植物細胞培養(yǎng)及原生質體培養(yǎng)演示文稿

植物細胞培養(yǎng)及原生質體培養(yǎng)演示文稿當前第1頁\共有75頁\編于星期四\8點（優(yōu)選）第五章植物細胞培養(yǎng)及原生質體培養(yǎng)當前第2頁\共有75頁\編于星期四\8點一、植物細胞培養(yǎng)(cellculture)的特性：

1.植物細胞較微生物細胞大，具有纖維素細胞壁，抗剪切力差；2.細胞生長速度慢，易受微生物污染，有時需用抗生素；3.細胞生長的中期及對數(shù)期，易凝聚為直徑達350um一400um的團塊，懸浮培養(yǎng)較困難；4.培養(yǎng)時需供氧，培養(yǎng)液粘度大，不能耐受強力通風攪拌；并具有群體效應5.培養(yǎng)細胞產物滯留于細胞內，且產量較低，培養(yǎng)過程具有結構與功能全能性。當前第3頁\共有75頁\編于星期四\8點1當前第4頁\共有75頁\編于星期四\8點二、植物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求及培養(yǎng)基１.營養(yǎng)需求：

植物細胞生長所需營養(yǎng)較微生物細胞復雜，除水分外，其它營養(yǎng)成分可分為如下幾類：

(1)無機營養(yǎng):如N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等；

(2)維生素：如維生素B1、B6、煙酸、肌醇、生物素、泛酸鈣及葉酸等；

(3)碳源:如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等；

(4)天然物:如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸薺汁、生梨汁及蘋果汁等；

當前第5頁\共有75頁\編于星期四\8點(5)植物激素:如生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸；其它有油菜素內酯、三十烷醇、肽類、半支蓮醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；(6)氨基酸類:如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、賴氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氯酸、蘇氨酸、酪氨釀、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；(7)核酸及其水解物:如DNA、RNA、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤及胸腺嘧啶等；(8)其它成分:如氯化膽堿、膽質素、膠氨酸、蘋果酸及反丁烯二酸等.2.培養(yǎng)基：

(1)固體培養(yǎng)基：添加瓊脂等

(2)液體培養(yǎng)基：不加瓊脂等當前第6頁\共有75頁\編于星期四\8點三、植物細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)技術主要包括單細胞培養(yǎng)（微室培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)、微滴培養(yǎng)）、懸浮培養(yǎng)、固相化培養(yǎng)等多種培養(yǎng)方式。當前第7頁\共有75頁\編于星期四\8點單細胞培養(yǎng)：對分離的單細胞進行培養(yǎng)的方法。（1）單細胞的分離：從葉片直接分離：采用機械法（將葉片輕輕研碎、然后過濾和離心純化）或酶解法（采用果膠酶處理葉片）由葉肉細胞分離。B.從愈傷組織分離：由離體組織獲得愈傷組織，再由愈傷組織分離單細胞通過愈傷組織振蕩培養(yǎng)、過濾和離心等步驟分離單細胞。當前第8頁\共有75頁\編于星期四\8點當前第9頁\共有75頁\編于星期四\8點單細胞培養(yǎng)方法：（1）平板培養(yǎng)法：分散的植物細胞接種于含薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內的培養(yǎng)過程稱為平板培養(yǎng)法。。方法是將經(jīng)機械破碎過篩或酶(纖維素酶及果膠酶等)消化分散的細胞，洗滌離心除酶，細胞濃縮物經(jīng)計數(shù)及稀釋，接種到加熱熔化而剛冷卻至35℃左有的固體培養(yǎng)基中充分混勻，傾入培養(yǎng)皿中，石蠟密封，于25℃含5％CO2空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞即可生長成團。當前第10頁\共有75頁\編于星期四\8點當前第11頁\共有75頁\編于星期四\8點（2）看護培養(yǎng)法：從懸浮培養(yǎng)物或脆弱愈傷組織上用針或玻璃毛細管分離單細胞，每個細胞放在一個方形濾紙片的上表面，而濾紙片放在活躍生長的愈傷組織上進行培養(yǎng)的方法。當前第12頁\共有75頁\編于星期四\8點（3）微室培養(yǎng)法：懸浮單細胞接種于凹玻片或玻璃環(huán)與蓋玻片組成的微室內的固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。當前第13頁\共有75頁\編于星期四\8點（4）條件培養(yǎng)：是指采用條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)單細胞的方法，條件培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入高密度的細胞進行培養(yǎng)，一定時間后這些細胞就會向培養(yǎng)基中分泌一些物質，使培養(yǎng)基條件化，簡單的方法是采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4-6周高密度細胞過濾掉，制成液體或固體培養(yǎng)基接種單細胞。（5）紙橋培養(yǎng)：是用于植物莖尖分生組織細胞培養(yǎng)的方法，也可用于單細胞。是使濾紙的兩端進入培養(yǎng)基，中央部分露出培養(yǎng)基表面，將所要培養(yǎng)的細胞置于濾紙上培養(yǎng)。（P80，圖5-4）當前第14頁\共有75頁\編于星期四\8點2.懸浮培養(yǎng)法：

