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)。2003年完成21世紀(jì)以來(lái)，科學(xué)家發(fā)明了多種高通量測(cè)序技術(shù)，加速了人們對(duì)基因組序列的了解。2013年，華人科學(xué)家張鋒及其團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道利用最新的基因組編輯技術(shù)編輯了哺乳動(dòng)物基因組。該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換?！蚩萍继剿髦罚夯蚬こ贪l(fā)展歷程?P68指按照

,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)并通過(guò)

DNA重組和

等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的

。由于基因工程是在

上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作

。人們的愿望體外轉(zhuǎn)基因新的生物類型和生物產(chǎn)品DNA分子水平DNA重組技術(shù)◎科技探索之路：基因工程發(fā)展歷程基因工程P67基因工程的別名：操作環(huán)境：操作對(duì)象：操作水平：基本過(guò)程：原理：結(jié)果：重組DNA技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)

生物體外基因DNA分子水平剪切基因重組創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙、

改造生物性狀定向◎科技探索之路：基因工程發(fā)展歷程基因工程P67水母的綠色熒光蛋白基因1.以下有關(guān)基因工程的敘述，正確的是（）

A．基因工程是細(xì)胞水平上的生物工程B．基因工程的目的是獲得目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物C．基因工程產(chǎn)生的變異屬于人工誘變D．基因工程育種的優(yōu)點(diǎn)之一是可以定向地使生物產(chǎn)生可遺傳的變異D◎活學(xué)活用2.下列關(guān)于基因工程的敘述，不正確的是（）A．基因工程的原理主要是基因重組B．運(yùn)用基因工程技術(shù)，可使生物發(fā)生定向變異C．一種生物的基因轉(zhuǎn)接到另一種生物的DNA分子上，

屬于基因工程的內(nèi)容D．是非同源染色體上非等位基因的自由組合D◎活學(xué)活用第三章基因工程人教版·選擇性必修3重組DNA技術(shù)的基本工具第1節(jié)

普通棉花如何能培育出自身就能抵抗蟲(chóng)害的棉花新品種呢？轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉將蘇云金桿菌中的Bt抗蟲(chóng)蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉花

從社會(huì)中來(lái)

我國(guó)是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，棉花在種植過(guò)程中，常會(huì)受到一些蟲(chóng)害的侵襲，其中以棉鈴蟲(chóng)最為常見(jiàn)，它可以使棉花產(chǎn)量減少三分之一，甚至絕收。大量施用農(nóng)藥×

從社會(huì)中來(lái)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉基因工程誕生的理論基礎(chǔ)拼接的基礎(chǔ)1.DNA的基本組成單位

。表達(dá)的基礎(chǔ)2.都遵循

原則3.DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的

結(jié)構(gòu)1.基因是控制生物

的結(jié)構(gòu)與功能單位2.遺傳信息的傳遞都遵循

法則基因在空間上轉(zhuǎn)移并成功表達(dá)3.生物界共用

。（相同的遺傳信息在不同的生物體內(nèi)表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)）。DNA（基因）

轉(zhuǎn)錄翻譯mRNA蛋白質(zhì)基因工程相同（四種脫氧核苷酸）堿基互補(bǔ)配對(duì)雙螺旋中心一套遺傳密碼性狀資料：DNA雙螺旋的直徑只有2nm，對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門(mén)的“分子工具”?？茖W(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？

這些“分子工具”各具有什么特征呢？思考·討論：“分子運(yùn)輸車(chē)”“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）DNA連接酶基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體（如質(zhì)粒）基因工程（準(zhǔn)確切割DNA分子）（將DNA片段連接起來(lái)）（將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞）1.限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”①來(lái)源：主要是原核生物TACGGCATGCGCAT5′3′5′3′④作用特點(diǎn)：

能夠

雙鏈DNA分子的特定脫氧核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的

斷開(kāi)。②化學(xué)本質(zhì)：蛋白質(zhì)③種類：

數(shù)千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶）限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”一識(shí)別磷酸二酯鍵1.你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？2.為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？思考·討論：

