東華大現(xiàn)代環(huán)境監(jiān)測技術(shù)課件04熒光及磷光光譜法

第四章熒光及磷光光譜法4.1原理4.2熒光光譜儀4.3熒光分析方法4.4熒光光譜法在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用4.5磷光分析法

4.1原理4.1.1熒光和磷光的產(chǎn)生4.1.2激發(fā)光譜、熒光和磷光光譜4.1.3熒光的影響因素4.1.4熒光強(qiáng)度

4.1.1熒光和磷光的產(chǎn)生

&分子熒光是指分子在輻射能（紫外、可見光、紅外光等）的照射下，電子躍遷至單重激發(fā)態(tài)，并以無輻射馳豫方式回到第一單重激發(fā)態(tài)的最低振動能級，由此再躍回基態(tài)或基態(tài)中的其它振動能級時所發(fā)出的光。

&分子磷光是指處于第一最低單重激發(fā)態(tài)的分子以無輻射馳豫方式進(jìn)入第一最低三重激發(fā)態(tài)，再由三重激發(fā)態(tài)躍遷回至基態(tài)而發(fā)出的光。

&單重態(tài)(S)與三重態(tài)(T)的區(qū)別在于：電子自旋方向不同，且后者的能級稍低一些（見示意圖）。單重激發(fā)態(tài)電子的自旋方向仍然和處于基態(tài)軌道的電子配對，且單重態(tài)分子具有抗磁性；三重激發(fā)態(tài)中，兩個電子平行自旋。

單重態(tài)及三重態(tài)激發(fā)示意圖

&處于激發(fā)態(tài)的電子，通常以輻射躍遷方式或無輻射躍遷方式再回到基態(tài)。輻射躍遷主要涉及到熒光、延遲熒光或磷光的發(fā)射；無輻射躍遷則是指熱的形式輻射其多余的能量，包括振動馳豫（VR），內(nèi)部轉(zhuǎn)移（IR），系間竄躍（IX）及外部轉(zhuǎn)移（EX）等。各種躍遷方式發(fā)生的可能性及程度，與熒光物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)及激發(fā)時的物理和化學(xué)環(huán)境等因素有關(guān)。激發(fā)能量的傳遞途徑如圖所示。

激發(fā)態(tài)能量傳遞途徑&結(jié)合熒光和磷光的產(chǎn)生過程，進(jìn)一步說明各種能量傳遞方式（熒光發(fā)射、磷光發(fā)射、振動馳豫、內(nèi)部轉(zhuǎn)移、系間竄躍、外部轉(zhuǎn)移）在其中所起的作用。設(shè)處于基態(tài)單重態(tài)的電子吸收波長為

的輻射之后，分別激發(fā)至第二單重態(tài)S2和第一單重態(tài)S1，如圖所示。

熒光、磷光能級圖①振動馳豫指在同一電子能級中，電子由高振動能級轉(zhuǎn)至低振動能級，而將多余的能量一熱的形式發(fā)出。發(fā)生振動馳豫的時間為10-12s。②內(nèi)轉(zhuǎn)移當(dāng)兩個電子能級非?？拷灾缕湔駝幽芗売兄丿B時，常發(fā)生電子由高能級以無輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級。③熒光發(fā)射處于第一激發(fā)單重態(tài)中的電子躍遷回至基態(tài)各振動能級時，將得到最大波長為λ3的熒光。熒光的產(chǎn)生在10-6～10-9s內(nèi)完成。注意基態(tài)中也有振動馳豫躍遷。④系間竄躍指不同多重態(tài)間的無輻射躍遷。這是產(chǎn)生延遲熒光的機(jī)理。例如S1→T1就是一種系間竄躍。通常，發(fā)生系間竄越時，電子由S1的較低震動能級轉(zhuǎn)移至T1的較高振動能級處。有時也可能發(fā)生T1→S1，然后由S1發(fā)生熒光。這是產(chǎn)生延遲熒光的機(jī)理。⑤磷光發(fā)射電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級，有可能以系間竄躍方式轉(zhuǎn)到第一激發(fā)三重態(tài)，再經(jīng)過振動馳豫，轉(zhuǎn)至其最低振動能級，由此激發(fā)態(tài)躍回至基態(tài)時，便發(fā)射磷光。這個躍遷過程（T1→S0）是自旋禁阻的，其發(fā)光速率較慢，約為10-4～100s。因此，這種躍遷所發(fā)射的光，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時間⑥外轉(zhuǎn)移指激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。這一現(xiàn)象稱為“熄滅”或“猝滅”。