植物細胞懸浮培養(yǎng)(cellsuspensionculture)即植物細胞或小的細胞聚集體在液體培養(yǎng)基中于搖床上進行懸浮培養(yǎng)，使之在體外生長和發(fā)育，并保持良好的分散性。特點：可以工廠化生產，提供大量一致的細胞懸浮細胞的來源：愈傷組織，某個器官或組織，甚至幼嫩的植株，通過物理或化學的方法進行分離而獲得。當前第15頁\共有75頁\編于星期四\8點(1)優(yōu)良的懸浮細胞培養(yǎng)體系必需滿足：

A.懸浮培養(yǎng)物分散性好，細胞團較小，一般由幾十個以下的細胞組成。B.均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。C.生長迅速，懸浮細胞的量一般2—3天甚至更短時間便可增加一。當前第16頁\共有75頁\編于星期四\8點(2)培養(yǎng)過程：

將愈傷組織、無菌苗、吸漲胚胎或外植體芽尖、根尖及葉肉組織，經(jīng)勻漿器破碎、不銹鋼網(wǎng)過濾，單細胞濾液作為按種材料，接種于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。(3)懸浮培養(yǎng)特點：

培養(yǎng)過程中細胞總數(shù)不斷增加，一定時間后產量達最高點，生長趨于停止。然后進行移植繼代培養(yǎng)，其過程表現(xiàn)出嚴格可重復周期性變化，細胞增長規(guī)律與微生物相同，有延滯期、對數(shù)生長期、直線生長期、減慢期及靜止期等階段。植物細胞接種時要達到一定細胞濃度，通常為0.25xl0‘細胞／ml一0.5x10‘細胞／m1。當前第17頁\共有75頁\編于星期四\8點細胞生長曲線當前第18頁\共有75頁\編于星期四\8點(4)懸浮培養(yǎng)類型：A.分批培養(yǎng)(Batchculture)：

分批培養(yǎng)是在一個封閉的系統(tǒng)中進行細胞培養(yǎng)。細胞材料生長在已固定體積的培養(yǎng)基中。隨著細胞數(shù)量的增加，培養(yǎng)基營養(yǎng)的消耗及某些其他因子的積累會使細胞停止生長。繼代培養(yǎng)需取出少量培養(yǎng)物轉接于新鮮培養(yǎng)液中。生長過程包括延遲期、指數(shù)期、靜止期等。分緩慢轉動培養(yǎng)（1-2rpm）、震蕩培養(yǎng)（100rpm）、快速轉動培養(yǎng)（80-120rpm）和攪拌培養(yǎng)。當前第19頁\共有75頁\編于星期四\8點B.連續(xù)培養(yǎng)(Continuousculture):