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。

通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中不具備這種限制酶識(shí)別的特定核苷酸序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已被修飾切割外源DNA、使之失效，以保證自身安全一限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”一2.限制酶的識(shí)別序列

大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由

組成，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。思考·討論：中軸線

限制酶所識(shí)別的序列，呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱。無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向、對(duì)稱、重復(fù)排列的，稱為回文序列。想一想限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？一限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”一6個(gè)核苷酸

Sma

I限制酶只能識(shí)別

序列，切割

和

之間的

切開(kāi)，切割后產(chǎn)生

。3.限制酶的作用結(jié)果AGTCATTCGATAGGATCATCATAT

大腸桿菌(E.coli)的EcoRⅠ

限制酶能特異性識(shí)別_________序列，并切割___和___之間的____________，切割后產(chǎn)生__________。GAATTCGA磷酸二酯鍵黏性末端EcoRI限制酶SmaI限制酶CCCGGGCG磷酸二酯鍵平末端CCCGGGGGGCCCGGGCCCCCCGGG限制酶限制酶限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”一限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”一4.限制酶的命名

限制酶是用生物屬名的頭一個(gè)字母與種加詞的頭兩個(gè)字母，組成了三個(gè)字母的略語(yǔ)，以此來(lái)表示這個(gè)酶是從哪種生物中分離出來(lái)的。限制酶的命名是根據(jù)細(xì)菌種類而定，以EcoRI為例:

E：Escherichia

（屬名）

co：coli

（種加詞）

R：RY13（品系）

I：首先發(fā)現(xiàn)在此類細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的順序EcoRⅠ：大腸桿菌（Escherichiacoli）R型菌株中分離出的第一個(gè)限制酶；SmaⅠ：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分離出的第一個(gè)限制酶。練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為：

。HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”一知識(shí)鞏固1.請(qǐng)寫(xiě)出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？提示：同種限制酶產(chǎn)生的黏性末端

。限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”一相同結(jié)論1：ATGATCCTAGATCTAGTATAGATC結(jié)論1：

同種限制酶產(chǎn)生的黏性末端相同;

不同的限制酶可能會(huì)形成相同的黏性末端，可通過(guò)DNA連接酶連接。ATGATCCTAGAT(同尾酶)使切割點(diǎn)的選擇范圍擴(kuò)大.限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”一1.請(qǐng)寫(xiě)出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端是否一定不同？2.請(qǐng)判斷：以下黏性末端是由______種限制酶作用產(chǎn)生的。3注意觀察識(shí)別序列和切割位點(diǎn)①找到切割位點(diǎn)②補(bǔ)全序列限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”一做題技巧：3.下圖所示的黏性末端屬于同一種限制酶切割產(chǎn)生的是（

）CA.①②B.①③C.②④D.③④限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”一4.結(jié)合下圖，推斷限制酶切一次可斷開(kāi)幾個(gè)磷酸二酯鍵？產(chǎn)生多少游離的磷酸基團(tuán)？產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？消耗幾分子水？限制酶切一次可斷開(kāi)

個(gè)磷酸二酯鍵，產(chǎn)生

個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，產(chǎn)生

個(gè)黏性末端，消耗

分子水2222限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”一5.若某鏈狀DNA分子中含有兩個(gè)BamHⅠ的識(shí)別序列，該DNA分子將被切成____個(gè)片段，共斷裂____個(gè)磷酸二酯鍵，形成幾個(gè)_____黏性末端。344限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”一1.2DNA連接酶——“分子縫合針”如何將兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。G

C

TT

AA

AA

T

T

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G用DNA連接酶連接兩個(gè)片段之間的

。DNA連接酶——“分子縫合針”二磷酸二酯鍵1.DNA連接酶——“分子縫合針”

將雙鏈___________“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的_____________。

