HPLC技術(shù)講座系列之色譜柱的日常維護(hù)及應(yīng)用解決方案課件

WelchMaterials,Inc.HPLC技術(shù)系列講座之----

色譜柱的日常維護(hù)及

應(yīng)用解決方案

主講人：陳再潔（技術(shù)部工程師）月旭材料科技(上海)有限公司色譜柱的維護(hù)色譜柱使用的六大誤區(qū)異常色譜峰產(chǎn)生的原因和解決方案一四三二色譜柱的正確使用概述一、色譜柱的正確使用正確的溫度范圍正確的PH范圍正確的維護(hù)正確的流動(dòng)相組成正確的保存良好的使用習(xí)慣仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)樣品前處理正確安裝色譜柱正確的溫度范圍正確的PH范圍正確的維護(hù)正確的流動(dòng)相組成正確的保存良好的使用習(xí)慣仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)樣品前處理正確安裝色譜柱正確的溫度范圍正確的PH范圍正確的維護(hù)正確的流動(dòng)相組成正確的保存良好的使用習(xí)慣使用前的準(zhǔn)備工作樣品前處理閱讀使用說(shuō)明書(shū)1）使用注意事項(xiàng)2）pH使用范圍3）保存流動(dòng)相按箭頭方向連接色譜柱用流動(dòng)相走基線(xiàn)至平穩(wěn)進(jìn)樣使用前的準(zhǔn)備工作按說(shuō)明書(shū)要求活化色譜柱使用緩沖鹽時(shí)需要特別注意置換，不要使緩沖鹽析出特殊樣品檢測(cè)，需用樣品溶液進(jìn)行色譜柱老化色譜柱的正確連接如果伸出的管線(xiàn)長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)，可能漏液

螺母坡度不匹配，密封性差

死體積區(qū)如果伸出的管線(xiàn)長(zhǎng)度不夠，可能產(chǎn)生死體積HPLC的色譜柱接頭HPLC常用色譜柱接頭：廠(chǎng)家WelchWatersshimadzuPhenomenexAgilentdikma管前端長(zhǎng)度/mm2.03.32.42.02.332.350

mL

柱外體積（管線(xiàn)）4321Time(min)0.00.51.01.52.010mL

柱外體積Time(min)0.00.51.01.52.04321樣品:

1.苯丙胺酸2.5-苯基-3,6-二氧-2-哌嗪乙酸3.Asp-Phe4.天冬甜素4321Time(min)0.00.51.01.52.010mL

柱外體積Time(min)0.00.51.01.52.04321<0.12mm內(nèi)徑管線(xiàn)用于毛細(xì)管HPLC中<2.1mm內(nèi)徑色譜柱0.17mm內(nèi)徑管線(xiàn)用于分析型HPLC中2.1~4.6mm內(nèi)徑色譜柱0.25mm內(nèi)徑管線(xiàn)用于半制備型HPLC中9.4mm內(nèi)徑色譜柱0.5mm內(nèi)徑管線(xiàn)用于制備型HPLC中21.2mm內(nèi)徑色譜柱正確的PH使用范圍

1、禁止在色譜柱PH值要求范圍以外使用2、避免在色譜柱臨界PH值處長(zhǎng)期使用在什么樣的PH值范圍內(nèi)使用色譜柱是正確的？保留時(shí)間酸性組份中性組份堿性組份方法穩(wěn)定區(qū)方法波動(dòng)區(qū)(pKa+1.5)

方法穩(wěn)定區(qū) 液相柱---保留值與pH的關(guān)系不同填料基質(zhì)對(duì)PH不同的耐受表現(xiàn)

有機(jī)無(wú)機(jī)雜化硅膠基質(zhì)

(pH1.0-12.5）硅膠基質(zhì)（pH2-7.5）Al2O3·nH2O(pH1-14）聚合物基質(zhì)

(pH1-14）高柱效高機(jī)械強(qiáng)度

寬PH高或低pH下,硅膠會(huì)溶解化學(xué)修飾困難柱效不夠高Welch公司反相色譜柱使用范圍；Ultimate?是1.5-10.0CN填料是1.5-9.0Xtimate?是1.0-12.5Welchrom?是1.5-10.0LP系列填料是1.0-8.0常見(jiàn)緩沖鹽的PH值

