第十一章DNA文庫的構(gòu)建和目的基因的篩選

本章提要基因組文庫的構(gòu)建cDNA文庫的構(gòu)建DNA文庫篩選重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方式當(dāng)前第1頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)本章要求掌握基因組文庫、cDNA文庫的概念及構(gòu)建方法；DNA文庫的篩選方法（包括表型篩選法、PCR篩選法、酵母雙雜交系統(tǒng)）及原理；熟悉基因組文庫質(zhì)量檢測(cè)方法；DNA文庫的分類；DNA文庫的保存方法；了解各種類型cDNA文庫（全長cDNA文庫、差減cDNA文庫等）的構(gòu)建原理；外源DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞的主要方法。當(dāng)前第2頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)基因庫(genepool)：特定生物體全基因組的集合(天然存在)

?；蛭膸?genelibrary)：指某一生物體全部或部分基因的集合

。某個(gè)生物的基因組DNA或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽性菌落（或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫。根據(jù)外源DNA片段來源的不同，基因文庫分為：基因組文庫：材料來自染色體DNA，含有全部基因組序列。任何器官、組織、細(xì)胞、任何發(fā)育時(shí)期以及在任何環(huán)境下，基因組DNA是衡定的，所以用該生物的任何材料均可構(gòu)建基因組DNA文庫且具有一致性。定義和分類當(dāng)前第3頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)基因組文庫：分離特定的基因、分析特定基因的結(jié)構(gòu)、研究基因的起源與進(jìn)化、基因的表達(dá)調(diào)控cDNA文庫：大規(guī)?；驕y(cè)序、發(fā)現(xiàn)和尋找新基因、基因注釋、基因表達(dá)譜分析、基因功能研究cDNA文庫：材料來自mRNA，含有全部蛋白編碼基因的cDNA，無啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等，序列信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫。在高度分化的生物體中，不同器官、組織、細(xì)胞、不同發(fā)育時(shí)期以及對(duì)不同環(huán)境的應(yīng)答中，mRNA種類和豐度不同，即表達(dá)譜不同，因此同種生物體的cDNA文庫隨表達(dá)譜變化而變化，用什么材料構(gòu)建什么樣的cDNA文庫依研究目標(biāo)而定。當(dāng)前第4頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)DNA文庫構(gòu)建的基本程序1、提取研究對(duì)象基因組DNA，制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器官的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；2、DNA片段或cDNA與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組DNA；3、重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后侵染受體菌；4、陽性重組菌落或噬菌斑的選擇。當(dāng)前第5頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)第一節(jié)

基因組DNA文庫的構(gòu)建定義：指將某生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長度范圍的DNA片段，與合適的載體體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性菌落。當(dāng)前第6頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)根據(jù)構(gòu)建文庫載體的不同，分為：1、質(zhì)粒文庫：容納片段小于10kb，以菌落的形式保存和篩選，一般用于對(duì)大片段文庫的亞克隆，用于鳥槍法測(cè)序等。2、噬菌體文庫：一般用λ載體，插入型容納片段小于7kb，適合于構(gòu)建cDNA文庫，置換型容納9-25kb，適合于構(gòu)建亞克隆文庫或直接構(gòu)建基因組文庫。3、粘粒文庫：一般用于直接構(gòu)建基因組文庫，最長插入片段比λ文庫略長，達(dá)45kb左右。4、人工染色體文庫：有細(xì)菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、P1人工染色體(PAC)等文庫，最大插入片段分別為300kb、1000kb和300kb，是大片段文庫，主要用于基因組測(cè)序和物理圖譜構(gòu)建。5、亞基因組文庫：相對(duì)于基因組文庫提出的，文庫的對(duì)象不是全基因組范圍，而是基因組的某一區(qū)段。亞基因組文庫主要應(yīng)用在基因組較小的物種基因克隆或大基因組物種的后期研究。當(dāng)前第7頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)文庫的代表性和隨機(jī)性代表性是指文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來可以覆蓋整個(gè)基因組，即可以從該文庫中分離任何一段DNA。采用兩個(gè)策略提高代表性：一是采用部分酶切或隨機(jī)切割的方法來消化染色體DNA，以保證克隆的隨機(jī)性，保證每段DNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等；二是提高文庫所含基因組DNA的總?cè)萘?，通常用覆蓋基因組的倍數(shù)來衡量。文庫的總?cè)萘坑赏庠雌蔚钠骄L度和重組克隆的數(shù)量共同決定。當(dāng)前第8頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)為預(yù)測(cè)一個(gè)完整基因組文庫應(yīng)包含克隆的數(shù)目，Clark和Carbon于1975年提出如下的計(jì)算公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）N：代表一個(gè)完全基因組文庫所應(yīng)該包含的重組克隆個(gè)數(shù)