DNA片段磷酸二酯鍵①作用：②分類：類型來(lái)源功能相同點(diǎn)差別E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體能連接黏性末端和平末端（效率較低）只能連接黏性末端恢復(fù)磷酸二酯鍵DNA連接酶——“分子縫合針”二AGTCATTCGATA可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)；E.coliDNA連接酶TCGATC注意：

DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口，但不能將單個(gè)脫氧核苷酸連接到DNA鏈上！DNA連接酶——“分子縫合針”二T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較

.CCCGGGGGGCCCDNA連接酶——“分子縫合針”二低DNA連接酶——“分子縫合針”二解旋酶DNA聚合酶DNA聚合酶游離的脫氧核苷酸5′5′3′3′新合成的子鏈思考：DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？DNA連接酶——“分子縫合針”二小結(jié)DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象作用結(jié)果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì) 不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵DNA連接酶——“分子縫合針”二思考·討論①DNA聚合酶②DNA連接酶③DNA解旋酶④

限制酶下列是有關(guān)DNA的各種酶，請(qǐng)選擇對(duì)應(yīng)的作用位點(diǎn)：氫鍵磷酸二酯鍵TACGGCATGCGC5′3′5′3′DNA連接酶——“分子縫合針”二幾種相關(guān)酶的比較課堂小結(jié)名稱作用部位作用結(jié)果限制酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯鍵堿基對(duì)之間的氫鍵將DNA切成兩個(gè)片段磷酸二酯鍵將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子磷酸二酯鍵將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長(zhǎng)鏈。DNA連接酶——“分子縫合針”二如何將人目標(biāo)基因基因運(yùn)送到大腸桿菌細(xì)胞呢？思考：（2）載體種類：質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”三1.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”（1）載體的作用①作為運(yùn)載工具，將

導(dǎo)入受體細(xì)胞中②在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量

.外源基因復(fù)制它們的來(lái)源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別。合作探究：分析歸納載體需要具備的條件：條件①：具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；條件②：能在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制；條件③：具有標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。條件④：載體DNA必須是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害。DNA連接酶——“分子縫合針”二問(wèn)題3：我們用肉眼看不到載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？問(wèn)題2：要使攜帶的外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，載體需要具備什么條件？問(wèn)題1：載體要與外源基因連接，需要具備什么條件？供外源基因插入其中使外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制，以擴(kuò)增外源基因的數(shù)量如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。能復(fù)制，并帶著插入的目的基因一起復(fù)制是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我

能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。有切割位點(diǎn)基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”三

2.最常用的載體

—質(zhì)粒：復(fù)制真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)

改造的。人工3.標(biāo)記基因的篩選原理03基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”三(1)重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞不是100%，而且導(dǎo)入率較低知識(shí)擴(kuò)展

載體上的標(biāo)記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細(xì)胞沒(méi)有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對(duì)該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導(dǎo)入了載體的受體細(xì)胞。如圖所示：標(biāo)記基因的篩選原理導(dǎo)入受體細(xì)胞培養(yǎng)加入氨芐青霉素只有含有載體，并且載體上的抗性基因表達(dá)的大腸桿菌才能存活并增殖含有氨芐青霉素抗性基因載體（如質(zhì)粒）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”三如:綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)(2)標(biāo)記基因通常有:①抗生素的抗性基因如:抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環(huán)素基因(tetr)②熒光蛋白基因基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”三思考·討論1：重組DNA分子

請(qǐng)你根據(jù)圖3-3中的相關(guān)信息找到兩條片段上EcoRI

的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。然后，用剪刀進(jìn)行“切割”。待切割位點(diǎn)全部切開(kāi)后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠條將切口粘連起來(lái)?！璗ATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”三思考·討論2：重組DNA分子1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？

剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。

如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對(duì)，可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對(duì)，也可能是其他原因。不能，因?yàn)榛虻拈L(zhǎng)度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對(duì)？如果不能，可能是什么原因造成的？3.你插入的DNA片段能稱得上一個(gè)基因嗎？…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”三思考·討論3：重組DNA分子…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG1.從以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子時(shí)，需用限制酶切割____次此DNA分子，產(chǎn)生____個(gè)黏性末端。2.目的片段翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，可以連接嗎？______3.目的片段可以自身環(huán)化嗎？_______4.切割目的基因和載體時(shí)，需要用______限制酶，目的是____________________24可以可以同種產(chǎn)生相同的黏性末端*必須是同一種限制酶嗎？不一定，不同的限制酶切割可能形成相同的黏性末端?；蜻M(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”三知識(shí)鞏固下列操作中選用哪種限制酶切割來(lái)構(gòu)建重組質(zhì)粒？1、選目的基因兩端和運(yùn)載體都有的酶切位點(diǎn)；2、所選酶切位點(diǎn)

破壞目的基因以及標(biāo)記基因。規(guī)律——選擇酶切位點(diǎn)的原則：BamHI

和

HindIII①

防止目的基因的自身環(huán)化不能用E.coRI的原因②

防止目的基因反向連接到載體圖1圖2基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”三不能(1)獲取目的基因和切割載體時(shí),通常使用同種限制酶，目的是：_____________________________________________________。但是使用該法缺點(diǎn)是容易發(fā)生__________________________________________________________，為了避免上述情況發(fā)生，可采取的措施是：____________________________________________。(2)選擇限制酶的注意事項(xiàng)：(結(jié)構(gòu)完整)

①切割目的基因時(shí)：能切下目的基因且不破壞目的基因

②切割質(zhì)粒時(shí)：至少保留一個(gè)完整的標(biāo)記基因，便于篩選

為了產(chǎn)生相同的黏性末端，便于目的基因與載體連接分別使用兩種限制酶去切割目的基因和載體目的基因、載體的自身環(huán)化以及目的基因與載體反向連接練習(xí)與應(yīng)用1.若用家蠶作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，在噬菌體和昆蟲(chóng)病毒兩種載體中，不選用

作為載體，其原因是？噬菌體噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，而不是家蠶病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染具有一定的物種（組織）特異性。分析載體的種類和載體需具備的條件基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”三2．根據(jù)標(biāo)記基因的作用，有同學(xué)認(rèn)為在含有某種抗生素的培養(yǎng)基中篩選存活的受體細(xì)胞不一定是導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞，這種說(shuō)法是否合理？請(qǐng)解釋。合理，因?yàn)閮H導(dǎo)入載體的和導(dǎo)入插入了目的基因的載體的受體細(xì)胞均能在該培養(yǎng)基中存活。合作探究：限制酶作用部位：種類E.coliDNA連接酶運(yùn)載工具條件③

有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒DNA連接酶作用部位：切開(kāi)DNA分子的磷酸二酯鍵來(lái)源：主要存在于原核生物中特點(diǎn)：具有專一性（能識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列）T4DNA連接酶①

對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害②

能自我復(fù)制或整合到宿主DNA上。④

常有特殊的標(biāo)記基因種類：磷酸二酯鍵作用結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端◎課堂小結(jié)實(shí)驗(yàn)DNA的粗提取與鑒定◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定在一定溫度下(沸水浴)，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色3.DNA的鑒定在NaCl溶液中的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。課本P74-75利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分一

提取DNA的基本思路2.DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液中。1.DNA不溶于酒精溶液DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可初步分離DNA與蛋白質(zhì)。二

實(shí)驗(yàn)原理◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定三

材料用具1.選材：DNA含量

的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等問(wèn)：能否選用牛、羊、馬、豬等哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料？不能，哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞中無(wú)細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA問(wèn)：能否選用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料？能，雞是鳥(niǎo)類動(dòng)物◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定相對(duì)較高二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用用棕色瓶保存三