是用一定容積的特定容器中進行細胞培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)過程中不斷注入新鮮培養(yǎng)基，而使營養(yǎng)物連續(xù)得到補充，細胞生長和增殖連續(xù)進行，同時有等體積的培養(yǎng)物排除系統(tǒng)。分為封閉式連續(xù)培養(yǎng)和開放式連續(xù)培養(yǎng)。最大特點是細胞生長速率標準一致，新形成的細胞補償了被排出的細胞，系統(tǒng)內細胞密度、生長速度、化學成分、細胞代謝活性都維持恒定。可通過改變培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件建立恒定系統(tǒng)。

化學恒化法：通過營養(yǎng)液或某一成分的含量進行控制。

濁度恒定法：比濁計或分光光度計測定渾濁度而進行流量控制。當前第20頁\共有75頁\編于星期四\8點當前第21頁\共有75頁\編于星期四\8點C.半連續(xù)培養(yǎng)：

利用培養(yǎng)罐進行細胞大量培養(yǎng)的一種方式，當培養(yǎng)罐內細胞數(shù)量增殖到一定量后，倒出一半細胞懸浮液于另一培養(yǎng)罐內，再分別加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進行培養(yǎng)，如此反復進行再培養(yǎng)。半連續(xù)培養(yǎng)能夠獲得大量均勻一致的培養(yǎng)細胞。當前第22頁\共有75頁\編于星期四\8點（5）懸浮培養(yǎng)細胞的同步化：同步化培養(yǎng)室之培養(yǎng)基中的大部分細胞都能同時通過細胞周期（G1、S、G2和M）的各個階段。實現(xiàn)懸浮細胞同步化的方法有：

A饑餓法：先對細胞斷絕供應一種進行細胞分裂所必需的營養(yǎng)成分或激素，使細胞停滯在G1或G2期，經(jīng)過一段時間的饑餓后，當重新加入該限制因子時，靜止細胞就會同時進行分裂。

B抑制法：使用DNA合成抑制劑，如5-氨基嘧啶等也可以使細胞同步化。由于核酸類似物的存在阻止了DNA的合成，細胞周期只能進行到G1期，細胞都滯留在G1或S期的邊界，當去除抑制劑后，細胞就進入同步分裂。C.采用發(fā)酵器系統(tǒng)進行同步化：通過充入氮氣的方法控制細胞分裂活力，然后恢復普通空氣狀態(tài)時再度分裂。當前第23頁\共有75頁\編于星期四\8點（6）懸浮培養(yǎng)細胞的植株再生：

懸浮培養(yǎng)細胞形成體細胞胚或誘導形成愈傷組織，然后再由愈傷組織再生植株。（7）影響懸浮培養(yǎng)的因素：A培養(yǎng)基：通常需要高硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，以及含磷量高的培養(yǎng)基。B.細胞密度：最低密度為0.5×105~1.0×105。C.植物激素和其他附加成分:添加適當濃度的激素和氨基酸。D.培養(yǎng)基pH值：通過調節(jié)營養(yǎng)比例或加入化學成分穩(wěn)定pH值。E.CO2濃度：低密度培養(yǎng)中，CO2對于誘導細胞分裂有較大的影響，需控制適當濃度。當前第24頁\共有75頁\編于星期四\8點3.固相化培養(yǎng)技術：

細胞固定在一定的惰性基質中，如瓊脂、海藻酸鹽、聚丙烯酰氨纖維膜上，細胞不能運動，但營養(yǎng)液可以在基質中流動。當前第25頁\共有75頁\編于星期四\8點（1）固相化培養(yǎng)的特點：A.消除剪切力；B.細胞生長緩慢，促進次生代謝過程；C.細胞之間緊密接觸，形成梯度，利于產物積累；D.便于操作，不易污染。E.便于產物收集。當前第26頁\共有75頁\編于星期四\8點當前第27頁\共有75頁\編于星期四\8點

第二節(jié)園藝植物原生質體培養(yǎng)