Back4.1.2激發(fā)光譜、熒光和磷光光譜

熒光和磷光均為光致發(fā)光，因此必須選擇合適的激發(fā)光波長。這可根據(jù)它們的激發(fā)光譜曲線來確定。繪制激發(fā)光譜時，固定測量波長為熒光（或磷光）最大發(fā)射波長，然后改變激發(fā)光波長，根據(jù)所測得的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光波長的關(guān)系，即得到激發(fā)光譜曲線。在激發(fā)光譜的最大波長處，處于激發(fā)態(tài)的分子數(shù)目是最多的，這可說明所吸收的光能量也是最多的，自然能產(chǎn)生最強(qiáng)的熒光。如果固定激發(fā)光波長為其最大激發(fā)波長處，然后測定不同波長時所發(fā)射的熒光或磷光強(qiáng)度，即可得到熒光或磷光光譜曲線（參見萘的激發(fā)光譜、熒光和磷光發(fā)射光譜曲線圖）。

在熒光和磷光的產(chǎn)生過程中，因存在多種形式的無輻射躍遷而損失了部分能量，故它們的最大發(fā)射波長都向長波長方向轉(zhuǎn)移；尤其磷光波長的移動較多，而且它的強(qiáng)度也相對較弱。萘的激發(fā)光譜、熒光和磷光光譜4.1.3熒光的影響因素

熒光的影響因素包括：量子產(chǎn)率、熒光與有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系、金屬鰲合物的熒光、溶劑的影響、熒光的淬滅。&

量子產(chǎn)率量子產(chǎn)率（Φ）通常用下式表示：也叫熒光效率。熒光的量子產(chǎn)率，與熒光產(chǎn)生時涉及的輻射和無輻射躍遷過程的速率常數(shù)有關(guān)。若用數(shù)學(xué)表達(dá)式表達(dá)這些關(guān)系，既

式中：Kf為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，主要取決于化學(xué)結(jié)構(gòu)；為其它過程的速率常數(shù)的總和，主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。&熒光與有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系

①躍遷類型

因躍遷具有較大的摩爾吸收系數(shù)且壽命較短，故此過程常能發(fā)生較強(qiáng)的熒光；另外各種躍遷過程的競爭也有利于熒光的發(fā)射。

②共軛效應(yīng)

容易實現(xiàn)Л→Л*

激發(fā)的芳香族化合物易發(fā)生熒光。增加分子體系的共軛度，也就是增大熒光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)，可使熒光增強(qiáng)，

③剛性結(jié)構(gòu)和共平面效應(yīng)熒光物質(zhì)的剛性和共平面性增加，可使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減小，從而有利于熒光的發(fā)射。

④取代基效應(yīng)

芳香族化合物具有不同取代基時，其熒光強(qiáng)度和熒光光譜都有很大的不同。一般，給電子基團(tuán)如：-OH、-NH2、-OCH3、-NR2等增強(qiáng)熒光；而吸電子基團(tuán)如-NO2、-COOH等減弱熒光。&金屬鰲合物的熒光

除過渡元素的順磁性原子會發(fā)生線狀熒光光譜外，大多數(shù)無機(jī)鹽金屬離子是不能產(chǎn)生熒光的。但有些情況下，金屬鰲合物卻能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，并可用于痕量金屬離子的測定。

①鰲合物中配對體的發(fā)光不少有機(jī)化合物具有共軛雙鍵，但因不是剛性結(jié)構(gòu)，分子處于同一平面，因而不發(fā)生熒光。若這些化合物和金屬離子形成鰲合物，隨著分子的剛性增強(qiáng)，平面結(jié)構(gòu)增大，常會發(fā)生熒光。一般說來，能產(chǎn)生這類熒光的金屬離子具有硬酸型結(jié)構(gòu)，如Be、Mg、Al、ZR、Th等。

