蛋白質(zhì)含量測定方法

蛋白質(zhì)含量測定院系名稱食品與生物工程學(xué)院學(xué)生姓名孫洪磊學(xué)號200606021064專業(yè)班級生工06-2指導(dǎo)教師馬美范二○○九年四月一日蛋白質(zhì)含量測定方法比較蛋白質(zhì)含量測定法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準蛋白質(zhì)。值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因為一種蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點。在選擇方法時應(yīng)考慮：①實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測定所要花費的時間?？捡R斯亮藍法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。一、雙縮脲法（Biuret法）（一）實驗原理雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。（二）試劑與器材1.試劑：（1）標(biāo)準蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標(biāo)準酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準蛋白溶液，可用BSA濃度1mg/ml的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標(biāo)準蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NNaOH配制。（2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10%NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需重新配制。2.器材：可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。

（三）操作方法1.標(biāo)準曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標(biāo)準蛋白質(zhì)溶液，用水補足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20~25℃）下放置30分鐘，于540nm處進行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準曲線。2、樣品的測定：取2~3個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。二、Folin—酚試劑法（Lowry法）（一）實驗原理1.試劑：（1）標(biāo)準蛋白質(zhì)溶液，用g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮蘭G—250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G—250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀釋至1升。2.器材：（1）可見光分光光度計（2）旋渦混合器（3）試管16支（三）操作方法1.標(biāo)準方法（1）取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G—250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。（2）加完試劑2~5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對照為第1號試管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250試劑。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡?？捡R斯亮蘭法實驗表格：

管號12345678910標(biāo)準蛋白質(zhì)00.010.020.040.060.080.10

(1.0mg/ml)

未知蛋白質(zhì)0.020.040.06

(約1.0mg/ml)

蒸餾水0.10.090.080.060.040.0200.080.060.04

考馬斯亮藍

G－250試劑5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0每管中的蛋白質(zhì)量（mg）光吸收值（A595）（3）用標(biāo)準蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準曲線。由此標(biāo)準曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。2.微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時（10－100mg/ml）,可將取樣量（包括補加的水）加大到0.5ml或1.0ml,空白對照則分別為0.5ml或1.0mlH2O,考馬斯亮藍G－250試劑仍加5.0ml,同時作相應(yīng)的標(biāo)準曲線，測定595nm