通過一定方法除去細胞壁，而得到一個裸露的植物細胞，即為原生質體(Protoplast)。游離的原生質體在一定條件下培養(yǎng)可以重新形成細胞壁，并像正常的植物細胞那樣具有全能性，經(jīng)過適當?shù)呐囵B(yǎng)可以再生出完整植株。當前第28頁\共有75頁\編于星期四\8點蝴蝶蘭原生質體培養(yǎng)和植株再生（圖片引自PlantCellReports，2007，26：719-725）當前第29頁\共有75頁\編于星期四\8點非洲百合原生質體培養(yǎng)和植株再生（Agapanthuspraecox）（圖片引自PlantCell,TissueandOrganCulture，2003，72（1）：63-69）當前第30頁\共有75頁\編于星期四\8點球根鳶尾原生質體培養(yǎng)和植株再生（圖片引自Euphytica，1999，105:99–102）當前第31頁\共有75頁\編于星期四\8點針葉石竹葉片原生質體培養(yǎng)及植株再生（圖片引自InVitroCell.Dev.Biol.—Plant2005,41:794–800）當前第32頁\共有75頁\編于星期四\8點仙客來原生質體培養(yǎng)及體胚途徑再生（圖標引自PlantCellTissOrganCult,2010,101:171–182）當前第33頁\共有75頁\編于星期四\8點一、原生質體培養(yǎng)的意義（1）原生質體可以作為體細胞無性系變異和突變體篩選的材料；（2）利用原生質體不具細胞壁的特性可以進行細胞器移植和外源物的攝取(病毒、微生物、外源遺傳物質)；（3）原生質體之間可以進行融合而產生雜種細胞(即體細胞雜交）。（4）是植物基因工程的理想受體，用外源遺傳物質對植物原生質體進行改造和轉化，然后誘導分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。（5）也是研究細胞生物學、分子生物學、體細胞無性系變異和植物病理學研究的有用工具。當前第34頁\共有75頁\編于星期四\8點

自1970年首次獲得原生質體再生植株成功以來，通過原生質體獲得再生植株的植物約有280余種，其中有20種為我國首先報道。原生質體培養(yǎng)包括原生質體的分離、培養(yǎng)、植株再生等過程。當前第35頁\共有75頁\編于星期四\8點(一)原生質體的制備：1、材料來源與預處理：（1）材料來源：

可以采用各種組織和器官，但多應用葉片、愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織。

當前第36頁\共有75頁\編于星期四\8點（2）預處理：

A.預質壁分離：17-20℃酶液中靜置半小時，再于28—34℃保溫，或將材料置于與酶液中糖濃度相同的溶液中預培養(yǎng)1h左右，再浸于酶液中消化即可達到質壁分離目的；

B.預培養(yǎng):將除去下表皮的葉片于誘導愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，再用酶消化去壁，所得原生質體分裂頻率較高；

C.暗處理:將室溫下生長5—7個星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其葉片制備的原生質體有活力；

D.光處理:將葉片于日光或燈光下照射2—6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生質體分離；

E.低溫處理:夏季應用的實驗材料其萌動種子應于4℃過夜后再播種，從其植株葉片上分離的原生質體培養(yǎng)效果較佳。當前第37頁\共有75頁\編于星期四\8點2.制備原生質體的酶類：高等植物細胞壁主要成分為a-纖維素，其次為半纖維素、果膠質及蛋白質。細胞生長的不同階段及不同物種的細胞壁組成與結構不同，木質化及次生加厚的細胞壁不被酶消化，故選擇消化細胞壁的酶類是制備原生質體關鍵。當前第38頁\共有75頁\編于星期四\8點（引自K.-H.Neumannetal.,PlantCellandTissueCulture-AToolinBiotechnology,PrinciplesandPractice,?Springer-VerlagBerlinHeidelberg2009）當前第39頁\共有75頁\編于星期四\8點常用的酶類有：A.纖維素酶（Cellulase

