DNA重組技術(shù)課件

DNA重組技術(shù)徐紀(jì)茹2011-03-016/4/20231概述點(diǎn)擊輸入簡要文字內(nèi)容，文字內(nèi)容需概括精煉，不用多余的文字修飾，言簡意賅的說明分項(xiàng)內(nèi)容……點(diǎn)擊輸入簡要文字內(nèi)容，文字內(nèi)容需概括精煉，不用多余的文字修飾，言簡意賅的說明分項(xiàng)內(nèi)容……點(diǎn)擊輸入簡要文字內(nèi)容，文字內(nèi)容需概括精煉，不用多余的文字修飾，言簡意賅的說明分項(xiàng)內(nèi)容……123內(nèi)容提要一、DNA重組與DNA重組技術(shù)二、DNA重組技術(shù)發(fā)展簡史三、主要方法和技術(shù)路線四、意義及應(yīng)用6/4/20233DNA重組與DNA重組技術(shù)6/4/20234DNA重組(DNArecombination)： DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生的遺傳信息的重新共價(jià)組合過程。包括同源重組、特異位點(diǎn)重組和轉(zhuǎn)座重組等類型，廣泛存在于各類生物。6/4/20235轉(zhuǎn)化6/4/20236接合6/4/20237轉(zhuǎn)導(dǎo)6/4/202386/4/20239融源性轉(zhuǎn)換6/4/202310DNA重組技術(shù)(DNArecombinanttechniques)： 用人工手段對DNA進(jìn)行改造和重新組合的技術(shù)。包括對DNA分子的精細(xì)切割、部分序列的去除、新序列的加入和連接、DNA分子擴(kuò)增、轉(zhuǎn)入細(xì)胞的復(fù)制繁殖、篩選、克隆、鑒定和序列測定等等，是基因工程技術(shù)的核心。6/4/202311DNA重組技術(shù)的理論基礎(chǔ)19世紀(jì)中孟德爾

豌豆雜交試驗(yàn)

遺傳因子

經(jīng)典遺傳學(xué)20世紀(jì)初摩爾根

果蠅雜交實(shí)驗(yàn)

基因

基因?qū)W1944年艾弗瑞肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)遺傳物質(zhì)DNA1973年伯格-杰克森-考恩-鮑耶

DNA分子體外拼接分子遺傳學(xué)1953年沃森-克瑞克

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)

分子生物學(xué)基因工程6/4/202312DNA重組技術(shù)發(fā)展簡史6/4/202313重組DNA技術(shù)來源于兩個(gè)方面的基礎(chǔ)理論研究限制性核酸內(nèi)切酶（簡稱限制酶）

基因載體（簡稱載體）。6/4/202314限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其在分子遺傳學(xué)中的應(yīng)用阿爾伯

WemerArber

瑞士生物學(xué)家

巴塞爾Biozentrum大學(xué)

1929～內(nèi)森斯

DanienNathans

美國微生物學(xué)家

霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院

1931～史密斯

HamiltonO．Smith

美國微生物學(xué)家

霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院

1931～6/4/202315 1952年美國分子遺傳學(xué)家S.E.盧里亞在大腸桿菌中所發(fā)現(xiàn)的一種限制現(xiàn)象——從菌株甲的細(xì)菌所釋放的噬菌體能有效地感染同一菌株的細(xì)菌，可是不能有效地感染菌株乙；少數(shù)被感染的菌株乙的細(xì)菌所釋放的同一噬菌體能有效地感染菌株乙可是不能有效地感染菌株甲。限制性核酸內(nèi)切酶（簡稱限制酶）6/4/202316 阿爾伯（Arber,Werner）研究表明，細(xì)菌細(xì)胞能夠通過一種“限制酶”的存在來保護(hù)自己，抵御噬菌體的攻擊。這種限制酶通過分裂噬菌體的DNA使之大部或全部失活，從而遏制噬菌體的生長。到1968年，阿爾伯收集了足夠多的關(guān)于限制酶的資料，終于能夠證明一種特別的限制酶的存在，它只分裂那些含有為噬菌體所特有的某種序列的核苷酸。6/4/202317 內(nèi)森斯（Nathans,Daniel）與史密斯合作，研究了能在特定部位分裂DNA分子的酶。這使人們有可能對已知的大得足以帶有遺傳信息的核酸片斷進(jìn)行研究。這項(xiàng)研究于1971年完成，以后又導(dǎo)致了旨在把核酸拆開再按其它結(jié)構(gòu)加以組裝的重組DNA的研究工作。6/4/202318 史密斯在研究流感嗜血桿菌從噬菌體P22接受DNA的機(jī)制時(shí)，于1968年發(fā)現(xiàn)了一類新的限制酶，它們分別在特定部位切斷DNA分子，因此可用以研究DNA分子中核苷酸的順序和用于DNA重組技術(shù)。6/4/202319基因載體（簡稱載體）