材料用具2.試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl析出DNA溶解DNA鑒定DNA課本P117——附錄2研磨液成分作用Tris-HCl緩沖液穩(wěn)定DNAEDTA抑制DNA酶SDS使蛋白質(zhì)變性·溶/瓦解細(xì)胞膜·使蛋白質(zhì)變性與DNA分離◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定四

實(shí)驗(yàn)步驟取材、研磨過(guò)濾或離心取上清液預(yù)冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNANaCl溶液溶解DNA并鑒定◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定四

實(shí)驗(yàn)步驟1.破碎細(xì)胞

稱取30g洋蔥，

，然后放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分

.研磨的目的：破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中利用動(dòng)物細(xì)胞提取DNA破碎細(xì)胞的方法：◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定切碎研磨

動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，可直接吸水漲破(省去研磨步驟)(2)上清液中除了DNA之外，可能含有那些雜質(zhì)？四

實(shí)驗(yàn)步驟2.過(guò)濾或離心取上清液→去除濾液中的雜質(zhì)方案一在漏斗中墊上

，將洋蔥研磨液過(guò)濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取

。低溫抑制DNA水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解(1)

用紗布過(guò)濾的方法中，低溫放置幾分鐘的作用？可能含有核蛋白、多糖、脂質(zhì)等雜質(zhì)◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定(3)過(guò)濾能否用濾紙代替紗布？不可以。因?yàn)镈NA會(huì)被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。紗布上清液方案二也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下

，再取上清液放入燒杯中。四

實(shí)驗(yàn)步驟2.過(guò)濾或離心取上清液→去除濾液中的雜質(zhì)◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定離心5min(1)攪拌時(shí)應(yīng)輕緩、并沿一個(gè)方向：四

實(shí)驗(yàn)步驟3.預(yù)冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNA減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子(2)預(yù)冷的酒精具有以下優(yōu)點(diǎn)：◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定①可抑制DNA水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解②抑制分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂方案一

在上清液中加入體積

的、預(yù)冷的

(體積分?jǐn)?shù)為95%)，靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的

物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向

，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分?！舅伎肌看瞬襟E的目的是：使蛋白質(zhì)等溶解在酒精中，DNA

不溶于酒精而析出。相等酒精溶液白色絲狀攪拌四

實(shí)驗(yàn)步驟3.預(yù)冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNA方案一

在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分。方案二

或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，

上清液，將管底的

晾干?！?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定棄沉淀物（粗提取的DNA）四

實(shí)驗(yàn)步驟4.NaCl溶液溶解DNA并鑒定實(shí)驗(yàn)組水浴加熱5min，冷卻后對(duì)照組取兩支20mL的試管，各加入

5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜?/p>

中加熱5min待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化藍(lán)色◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定2mol/L的NaCl溶液沸水五

結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

二苯胺試劑鑒定呈現(xiàn)藍(lán)色說(shuō)明實(shí)驗(yàn)基本成功；如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中出現(xiàn)了失誤等本實(shí)驗(yàn)粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)1.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質(zhì)嗎？

觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說(shuō)明DNA中的雜質(zhì)較多◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定注意事項(xiàng)1．以血液（如雞血細(xì)胞）為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100mL血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固3．加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，且沿一個(gè)方向攪拌，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀2．利用動(dòng)物細(xì)胞提取DNA破碎細(xì)胞的方法：動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，可直接吸水漲破(省去研磨步驟)4．提純DNA時(shí)，選用體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精的原因：體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精提純效果更佳預(yù)冷的酒精具有以下優(yōu)點(diǎn)：①可抑制DNA水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解

②抑制分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出

③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定◎?qū)嵺`與探究·DNA的粗提取與鑒定◎1.下列有關(guān)“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的是(

)A.新鮮豬血、菜花等動(dòng)植物材料均可用于DNA的粗提取B.植物材料需先研磨破碎細(xì)胞C.DNA只能溶于2mol/L的NaCl溶液D.溶有DNA的