），如OnozukaR—10及RS，國內常用的為EA3—867，其中含少量果膠酶；B.果膠酶（Pectinase），如MacerozymeR-10又叫離析酶，主要含果膠酶，活力較高，其含雜酶較多，用量不超過2％，作用時間長有毒害作用；此外亦用PectalyaseY—23，也叫離析軟化酶，活力極高，葉片用量一般為0．1％，懸浮細胞為0．05％；C.崩潰酶（Driselase)，為一種粗酶制劑，具有纖維素酶及果膠酶活性；D.半纖維素酶（Hemicellulase），如RhozymeHP150，用于懸浮細胞、豆科根瘤、幼苗子葉及根細胞原生質體的分離;E蝸牛酶（Snailase），是一種混合酶，它含有纖維素酶，果膠酶，淀粉酶，蛋白酶等20多種酶主要用于體細胞原生質體分離。當前第40頁\共有75頁\編于星期四\8點酶液配制：

需加入甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、葡萄糖硫酸酯、CaCl2·2H20(0.1mmol/l一10mo1／l)及KH2PO4(0.75mmol/l)等滲透穩(wěn)定劑，以維持原生質體完整性。酶液pH值相當重要，纖維素酶及果膠酶單獨使用時，其pH分別以5.4及5.8為宜；混合使用時pH5.4-pH5.6為宜，降至4．8以下則原生質體破裂。酶液配制后需以0.45um微孔膜過濾除菌，而不可采用加熱滅菌法。當前第41頁\共有75頁\編于星期四\8點3．原生質體分離及純化（1）分離：原生質體分離有機械法及酶消化法，前者產量極低而不多用、后者又分—步法及二步法。一步法是將材料在2l一28℃用纖維素酶及果膠酶混合液一次性處理2—24h。二步法是將材料先用果膠酶降解胞間膠層得到單細胞，再用纖維素酶脫壁而釋放原生質體。當前第42頁\共有75頁\編于星期四\8點（引自K.-H.Neumannetal.,PlantCellandTissueCulture-AToolinBiotechnology,PrinciplesandPractice,?Springer-VerlagBerlinHeidelberg2009）當前第43頁\共有75頁\編于星期四\8點（3）純化需用不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)(100目一400目)濾除較大雜物后再洗滌純化。

A.離心法:原生質體混合物于500—l000rpm離心5min,吸去上層液，沉淀再用與酶液具有相同糖濃度溶液反復洗滌3一4次，最后用原生質體培養(yǎng)液洗滌備用；B.飄浮法:離心法純化的原生質體若含較多碎片及少量老細胞時．可用20％蔗糖離心，原生質體浮于液面．碎片及老細胞沉降而得以純化，但產量低，有時對原生質體造成損傷；C.界面法:利用高分子聚合物混合液產生兩相水溶液的原理，將原生質體混合物置于葡聚糖及PEG混合液中離心，即可從兩相界面獲得高純度原生質體；

D.滴洗法:原生質體混合物置于孔徑8um濾器中，用洗液以l--2滴／秒速度自然過濾洗滌，其過程勿使濾干，洗至一定程度后，用原生質體培養(yǎng)液混合備用。此法原生質體破碎少。當前第44頁\共有75頁\編于星期四\8點Brassicaleavesatthestartandend

ofincubationinenzymesolutionLeavesslitintothinstripsandplacedinenzymesolutionWelldigestedleaves當前第45頁\共有75頁\編于星期四\8點PelletcontainsdebrisTubeaftercentrifugationofprotoplastswithsucroseBandofprotoplastsClose-upofbandofprotoplastsfloateduponsucrose當前第46頁\共有75頁\編于星期四\8點

4．原生質體活力測定

純化的原生質體需經(jīng)活力測定后方可用于培養(yǎng)．測定方法有；（1）根據(jù)形態(tài)待征判斷其活力：來源于葉片的原生質體，呈綠色及圓而鼓者為活原生質體；來源于愈傷組織及懸浮細胞者，胞質內原生質環(huán)流及布朗運動活躍者活力較高；（2）活體染色法：用0.1％酚番紅或伊文思藍染色、不著色者為活原生質體，染色者為無活力原生質體；（3）熒光染料活休染色法：用雙醋酸熒光素染色，染料可自由透過細胞膜，在細胞內被酯酶水解為熒光素，后者不能自由透過細胞膜而滯留于細胞內，在熒光顯微鏡下根據(jù)熒光強度即可判斷原生質體死活。當前第47頁\共有75頁\編于星期四\8點5.影響原生質體體產量和活力的因素：（1）材料來源：選擇幼嫩組織分離原生質體，或快速生長愈傷組織或對數(shù)期懸浮細胞。（2）酶處理：酶的種類和濃度，處理時間，pH等條件。（3）滲透穩(wěn)定劑：酶液、原生質體清洗液和原生質體培養(yǎng)液均需保持適當?shù)臐B透壓。當前第48頁\共有75頁\編于星期四\8點（二）原生質體培養(yǎng)：1.培養(yǎng)方法：（1）固體培養(yǎng)：平板培養(yǎng)法，1.2%瓊脂,45oC.（2）液體培養(yǎng)：