主要是質(zhì)粒和溫和噬菌體（見轉(zhuǎn)導(dǎo)）兩類。

1952年，英國微生物遺傳學(xué)家W．海斯和美國微生物遺傳學(xué)家 J．萊德伯格等在首先認(rèn)識到大腸桿菌的F因子是染色體外的遺 傳因子。

1953年，法國學(xué)者P．弗雷德里克等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌產(chǎn)生大腸桿菌 素這一性狀為一種染色體外的大腸桿菌素因子所控制。

1957年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)了抗藥性質(zhì)粒。后兩類質(zhì)粒都是在遺傳工 程中廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒。重組DNA技術(shù)中廣泛應(yīng)用的噬菌體是大腸桿菌的溫和噬菌體 λ，它是在1951年由美國學(xué)者E．萊德伯格等發(fā)現(xiàn)的。6/4/202320主要方法和技術(shù)路線6/4/202321重組DNA技術(shù)包括：1.目的基因的獲取2.克隆載體的選擇與構(gòu)建3.外源基因與載體的連接4.重組DNA導(dǎo)入受體菌5.重組體的篩選6.克隆基因的表達(dá)6/4/202322酶切連接轉(zhuǎn)化擴(kuò)增檢測目的基因的獲取克隆載體的構(gòu)建外源基因與載體的連接（體外重組）重組DNA導(dǎo)入受體菌轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定克隆基因的表達(dá)6/4/202323DNA克隆的基本過程分：分離目的基因切：對目的基因和載體適當(dāng)切割接：目的基因與載體連接轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌篩：篩選出含有重組體的受菌體6/4/202324基因工程技術(shù)策略分：

基因載體

目的基因質(zhì)粒噬菌體病毒直接分離cDNA人工合成基因文庫切：

限制性內(nèi)切酶有缺口的載體目的基因接：

連接酶粘端連接平端連接尾接法重組體轉(zhuǎn)：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染體外包裝帶重組體的宿主篩：表型篩選電泳法核酸雜交6/4/2023256/4/2023266/4/202327限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA連接酶——“分子縫合針”基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”DNA重組技術(shù)的基本工具

6/4/202328限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶I

逆轉(zhuǎn)錄酶

DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶工具酶6/4/202329限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）

識別DNA的特異序列，并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。 是細(xì)菌內(nèi)存在的保護(hù)性酶。分為I、II、III三類。II類酶識別序列特點(diǎn)為回文結(jié)構(gòu)。 ······GGATCC······ ······CCTAGG······

限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”6/4/202330限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種末端：鈍性末端(bluntend)

粘性末端(stickyend)6/4/202331

5′-端突出粘性末端 3′-端突出

限制性核酸內(nèi)切酶識別序列長度為4~8個(gè)bp。不同酶切產(chǎn)生的相同粘性末端稱配伍末端（compatibleend），可用連接酶連接。6/4/202332限制酶6/4/2023336/4/2023346/4/202335①利用限制酶取得具有粘性末端或平整末端的 DNA片段；②用機(jī)械方法剪切取得具有平整末端的DNA片 段，例如用超聲波斷裂雙鏈DNA分子；③經(jīng)反向轉(zhuǎn)錄酶的作用從mRNA獲得與mRNA 順序互補(bǔ)的DNA單鏈，然后再復(fù)制形成雙鏈 DNA（cDNA）；④用化學(xué)方法合成DNA片段。目的基因6/4/2023366/4/202337載體連接①粘性末端連接②平整末端連接③同聚末端連接,（也稱末端轉(zhuǎn)移酶）④人工接頭分子連接6/4/202338DNA連接酶——“分子縫合針”連接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E·coli連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到，稱為T4連接酶。這兩種連接酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而不能連接單鏈DNA。E·coli連接酶只能連接黏性末端；T4連接酶既可“縫合”黏性末端，又可“縫合”平末端。6/4/2023396/4/202340基因的載體——“分子運(yùn)輸車”載體必須具備的條件：