p：表示所期望的目的基因在文庫中出現(xiàn)的幾率

f：表示重組克隆平均插入片段的大小和基因組DNA大小的比值當(dāng)前第9頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)哺乳動(dòng)物：3*109bp若p=99%，平均克隆片段長度20kbf=20kb/3*107kbN=690773.2E.Coli：4639221bpp=99%，f=20kb/4600kbN=1056.9p=99%，f=10kb/4600kbN=2116當(dāng)前第10頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)隨機(jī)性既表示構(gòu)建文庫時(shí)要從基因組DNA獲得隨機(jī)斷裂的片段，也表示構(gòu)建好的文庫中所有基因要有相等的篩選概率。除了代表性和隨機(jī)性外，一個(gè)理想的基因文庫還應(yīng)具備下列條件：

1、重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；

2、載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆

3、克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利于克隆排序和染色體步查；

4、克隆片段易于從載體分子上完整卸下進(jìn)行亞克隆；

5、重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增和篩選，文庫繁殖后失真度小。當(dāng)前第11頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)載體的選擇構(gòu)建大片段基因組DNA文庫使用的載體主要有λ噬菌體（λphage）、粘粒載體（cosmid）、細(xì)菌人工染色體（BacterialArtificialChromosomes,BAC）、酵母人工染色體YAC（YeastArtificialChromosomes,YACs）、P1（BacteriophageP1）和PAC。根據(jù)特征，這些載體可以分為兩類:一類是基于噬菌體改建的，利用了噬菌體的包裝效率高和雜交篩選背景低的優(yōu)點(diǎn)；

另一類經(jīng)改造的質(zhì)粒載體或人工染色體，其主要優(yōu)點(diǎn)在于可容納超過100kb以上的外源片段。當(dāng)前第12頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)基因組DNA文庫的構(gòu)建流程

基因組DNA文庫的構(gòu)建程序包含5個(gè)部分：①載體的制備；②高純度大分子量基因組DNA（HighMolecularWeightDNA,HMWDNA）的提取；③HMWDNA的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離（PFGEsizeselection）；④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；⑤重組克隆的挑取和保存。當(dāng)前第13頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第14頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)1、基因組DNA文庫的載體制備載體的好壞是影響連接成功與否的關(guān)鍵，載體的制備要求兩點(diǎn)，一是純度高；二是去磷酸化好。

2、高質(zhì)量大分子量基因組DNA的提取和部分酶切

構(gòu)建不同大小插入片段的基因組文庫對(duì)DNA質(zhì)量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少應(yīng)該是文庫最終平均插入片段長度的3～5倍。實(shí)踐表明，提取的基因組DNA分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。當(dāng)前第15頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)培養(yǎng)的單細(xì)胞

組織

血液 收集單細(xì)胞

破碎

濃縮白細(xì)胞

清洗懸浮細(xì)胞⑴ 調(diào)整細(xì)胞濃度至確定值⑵低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠固定成塊狀或粒狀⑷蛋白酶K或脂酶在EDTA環(huán)境下消化蛋白質(zhì)和脂質(zhì)⑸清洗樣品，保存在EDTA溶液 存在細(xì)胞壁時(shí)需降解處理⑶ 當(dāng)前第16頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)3、文庫的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染

一般在構(gòu)建大片段基因組DNA文庫時(shí)，大量連接前都要先使用小體系連接來尋找最適的比例。在電轉(zhuǎn)化和包裝侵染過程中，首先最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的進(jìn)口感受態(tài)細(xì)胞或效價(jià)高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白，同時(shí)，研究表明對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽處理也可以明顯地提高其效率。4、文庫的質(zhì)量檢測(cè)