②鰲合物中金屬離子的特征熒光

通常是鰲合物先通過配位體電子躍遷而被激發(fā)，接著配位體把能量轉(zhuǎn)移給金屬離子，導(dǎo)致金屬離子發(fā)射特征熒光。&溶劑的影響

增大溶劑的極性，將使n→Л*

躍遷的能量增大，Л→Л*躍遷的能量降低，從而導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。

&熒光的淬滅

熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光淬滅。這些引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為淬滅劑。

引起熒光淬滅的原因包括：①碰撞淬滅（主要原因）:指單重激發(fā)態(tài)的熒光分子與淬滅劑發(fā)生碰撞后，使激發(fā)態(tài)分子以無輻射躍遷方式回到基態(tài)，因而產(chǎn)生淬滅作用。②能量轉(zhuǎn)移:產(chǎn)生于淬滅劑與處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子作用后，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使淬滅劑得到激發(fā)。③氧的淬滅作用：順磁性的氧分子與處于單重激發(fā)態(tài)的熒光物質(zhì)分子相互作用，促進(jìn)形成順磁性的三重態(tài)熒光分子，即加速系間竄躍所致。④自熄滅和自吸收：當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時，常會發(fā)生自熄滅現(xiàn)象，使熒光強(qiáng)度降低。

4.1.4熒光強(qiáng)度發(fā)射的熒光光強(qiáng)IF應(yīng)正比于該系統(tǒng)吸收的激發(fā)光的光強(qiáng)，即：

式中：I0是入射光強(qiáng)度，I是通過厚度為b的介質(zhì)后的光強(qiáng)。常數(shù)K′取決于熒光效率。根據(jù)比耳定律：當(dāng)I0一定時，經(jīng)過一定轉(zhuǎn)換，可寫為：

在低濃度時，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。當(dāng)高濃度時，由于自熄滅和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度與分子濃度不呈線性關(guān)系，而發(fā)生直線彎曲現(xiàn)象。

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4.2熒光光譜儀（熒光光度計）熒光分析使用的儀器可分為：目視、光電、分光三種類型。熒光光度計的組成：通常均由光源、單色器（濾光片或光柵）、液槽及檢測器組成。重點掌握熒光光度計的工作原理和儀器結(jié)構(gòu)圖

熒光光譜儀示意圖熒光光度計的工作原理：由光源發(fā)出的光，經(jīng)第一單色器（激發(fā)光單色器）后，得到所需要的激發(fā)光波長。通過樣品池后，由于一部分光線被熒光物質(zhì)所吸收，故其透射強(qiáng)度減為I。熒光物質(zhì)被激發(fā)后，將向四面八方發(fā)射熒光，但為了消除入射光及散射光的影響，熒光的測量應(yīng)在與激發(fā)光成直角的方向上進(jìn)行。儀器中的第二單色器稱為熒光單色器。它的作用是消除溶液中可能共存的其它光線的干擾，以獲得所需要的熒光。熒光作用于檢測器上，得到相應(yīng)的電訊號，經(jīng)放大后，再用適當(dāng)?shù)挠涗浧骷o(jì)錄。4.2.1光源

應(yīng)具有強(qiáng)度大、適用波長范圍寬兩個特點。常用光源有高壓汞燈和氙弧燈。前者的平均壽命約為1500～3000h，熒光分析中常用的是365、405、436nm三條譜線；后者是連續(xù)光源，發(fā)射光束強(qiáng)度大，可用于200～700nm波長范圍。在300～400nm波段內(nèi)，光譜強(qiáng)度幾乎相等。4.2.2濾光片和分光器

用濾光片為單色器時，以干涉濾光片的性能最好。它具有半寬度窄，透射率高，經(jīng)得起強(qiáng)光源的長期照射等優(yōu)點。較精密的熒光光度計均用分光器作單色器。目前，分光器多采用光柵。4.2.3檢測器

簡易的熒光劑可采用目視或硒光電池檢測。但一般較精密的熒光光度計均采用光電倍增管或光電子計數(shù)器檢測。

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4.3熒光分析方法

4.3.1分析方法

多采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，即以已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過和試樣同樣的處理后，配成一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定這些溶液的熒光強(qiáng)度后，用熒光強(qiáng)度對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)試樣溶液的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。4.3.2熒光分析法的靈敏度