緩沖液 pKa pH范圍磷酸鹽pK1 2.1 1.1~3.1檸檬酸鹽pK1 3.1 2.1~4.1甲酸鹽 3.8 2.8~4.8檸檬酸鹽pK2 4.7 3.7~5.7乙酸鹽 4.8 3.8~5.8檸檬酸鹽pK3 5.4 4.4~6.4磷酸鹽pK2 7.2 6.2~8.2羥甲基甲胺 8.3 7.3~9.3氨 9.2 8.2~10.2硼酸鹽 9.2 8.2~10.2甘氨酸 9.8 8.8~10.81-甲基-哌啶 10.3 9.3~11.3四氫化吡咯 10.5 9.5~11.5二乙胺 10.5 9.5~11.5三乙胺 10.7 9.7~11.7磷酸鹽pK3 12.3 11.3~13.3正確的溫度范圍問(wèn)：為什么色譜柱有溫度要求？答：1、得到良好的時(shí)間重復(fù)性；

2、適當(dāng)?shù)奶岣咧鶞?，可以減小流動(dòng)相的粘度，降低色譜柱背壓；升高柱效；

3、柱溫過(guò)高，會(huì)加快填料的溶解，縮短色譜柱使用壽命.問(wèn):色譜柱的正確使用溫度是多少？答：＜40℃（正常壽命）

；＞40℃（縮短壽命）

。正確的流動(dòng)相的組成良好的化學(xué)性能各相之間良好的互溶性合適的緩沖鹽濃度適宜的PH值范圍適宜的有機(jī)相比例相塌陷甲醇水下的碳鏈形狀100%水下的碳鏈形狀

水乙腈

0.1%的醋酸柱子加壓270bar持續(xù)10分鐘水/乙腈(40/60)1ml/min30min0.1%的醋酸普通C8柱

0.1%的醋酸阿莫西林的檢測(cè)：正確的保存色譜柱內(nèi)不含緩沖鹽或離子對(duì)試劑長(zhǎng)期保存80%左右有機(jī)相保存（甲醇或乙腈）（短期保存，可以用不含緩沖鹽的流動(dòng)相保存）塑料堵頭擰緊典型的有機(jī)物分析流程圖采集樣品處理儀器分析收集提取儲(chǔ)存濃縮分離定性定量樣品前處理的重要性提高檢測(cè)限保護(hù)儀器色譜柱提高選擇性樣品前處理的一般原則：a、盡可能的除去樣品雜質(zhì)；b、使用流動(dòng)相溶解樣品；c、使用預(yù)處理柱（如：SPE小柱）除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)；d、使用0.45μm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。二、色譜柱的維護(hù)色譜柱的維護(hù)特殊維護(hù)日常維護(hù)日常維護(hù)——每次分析完成后的色譜柱維護(hù)正向使用反向沖洗特殊維護(hù)——色譜柱出現(xiàn)異常時(shí)的維護(hù)柱壓升高柱效降低固體顆粒物質(zhì)堵塞緩沖鹽析出填料污染固定相的流失強(qiáng)保留物質(zhì)的累積正常升高異常升高什么是柱壓正常升高？緩慢升高柱壓在短時(shí)間內(nèi)快速上升什么是柱壓的異常升高？固體顆粒物質(zhì)堵塞篩板流動(dòng)相和樣品中的固體顆粒物質(zhì)流動(dòng)相抽濾過(guò)0.45um濾膜樣品針筒過(guò)濾0.45um濾膜泵密封圈和管路磨損產(chǎn)生的固體顆粒物質(zhì)接保護(hù)柱接在線(xiàn)過(guò)濾器保護(hù)柱和在線(xiàn)過(guò)濾器緩沖鹽的析出緩沖鹽析是怎么析出的？怎樣防止緩沖鹽析出？有機(jī)溶劑/飽和緩沖液＝70/30ABC100%有機(jī)溶劑A+B＝C鹽析出緩沖鹽析出原理緩沖鹽的正確使用方法流動(dòng)相走基線(xiàn)過(guò)渡流動(dòng)相過(guò)渡進(jìn)樣分析完成后用過(guò)渡流動(dòng)相反向沖洗40min用甲醇或乙腈水溶液反向沖洗40min過(guò)渡流動(dòng)相：指有機(jī)相和水相比例與分析流動(dòng)相相同，或者水的比例”大于“分析流動(dòng)相中緩沖鹽溶液的比例