文庫的質(zhì)量是由文庫所含克隆的數(shù)目、平均插入片段的長度、插入效率、基因組覆蓋度和覆蓋倍數(shù)等因素所決定的。在文庫的質(zhì)量檢測(cè)中，除了克隆子數(shù)目是可以確定的，其它值都是估算的。當(dāng)前第17頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)基因組覆蓋倍數(shù)的計(jì)算方法一般包括兩種：一是公式計(jì)算法，基因組覆蓋倍數(shù)＝平均插入片段長度×克隆數(shù)/基因組DNA的長度（一般是約數(shù)）；另一種算法是結(jié)合基因組覆蓋度的檢測(cè)來進(jìn)行的?；蚪M覆蓋度是指文庫中的克隆覆蓋基因組的范圍，檢測(cè)時(shí)是通過選擇一定數(shù)目的已知的單拷貝的基因作探針來篩選文庫。由于所使用的每個(gè)探針篩選的克隆數(shù)目即表明文庫中對(duì)該基因位點(diǎn)的覆蓋倍數(shù)，因此，基因組覆蓋倍數(shù)又等于所有探針篩選到的陽性克隆的總個(gè)數(shù)/使用的總探針數(shù)的比值。當(dāng)前第18頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)基因組DNA文庫克隆子的保存1、影印濾膜保存法當(dāng)前第19頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)2、文庫在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存方法：從瓊脂平板上挑取已長出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細(xì)菌生長數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-70oC儲(chǔ)存（加終濃度為25%的甘油）。缺點(diǎn)：因文庫菌落生長的不均勻性而導(dǎo)致文庫中某些特定的序列過多或過少。3、保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個(gè)克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大當(dāng)前第20頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)現(xiàn)在一般用文庫陣列法（libraryarraying）保存大片段DNA文庫，即利用聚乙烯材料制作的384孔（16×24）或96孔（8×12）無菌培養(yǎng)板來保存文庫克隆。用手工或機(jī)器人將重組克隆挑至含抗凍液和抗生素的液體培養(yǎng)基的384孔或96孔板過夜培養(yǎng)。待培養(yǎng)液渾濁后，用384針或96針復(fù)制器制備多個(gè)拷貝，按編號(hào)保存于-80℃超低溫冰箱。由于文庫反復(fù)凍融會(huì)影響細(xì)菌的活性，一般文庫的原始拷貝留在超低溫冰箱內(nèi)不讓其發(fā)生凍融，只取一個(gè)拷貝用于后續(xù)的操作，該拷貝使用一段時(shí)間以后淘汰，重新以上一拷貝為模板制作新的拷貝使用，這樣可將文庫保存很長時(shí)間，可供長期反復(fù)使用。對(duì)大腸桿菌而言，使用添加抗凍液的培養(yǎng)基可延長文庫使用時(shí)間。當(dāng)前第21頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第22頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)第二節(jié)