熒光法的靈敏度比分光光度法高2～4個數(shù)量級。這是由于在分光光度法中，被檢測的訊號為A=lgI0/I，即當(dāng)試樣濃度很低時，檢測器所檢測的是兩個較大的訊號（I0及I）的微小差別，這是難以達(dá)到準(zhǔn)確測量的。然而在熒光光度法中，被檢測的是疊加在很小背景值上的熒光強(qiáng)度，從理論上講，它是容易進(jìn)行高靈敏、高準(zhǔn)確測量的。在熒光光度法中，一般情況下，多采用相對靈敏度來表示。Back4.4熒光光譜法在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用

※大氣SO2中的測定

※空氣中苯并（α）芘的測定

※水環(huán)境中苯并(α)芘[BaP]的測定

※水質(zhì)中硒的測定—2,3二氨基萘熒光

※大氣SO2中的測定

紫外熒光法測定大氣中的SO2，具有選擇性好、不消耗化學(xué)試劑、適用于連續(xù)自動監(jiān)測等特點，用波長190～230nm紫外光照射大氣樣品，則SO2吸收紫外光被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，發(fā)射熒光強(qiáng)度和SO2濃度成正比，用光電倍增管及電子測量系統(tǒng)測量熒光強(qiáng)度，即可得大氣中SO2的濃度（SO2檢測儀示意圖）?！諝庵斜讲ⅲé粒┸诺臏y定乙酰化濾紙層析—熒光分光光度法

醋酸纖維素薄層層析—熒光分光光度法

SO2熒光監(jiān)測儀示意圖※水環(huán)境中苯并(α)芘[BaP]的測定

苯并(α)芘是一種有代表性的強(qiáng)致癌物質(zhì)，被列為環(huán)境污染致癌物質(zhì)監(jiān)測工作中的常規(guī)項目之一。水中的苯并(α)芘主要采用層析—熒光分光光度法（GB11895-89）測定，將水中多環(huán)芳烴及環(huán)己烷可溶物經(jīng)環(huán)己烷萃取（水樣必須充分搖勻），萃取液用無水硫酸鈉脫水、濃縮，然后經(jīng)乙?；癁V紙分離。分離后的B(a)P用熒光分光光度計測定?！|(zhì)中硒的測定—2,3二氨基萘熒光（GB11902-89）

4.5磷光分析法

4.5.1原理

4.5.2磷光分析儀器

4.5.3分析方法

4.5.4在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用

4.5.1原理磷光發(fā)射電子由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)至第一激發(fā)三重態(tài)的幾率很小，但由第一激發(fā)單重態(tài)的最低震動能級，有可能以系間躥躍方式轉(zhuǎn)至第一激發(fā)三重態(tài)，再經(jīng)振動弛豫，轉(zhuǎn)至其最低振動能級，由此激發(fā)態(tài)躍回到基態(tài)時，便發(fā)射磷光。增強(qiáng)磷光的措施由于磷光的產(chǎn)生很容易受其它輻射或無輻射躍遷的干擾而使磷光強(qiáng)度減弱，甚至完全消失。因此，為了獲取較強(qiáng)的磷光，可采用下列一些措施：

①增加試樣的剛性；②固體磷光法；

③分子締合物的形成；④重原子效應(yīng)；

⑤敏化磷光

此外，與間接熒光法一樣，也可以利用磷光猝滅的效應(yīng)，用間接磷光法測定某些物質(zhì)。

4.5.2磷光分析儀器

磷光儀與熒光儀相似，主要有光源、激發(fā)光單色器、液槽、發(fā)射光單色器、檢測器等組成。磷光計與熒光計的主要區(qū)別：液槽：為了能在低溫下測定磷光，盛試樣溶液的石英液槽需放置在盛液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)。斬波片：因發(fā)生磷光的物質(zhì)常伴有熒光產(chǎn)生，為了區(qū)別磷光和熒光，在其激發(fā)光單色器和液槽之間以及液槽和發(fā)射光單色器之間各裝一個可調(diào)節(jié)為同相或異相的斬波片，并由一個同步電動機(jī)帶動。同相時，磷光和熒光一起進(jìn)入發(fā)射光單色器，測到的是磷光和熒光的總光強(qiáng)。當(dāng)調(diào)節(jié)為異相時，