A.淺層培養(yǎng)法:其過程是將1m1原生質體懸液置于直徑4cm培養(yǎng)皿或25m1三角瓶中使成薄層后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．初期振搖1—2次，防止粘壁；

B.懸滴培養(yǎng)法:其過程系將原生質體懸液滴入培養(yǎng)皿蓋內，其量分別為5一10、50—100及100一200ul等，保持一定滴距．每皿由幾滴至十幾滴不等，培養(yǎng)皿加入濃度低于培養(yǎng)液的液體，再將皿蓋翻蓋于皿上并置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

C.雙層培養(yǎng)法:先將固體培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿內冷卻成層，再將原生質體懸浮液置于已固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

D.看護培養(yǎng)法:在培養(yǎng)皿底層鋪一層正常密度且經(jīng)射線處理已失去分裂能力而有代謝活力的原生質體瓊脂混合物作飼養(yǎng)層，再于其上接種一層低密度(5一lo個／細胞／m1)懸浮原生質體培養(yǎng)。當前第49頁\共有75頁\編于星期四\8點原生質體培養(yǎng)常規(guī)方法與包埋球培養(yǎng)（圖片引自PlantCellReports，2007，26：719-725）當前第50頁\共有75頁\編于星期四\8點榆樹原生質體分離及培養(yǎng)（圖片引自PlantCellTissOrganCult，2006,86:359–366）當前第51頁\共有75頁\編于星期四\8點2.培養(yǎng)條件：

密度：平板培養(yǎng)103~104個/ml,液體培養(yǎng)104~105個/ml溫度：多數(shù)為25-28oC,少數(shù)16~37oC光照：500lx,18h或2800lx連續(xù)光照多數(shù)要求黑暗或弱光當前第52頁\共有75頁\編于星期四\8點3.細胞壁再生及細胞分裂：l一3天即再生新細胞壁，表現(xiàn)為體積增加、膨大，再由圓變橢圓?？捎觅|壁分離法或在稍微低滲溶液中出芽現(xiàn)象證實。也可用0.1%ST型或WBL型熒光增白劑染色，經(jīng)前者染色，有細胞壁者在熒光顯微鏡下呈藍色熒光。經(jīng)后者染色，有細胞壁者發(fā)射綠色熒光。在原生質培養(yǎng)過程中，胞質增加，液泡減少，葉綠體或顆粒內含物分散于泡質中或圍繞于細胞核周圍．常在1一2周內發(fā)生第一次分裂。不同細胞分裂頻率不同，常在1％—90％之間。當前第53頁\共有75頁\編于星期四\8點（引自K.-H.Neumannetal.,PlantCellandTissueCulture-AToolinBiotechnology,PrinciplesandPractice,?Springer-VerlagBerlinHeidelberg2009）當前第54頁\共有75頁\編于星期四\8點4.愈傷組織形成及胚狀體形成原生質體再生的細胞一旦開始分裂，就可能繼續(xù)生長：A.形成細胞團，發(fā)育成愈傷組織；愈傷組織通過器官發(fā)生或體細胞配途徑形成再生植株。B.形成胚狀體，再產生植株；

隨著細胞分裂及細胞團形成，已與常規(guī)細胞和組織培養(yǎng)相同，故培養(yǎng)3—4周需添加含一定量低滲穩(wěn)定劑的新培養(yǎng)基，以滿足細胞的營養(yǎng)，亦利于細胞團及小愈傷組織的生長。當前第55頁\共有75頁\編于星期四\8點