cDNA文庫的構(gòu)建cDNA(complementaryDNA，互補(bǔ)DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補(bǔ)DNA。定義：是指將某種生物體基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與克隆載體重組，儲(chǔ)存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNA文庫。當(dāng)前第23頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)特征和應(yīng)用：從cDNA文庫分離基因比從基因組文庫中分離基因更具優(yōu)勢(shì)。cDNA文庫具有時(shí)空特異性，cDNA文庫反映了特定組織（或器官）在某種特定環(huán)境條件下基因的表達(dá)譜。cDNA文庫可用于大規(guī)?；驕y(cè)序、發(fā)現(xiàn)和尋找新基因、基因注釋、基因表達(dá)譜分析和基因功能研究等方面。當(dāng)前第24頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)cDNA文庫的構(gòu)建共分四步：①細(xì)胞總RNA的提取和mRNA分離；②第一鏈cDNA合成；③第二鏈cDNA合成；④雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)粒或噬菌體載體并導(dǎo)入宿主中繁殖。當(dāng)前第25頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第26頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)RNA的分離cDNA文庫構(gòu)建是以mRNA為起始材料的，mRNA在總RNA中所占比例很小，因此從總RNA中富集mRNA是構(gòu)建cDNA文庫和其它應(yīng)用所必需進(jìn)行的步驟。通過降低rRNA和tRNA含量，可大大提高篩選到目標(biāo)基因的可能性。目前純化mRNA的方法都是在固體支持物表面共價(jià)結(jié)合固定一段由脫氧胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]鏈，由它與mRNA的Poly（A）尾巴雜交，從而吸附固定住mRNA，進(jìn)而將mRNA從其它組分中分離出來的。當(dāng)前第27頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)1、mRNA的來源:選用mRNA含量高的組織材料，或通過藥物等方法提高mRNA的含量。2、mRNA完整性的檢測(cè)1)mRNA分子的大?。翰溉閯?dòng)物mRNA長度為500-8000bp，大部分mRNAkb之間.2)總mRNA指導(dǎo)合成cDNA第一鏈長分子的能力。3)指導(dǎo)合成高分子量蛋白質(zhì)的能力，指導(dǎo)合成目的多肽的能力。當(dāng)前第28頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)3、mRNA在細(xì)胞中的豐度1)高豐度mRNA目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA量的50-90%,如珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，每個(gè)細(xì)胞大約5000拷貝，該類mRNA在合成和克隆cDNA之前不需進(jìn)一步純化特定mRNA；2)中等豐度mRNA目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA量的10%左右，每個(gè)細(xì)胞大約200-300拷貝；2)低豐度mRNA目的mRNA在細(xì)胞中的含量占細(xì)胞質(zhì)總mRNA量的0.5%以下，每個(gè)細(xì)胞大約1-15拷貝。當(dāng)前第29頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)4、mRNA的富集方法典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞含有10,000-30,000種不同的mRNA分子,某些mRNA分子在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)很低甚至只有一個(gè)拷貝。當(dāng)前第30頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)1)按大小對(duì)mRNA進(jìn)行分級(jí)分離通過瓊脂糖凝膠電泳分離大小不同的mRNA分子，該方法的分離效果最好，但從凝膠中回收的得率較低.蔗糖梯度離心：加入破壞RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變性劑如氫氧化甲基汞等，再進(jìn)行蔗糖梯度離心以分離不同分子量的mRNA.2)cDNA的分級(jí)分離mRNA通過反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，在插入到克隆載體前，通過瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的cDNA分子分離開來。優(yōu)點(diǎn)：a）避免了分離過程中mRNA被污染的RNA酶降解b）增加了獲得全長cDNA克隆的概率c）獲得更準(zhǔn)確的分級(jí)分離效果（分子量）當(dāng)前第31頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)3）多聚核糖體免疫學(xué)純化法使用抗體來純化合成目的多肽的多聚核糖體。將正在合成的新生多肽鏈的多聚核糖體結(jié)合到免疫親和柱（A蛋白-Sepharose柱）上，隨后用EDTA將多聚核糖體解離下來，并通過Oligo(dT)層析分離mRNA,利用該方法可將目的mRNA純化數(shù)千倍。目的mRNA在細(xì)胞中的含量可為數(shù)十拷貝。當(dāng)前第32頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第33頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)第一鏈cDNA的合成oligo(dT)引導(dǎo)的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈。缺陷：cDNA末端存在較長的poly（A）而影響cDNA測(cè)序；因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄酶無法到達(dá)mRNA分子的5’－末端。對(duì)于大分子量的較長的mRNA分子而言，特別麻煩。當(dāng)前第34頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)mRNA當(dāng)前第35頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis)：

根據(jù)許多可能的序列，合成出6-10個(gè)核苷酸長的寡核苷酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的引物。在應(yīng)用這種混合引物的情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生，而不僅僅從3’-末端的oligo(dT)引物一處開始。