使用舉例甲醇/緩沖液＝70/30—走基線(xiàn)進(jìn)樣√×甲醇/水＝70/30—過(guò)渡甲醇/緩沖液＝70/30—走基線(xiàn)進(jìn)樣甲醇/水＝70/30—過(guò)渡分析完成后用甲醇或乙腈沖洗色譜柱固定相的流失硅膠基質(zhì)溶解規(guī)律——高水、高溫度、高pH鍵合相流失規(guī)律——低pH、高水流動(dòng)相pH、水相需限定在色譜柱允許范圍內(nèi)強(qiáng)保留物質(zhì)累積的維護(hù)方案一.流動(dòng)相中不含緩沖鹽分析完成后，用純甲醇或乙腈沖洗色譜柱45min；二.流動(dòng)相中含有緩沖鹽分析完成后，先用過(guò)渡流動(dòng)相沖洗45min，然后再用純甲醇或乙腈沖洗色譜柱45min；強(qiáng)保留物質(zhì)累積的維護(hù)方案

Welch公司色譜柱最佳維護(hù)方案一.流動(dòng)相中不含緩沖鹽分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min；二.流動(dòng)相中含有緩沖鹽分析完成后，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向沖洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min；色譜柱再生

（用下列每種溶劑20~30倍柱體積沖洗）反相色譜柱100％甲醇---100％乙腈---75％乙腈/25％異丙醇---100％異丙醇---100％二氯甲烷---100％正己烷---100％異丙醇正相色譜柱50：50正己烷/氯仿---

甲醇---

二氯甲烷或者100%醋酸乙酯油脂類(lèi)物質(zhì)，可用異丙醇清洗處理正相色譜柱試劑嚴(yán)格除水色譜柱柱體積

4.6x50 0.83mL0.62 4.6x30 0.5mL0.37 4.6x250 4.15mL3.11 4.6x150 2.5mL1.87 2.1x50 0.17mL0.13 2.1x30 0.10mL0.08

色譜柱空柱管柱 尺寸 體積體積

(mm)（mL）（ml）三、異常色譜峰產(chǎn)生的原因和解決方案常見(jiàn)異常色譜峰：前延峰；拖尾峰；叉峰（裂峰）；寬峰/饅頭峰。前延峰解決方案幾種常見(jiàn)的前延峰峰前延解決方案1.樣品過(guò)載前拖、后拖或平頭峰2.溶劑效應(yīng)----使用流動(dòng)相溶解樣品a.用純甲醇溶解樣品Tf＝0.891b.用流動(dòng)相溶解樣品Tf＝1.072流動(dòng)相為乙腈：4%冰醋酸水溶液＝48：52

姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品

用流動(dòng)相溶解樣品的替代方案用流動(dòng)相稀釋至原來(lái)濃度的1/4倍a.用純甲醇溶解樣品Tf＝0.811b.將a圖中的樣品用流動(dòng)相稀釋至原來(lái)濃度的1/4倍Tf=0.980c.用流動(dòng)相溶解樣品Tf＝1.028石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定

色譜柱：UlitmateXB－C18，4.6×250mm；

流動(dòng)相：甲醇：緩沖鹽溶液(0.08M醋酸銨水溶液，冰醋酸調(diào)節(jié)PH至6.0)＝25：75；

檢測(cè)波長(zhǎng)：308nm；

溫度：室溫26度；

流速:1ml/min；

進(jìn)樣量：20ul

3.緩沖鹽濃度較低----增加流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度a.乙腈：3%磷酸：無(wú)水乙醇＝80：10：10Tf＝0.737b.（乙腈：3%磷酸：無(wú)水乙醇）＝80：10：10）：50mM磷酸二氫鈉＝80：20Tf＝0.930注射用苦參堿的測(cè)定

色譜柱：UltimateXB-NH2-2,5um,4.6×250mm；

柱

溫：室溫24度；

流速：1.0ml/min；

檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；

進(jìn)樣量：20ul；

4.流動(dòng)相中加入適量的四氫呋喃a.50mM磷酸二氫鉀（用2mol/L的KOH溶解調(diào)節(jié)pH5.0）/乙腈＝97.5/2.5Tf＝0.873c.50mM磷酸二氫鉀（用2mol/L的KOH溶解調(diào)節(jié)pH5.0）/乙腈/THF＝97.5/2.5/1Tf＝0.986阿莫西林膠囊的測(cè)定