5.植株再生

除少數(shù)植物通過胚狀體直接發(fā)育成完整植株外，大多經(jīng)愈傷組織誘導分化形成芽及根再生為完整植株。當愈傷組織達到1—2mm時，轉移至分化培養(yǎng)基上誘導器官分化。分化培養(yǎng)基與原生質體培養(yǎng)基差別在于：(1)只用蔗糖為碳源，不加滲透穩(wěn)定劑；(2)與原生質體培養(yǎng)基相反，細胞分裂素濃度高于生長素;(3)在誘導器官分化過程中，一般采用15001x左右的高光強。誘導器官分化的溫度與原生質體培養(yǎng)基本相同。無根苗轉移至誘導生根的培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，其只含低濃度生長素，而不含細胞分裂素，無根苗一旦生根即可發(fā)育成完整植株。當前第56頁\共有75頁\編于星期四\8點

第三節(jié)園藝植物原生質體融合

在外界因素作用下，兩個或兩個以上植物細胞合并成一個多核細胞的過程稱為植物細胞融合，或植物體細胞雜交。但由于植物細胞具有堅硬的細胞壁，不能直接融合，需經(jīng)酶消化除去細胞壁釋放出原生質體，后者生理、生化及遺傳學特性與完整細胞基本相同。在適當條件下來源不同的植物原生質體可產生融合作用，并可再生細胞壁，形成完整植株。當前第57頁\共有75頁\編于星期四\8點植物體細胞雜交的過程植物細胞A植物細胞B原生質體A原生質體B原生質體融合正在融合的原生質體再生出細胞壁雜種細胞愈傷組織雜種植株去掉細胞壁植物組織培養(yǎng)植物細胞融合當前第58頁\共有75頁\編于星期四\8點當前第59頁\共有75頁\編于星期四\8點特點：(1)可實現(xiàn)遠緣雜交，獲得種間雜種，克服有性雜交配子不親合性；(2)可獲得含另一親本非整倍體雜種或胞質雜種，且獲得的遺傳變異范圍極廣；(3)一次操作可實現(xiàn)兩個以上親本的融合作用(4)可獲得呈現(xiàn)雙親個體基因型總和的雜種；(5)可形成有性生殖障礙植物的種間雜種；當前第60頁\共有75頁\編于星期四\8點一、細胞融合技術植物原生質體培養(yǎng)過程，有時無需任何處理亦產生融合現(xiàn)象，為自發(fā)融合，但融合率極低。異源原生質體融合需某種外力作用才能實現(xiàn)。1.化學融合（1）鹽類融合法：硝酸鹽（如NaNO3）、氯化物（如NaCl等）可中和原生質體表面負電荷，促進原生質體聚集，對原生質體無損害，可以用于融合，但融合率低；（2）高Ca2＋和高pH值誘導，如煙草葉肉原生質體于pH10.5，0.05mol/LCaCl2培養(yǎng)基中，37℃保溫，融合率可達25％，并可獲得雜種植株；(3)PEG誘導，在高濃度PEG溶液中，原生質體發(fā)生聚集作用，經(jīng)稀釋后，50％以上原生質體發(fā)生融合作用，且對多種不同原生質體均有效；(4)高Ca2+、高pH值及PEG結合誘導法，此為方法(2)和(3)相結合的改良法，高Ca2+和高pH值對原生質體損傷小，但對培養(yǎng)細胞原生質體促融作用小于PEG。(5)其他如葡聚糖硫酸酯、聚乙烯醇等融合方法。當前第61頁\共有75頁\編于星期四\8點2.物理融合：

包括顯微操作、離心震蕩、激光照射及電融合等，其中電融合應用最普遍。進行電融合時，將一定密度的原生質體懸液置于一個融合小室，小室兩端裝有電極，在不均勻的交變電場作用下，原生質體細胞彼此靠近，緊密接觸，在兩個電極間排列成串珠狀，此時