隨機(jī)引物cDNA合成的方法不適合構(gòu)建cDNA文庫，一般用于克隆特定mRNA的5'末端，如RT-PCR和5'-RACE。當(dāng)前第36頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)第二鏈cDNA的合成cDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA-cDNA雜合雙鏈變成互補(bǔ)雙鏈cDNA的過程。cDNA第二鏈的合成的方法主要4種：自身引導(dǎo)合成法、置換合成法、引導(dǎo)合成法、引物－銜接頭合成法。當(dāng)前第37頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)1）自身引導(dǎo)合成法：獲得的單鏈cDNA3’端具有形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能力，以此作為第二鏈合成的引物，在大腸桿菌聚合酶IKlenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。再利用S1核酸酶將連接處（僅該位點(diǎn)處為單鏈結(jié)構(gòu)）切斷形成平端結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行連接。缺點(diǎn)：在以S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致對(duì)應(yīng)于mRNA5’端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排。S1核酸酶的純度不夠時(shí)，會(huì)偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。當(dāng)前第38頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第39頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)2）置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失原理：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA：mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二鏈。當(dāng)前第40頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化

c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA當(dāng)前第41頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)3）引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列首先是制備帶有Poly（dT）的載體片段Ⅰ和一端帶有Poly（dG）的片段Ⅱ，并用片段Ⅰ來代替Oligo（dT）進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，在第一鏈cDNA合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，同時(shí)進(jìn)行酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，與片段Ⅱ一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜合雙鏈在RNA酶H、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA連接酶的作用下合成與載體聯(lián)系在一起的雙鏈cDNA。主要特點(diǎn)：合成全長cDNA的比例較高，但操作比較復(fù)雜，形成的cDNA克隆中都帶有一段Poly（dC）/（dA），對(duì)重組子的復(fù)制和測(cè)序都不利。當(dāng)前第42頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第43頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)4）引物-銜接頭法：引導(dǎo)合成法改進(jìn)而來第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，然后用一段帶接頭序列的Poly（dG）短核苷酸鏈作引物合成互補(bǔ)的cDNA鏈，接頭序列可以是適用于PCR擴(kuò)增的特異序列或用于方便克隆的酶切位點(diǎn)的序列。這一方法目前已經(jīng)發(fā)展成PCR法構(gòu)建cDNA文庫的常用方法。

當(dāng)前第44頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第45頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖cDNA末端的處理由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為了避免用平末端與載體連接，對(duì)雙鏈cDNA的末端進(jìn)行加工是十分必要的方法：添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆的黏性末端末端轉(zhuǎn)移酶—可以向cDNA末端加上與克隆載體末端互補(bǔ)的尾部當(dāng)前第46頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第47頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)雙鏈cDNA的克?。?/p>

雙鏈平頭的cDNA通常可以使用下列三種方法克隆入載體中：1>平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收2>平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段3>加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收當(dāng)前第48頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第49頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第50頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)cDNA文庫構(gòu)建的其它類型1、均一化cDNA文庫它是指某一特定組織或細(xì)胞的所有表達(dá)基因均包含其中，且在cDNA文庫中表達(dá)基因?qū)?yīng)的cDNA的拷貝數(shù)相等或接近。均一化cDNA文庫是克服基因轉(zhuǎn)錄水平上巨大差異給文庫篩選和分析帶來障礙的有效措施，有利于研究基因的表達(dá)和序列分析。當(dāng)前第51頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)現(xiàn)在，在構(gòu)建均一化的cDNA文庫中至少有2種主要的觀點(diǎn)：一種是基于基因組DNA在拷貝數(shù)上具有相對(duì)均一化的性質(zhì)，通過cDNA與基因組DNA飽和雜交而降低在文庫中高拷貝存在的cDNA的豐度；（基因組DNA飽和雜交法

）另一種是基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)的原理，高豐度的cDNA在退火條件下復(fù)性的速度快，而低豐度的cDNA復(fù)性要很長時(shí)間，從而可以通過控制復(fù)性時(shí)間來降低豐度。（基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理的均一化方法）當(dāng)前第52頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)基因組DNA飽和雜交法