色譜柱：UltimateAQ－C18，5um，4.6×250mm；

檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；

溫度：室溫28度；

流

速：1.0ml/min；

進(jìn)樣量：20ul；

5）柱溫太低----適當(dāng)升高柱溫的溫度有助于增加流動(dòng)相傳質(zhì)速率，減少因靜電作用引起的前拖。

2）柱外死體積大色譜柱反沖，修復(fù)色譜柱；選擇性能良好的色譜柱。

硬件原因：1）色譜柱損壞(篩板阻塞和柱頭塌陷

)

、裝填不當(dāng)用細(xì)徑管路和小體積流通池，各接口連接緊密。

拖尾峰解決方案

幾種常見(jiàn)的拖尾峰地紅霉素：Tf=1.268二甲基苯氧乙酸：Tf=1.991頭孢地嗪鈉：Tf=3.109拖尾峰解決方案通常非極性和弱極性的化合物能獲得良好的峰形，而帶有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等極性基團(tuán)的化合物則比較容易產(chǎn)生拖尾拖尾產(chǎn)生機(jī)理——與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)這些基團(tuán)的離子態(tài)－COO－、－N＋H3、－N＋H2R、－N＋HR2拖尾峰解決方案拖尾產(chǎn)生機(jī)理——與殘余硅羥基有關(guān)硅羥基的特性：1）具有一定的極性－Si－Oδ－Hδ＋2）Si－OH的pKa為4.5~4.73）硅羥基的離子態(tài)－Si－O－拖尾峰解決方案頭孢尼西鈉的測(cè)定50mg/100ml

用流動(dòng)相溶解樣品Tf＝2.248

頭孢尼西鈉的測(cè)定0.5mg/100ml用流動(dòng)相溶解樣品Tf＝1.068頭孢尼西鈉的測(cè)定

色譜柱：Ultimate?XB－C18，5um，4.6×250mm波長(zhǎng)：272nm流動(dòng)相：0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)PH3.5）：乙腈＝84：16

溫度：室溫17℃流速：1.0ml/min進(jìn)樣量：20ul樣品過(guò)載對(duì)峰形的影響色譜柱：Ultimate?XB－C18，5um，4.6×250mm

波長(zhǎng)：280nm磷酸鹽緩沖溶液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取磷酸二氫鈉7.8g溶于1000ml水中，攪拌均勻，使之溶解，用磷酸將pH值調(diào)至2.50溫度：室溫26℃流速：1.0ml/min進(jìn)樣量：20ul流動(dòng)相：甲醇：磷酸鹽緩沖溶液=70：30（混合好后，測(cè)得pH為4.07）N＝15633Tf＝1.15流動(dòng)相：甲醇：磷酸鹽緩沖溶液=70：30（甲醇和磷酸鹽緩沖溶液混合好后用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.49）N＝16719Tf＝1.105二甲基苯氧乙酸結(jié)構(gòu)式流動(dòng)相中加入酸峰形后拖解決方案3.增加緩沖鹽或增大緩沖鹽的濃度溴化氫高烏甲素結(jié)構(gòu)式色譜柱：Ultmate?XB-C18,5um,4.6×250mm波長(zhǎng)：252nm流動(dòng)相：甲醇：水＝75：25溫度：室溫15℃流速：1.0ml/min進(jìn)樣量：20ul用流動(dòng)相溶解樣品N＝1281Tf＝1.444色譜柱：Ultmate?XB-C18,5um,4.6×250mm波長(zhǎng)：252nm流動(dòng)相：甲醇：50mmol/L磷酸二氫鈉溶液＝75：25（混合好后，用三乙胺調(diào)節(jié)pH至8.40，即200ml混合好的溶液中加入75ul三乙胺）溫度：室溫15℃流速：1.0ml/min進(jìn)樣量：20ul用流動(dòng)相溶解樣品N＝9230Tf＝0.987頭孢噻肟鈉結(jié)構(gòu)式色譜柱：Ultimate?XB-C18,5um,4.6×250mm波長(zhǎng)：254nm流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖溶液：甲醇＝80：20（混合好后，測(cè)得pH為8.4）緩沖鹽的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取60mg磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉1.2g溶于1000ml水中，攪拌均勻柱溫：室溫12℃流速：1.0ml/min進(jìn)樣量：20ulN＝3422Tf＝2.503色譜柱：Ultimate?XB-C18,5um,4.6×250mm波長(zhǎng)：254nm流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖溶液：甲醇：三乙胺＝80：20：2（混合好后，用磷酸調(diào)節(jié)至pH8.4）緩沖鹽的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取60mg磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉1.2g溶于1000ml水中，攪拌均勻柱溫：室溫12℃流速：1.0ml/min進(jìn)樣量：20ul流動(dòng)相中加入三乙胺2）柱外死體積大色譜柱反沖，修復(fù)色譜柱，選擇性能良好的色譜柱。