1、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；2、具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接；3、具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。（如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等）4、對受體細(xì)胞無害載體的作用：

1、將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。2、利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞內(nèi)，對外源基因進(jìn)行大量復(fù)制。常用的載體有：

質(zhì)粒，λ噬菌體的衍生物，動(dòng)植物病毒等6/4/2023416/4/202342

質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中自然存在于染色體外可以自主復(fù)制的一段環(huán)狀DNA分子。進(jìn)入到宿主細(xì)胞中的一個(gè)質(zhì)?？梢源罅吭黾悠淇截悢?shù)。質(zhì)粒6/4/202343質(zhì)粒（plasmid）

是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小約為數(shù)千堿基對。常有1~3個(gè)抗藥性基因，以利于篩選。6/4/202344質(zhì)粒載體

的一般結(jié)構(gòu)6/4/202345DNA克隆常用載體6/4/202346噬菌體（phage）DNA

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng) λgt系列（插入型，適用cDNA克?。?EMBL系列（置換型，適用基因組克?。?/p>

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列6/4/202347 其他

柯斯質(zhì)粒（cosmid） 酵母人工染色體載體 （yeastartificialchromosome,YAC） 細(xì)菌人工染色體 （bacterialartificialchromosome,BAC） 動(dòng)物病毒DNA改造的載體 （如腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒）6/4/202348質(zhì)粒載體

ori

復(fù)制起點(diǎn)

MCS多克隆位點(diǎn)

Ampr

氨芐青霉素抗性基因

LacZ’β-半乳糖苷酶基因的部分序列

P啟動(dòng)子AmprlacZ’MCSPT7oriPSP6pGEM3z6/4/202349噬菌體載體由野生型噬菌體改建，消除或改變基因組必須區(qū)內(nèi)的不必要的酶切位點(diǎn)6/4/2023506/4/202351NATURE|Vol444|21/28December2006YAC酵母人工染色體容載能力大350-1000kb存在嵌合現(xiàn)象，即一個(gè)YAC克隆中的DNA片段可能來自兩個(gè)或多個(gè)不同的片段YAC克隆的穩(wěn)定性差轉(zhuǎn)化效率低6/4/202352BAC細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體是由大腸桿菌單拷貝F質(zhì)粒衍生而成100-350kb遺傳穩(wěn)定性高，易轉(zhuǎn)化，嵌合及重組現(xiàn)象少BIBAC,雙元細(xì)菌人工染色體TAC，可轉(zhuǎn)化人工染色體6/4/2023536/4/202354①轉(zhuǎn)化，用質(zhì)粒作載體所常用的方法。②轉(zhuǎn)染，用噬菌體DNA作載體所用的方法，這里 所用的噬菌體DNA并沒有包上它的外殼。③轉(zhuǎn)導(dǎo)，用噬菌體作載體所用的方法，這里所用 的噬菌體DNA被包上了它的外殼，不過這外殼 并不是在噬菌體感染過程中包上，而是在離體 情況下包上的，所以稱為離體包裝。④注射，如果宿主是比較大的動(dòng)植物細(xì)胞則可以 用注射方法把重組DNA分子導(dǎo)入。導(dǎo)入宿主細(xì)胞6/4/2023556/4/2023566/4/202357重組DNA分子的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過程。轉(zhuǎn)化常用的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序6/4/202358陽性克隆的篩選和檢測目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶DNA連接酶載體自連目的基因自連重組體6/4/202359陽性克隆的檢測方法抗藥性標(biāo)記選擇藍(lán)白斑篩選分子雜交法插入片段大小的鑒定（酶切，PCR）測序---6/4/202360(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇BamHⅠ6/4/202361

藍(lán)-白篩選（α互補(bǔ)）許多載體（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和氨基端145個(gè)氨基酸的編碼信息（LacZ’）。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）。這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。宿主和載體編碼的片段各自均無酶活性，但它們可以互補(bǔ)形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這種現(xiàn)象稱為α互補(bǔ)。6/4/202362乳糖操縱元LacZ基因編碼半乳糖苷酶分解Xgal→BlueproductLacZ’6/4/202363α互補(bǔ)的檢測6/4/2023646/4/202365菌落原位雜交6/4/202366Southernblot6/4/202367Northernblot6/4/202368熒光染色體原位雜交

(FluorescenceinsituHybridization；FISH)基本原理是將DNA探針用熒光染料標(biāo)記，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體上，來檢測DNA序列在染色體上的