硬件原因：1）色譜柱損壞(篩板阻塞和柱頭塌陷

)，裝填不當(dāng)用細(xì)徑管路和小體積流通池，各接口連接緊密。

3）色譜柱被強(qiáng)保留物質(zhì)污染充分沖洗色譜柱。

峰分叉（裂峰）反向沖洗進(jìn)樣次數(shù)少進(jìn)樣次數(shù)多柱污染保護(hù)柱或分析柱被固體顆粒阻塞a、取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析；b、更換保護(hù)柱；c、柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染，運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧?；d、反向沖洗色譜柱。峰分叉（裂峰）最有可能的原因修補(bǔ)色譜柱柱頭塌陷峰分叉（裂峰）進(jìn)樣溶劑化效應(yīng)峰分叉（裂峰）樣品溶劑極性小于流動(dòng)相樣品溶劑盡可能與流動(dòng)相匹配用流動(dòng)相溶解樣品其他原因及解決方案保護(hù)柱填料與分析柱填料不一致----更換保護(hù)柱，最好使用相同廠(chǎng)家相同品牌的保護(hù)柱和分析柱流動(dòng)相堿性過(guò)強(qiáng)----由于硅膠溶解使柱塌陷峰分叉（裂峰）寬峰/饅頭峰物質(zhì)在色譜柱擴(kuò)展寬峰/饅頭峰流動(dòng)相柱外效應(yīng)色譜柱比例改變流速太低緩沖鹽濃度低樣品池過(guò)大記錄儀響應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)色譜柱與檢測(cè)器間管路不適合色譜柱或保護(hù)柱污染柱頭塌陷色譜柱過(guò)載柱溫過(guò)低比例改變流速太低緩沖鹽濃度低比例改變流速太低流動(dòng)相緩沖鹽濃度低比例改變流速太低柱外效應(yīng)樣品池過(guò)大色譜柱與檢測(cè)器間管路不適合柱外效應(yīng)樣品池過(guò)大記錄儀響應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)色譜柱與檢測(cè)器間管路不適合柱外效應(yīng)樣品池過(guò)大色譜柱色譜柱或保護(hù)柱污染柱頭塌陷色譜柱色譜柱或保護(hù)柱污染色譜柱過(guò)載柱頭塌陷色譜柱色譜柱或保護(hù)柱污染柱溫過(guò)低色譜柱過(guò)載柱頭塌陷色譜柱色譜柱或保護(hù)柱污染色譜柱使用過(guò)程中的不良習(xí)慣高流速再生色譜柱純水才能沖干凈緩沖鹽使用緩沖鹽時(shí)，不過(guò)渡色譜柱污染后，不對(duì)儀器進(jìn)行清洗用極性相差太大的流動(dòng)相互換使用過(guò)程中突然增加或減小柱壓樣品或流動(dòng)相看不見(jiàn)雜質(zhì)就不過(guò)濾塑料瓶裝水或有機(jī)溶劑純水或緩沖鹽使用多天流動(dòng)相混勻過(guò)濾、脫氣后，又搖晃四、色譜柱使用六大誤區(qū)色譜柱使用六大誤區(qū)：1、HPLC色譜柱不能反轉(zhuǎn)使用：反轉(zhuǎn)后會(huì)出現(xiàn)填料塌陷、鍵合相無(wú)法展開(kāi)

錯(cuò)誤!裝填色譜柱壓力，