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，沒有儀器上的限制。缺點(diǎn)：1、很難獲得覆蓋基因組的單鏈DNA片段，導(dǎo)致文庫內(nèi)基因的丟失，構(gòu)建兩個(gè)獨(dú)立、互補(bǔ)的均一化文庫可以一定程度地彌補(bǔ)這一不足；2、文庫自身雜交的速度很快，導(dǎo)致基因丟失，但可將cDNA文庫制備成單鏈后再與固定的基因組DNA雜交來克服。當(dāng)前第53頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)基于復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理的均一化方法優(yōu)點(diǎn)：1、幾乎不會(huì)導(dǎo)致起始文庫中cDNA的丟失；2、均一化效果更為明顯。缺點(diǎn)：控制參數(shù)較多，難以把握，需要多次嘗試與摸索。當(dāng)前第54頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)均一化cDNA文庫具有以下4方面的優(yōu)點(diǎn)：第一，在經(jīng)濟(jì)上具有廣泛的應(yīng)用空間，可以節(jié)約大量試驗(yàn)成本。第二，增加克隆低豐度mRNA的機(jī)會(huì)，適用于分析各種發(fā)育階段或各種組織的基因表達(dá)及突變檢測(cè)。第三，與原始豐度的mRNA拷貝數(shù)相對(duì)應(yīng)的cDNA探針與均一化的cDNA文庫作雜交，可以估計(jì)出大多數(shù)基因的表達(dá)水平及發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。而以往的文庫構(gòu)建，忽略了mRNA豐度的影響。第四，可以用于遺傳圖譜的制作和進(jìn)行大規(guī)模的原位雜交，作為優(yōu)化的文庫系統(tǒng)還可以用于大規(guī)模的測(cè)序或芯片制作等研究。當(dāng)前第55頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)2、差減cDNA文庫(SubtractivecDNAlibrary)差減文庫也稱扣除文庫，扣除雜交法的本質(zhì)是除去那些普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分離的敏感性?？鄢s交技術(shù)（subtractivehybridization）是將含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為待測(cè)樣本（tester），將基因表達(dá)譜相似或相近但不含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為對(duì)照樣本（driver），將tester和driver的cDNA進(jìn)行多次雜交，去掉在二者之間都表達(dá)的基因，而保留兩者之間差異表達(dá)的基因，使低豐度基因在文庫中的比例大大提高，篩選到差異表達(dá)的基因的可能性也大大提高。方法：抑制性扣除雜交、mRNA-cDNA雜交當(dāng)前第56頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)抑制性扣除雜交基本原理：SSH技術(shù)利用抑制性PCR能選擇性擴(kuò)增不同豐度差異基因和cDNA消減雜交特點(diǎn),運(yùn)用雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理（即高豐度序列退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度大于低豐度序列）,使原本不同豐度的DNA序列相對(duì)含量趨于一致。然后利用抑制性PCR特點(diǎn),兩端接上同一接頭的非目的基因片段由于具有反向重復(fù)序列,在退火時(shí)容易形成發(fā)夾互補(bǔ)結(jié)構(gòu),在PCR中不能作為模板與引物配對(duì)擴(kuò)增,從而選擇性擴(kuò)增目的基因而抑制非目的基因片段擴(kuò)增。消減雜交扣除了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間同源序列,再結(jié)合抑制性PCR的動(dòng)力學(xué)富集,實(shí)現(xiàn)高效分離低豐度特異性非同源片段。當(dāng)前第57頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第58頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)mRNA-cDNA雜交方法原理：用過量的驅(qū)動(dòng)mRNA與供體的cDNA文庫質(zhì)粒反復(fù)多輪雜交，去除驅(qū)動(dòng)和供體共同表達(dá)的基因，構(gòu)建均一化的、扣除雜交cDNA文庫。當(dāng)前第59頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)3、全長cDNA文庫構(gòu)建全長cDNA文庫，不僅要考慮如何確保第二鏈的完整合成，還要考慮如何避開反轉(zhuǎn)錄酶或mRNA本身的影響。理論上講，如果有一種方法能夠在合成cDNA之后，對(duì)全長cDNA進(jìn)行選擇，就可大幅度提高全長cDNA克隆的比例。3個(gè)代表性的例子：SMART全長cDNA文庫、Cap-Trapper法、煙草酸焦磷酸酶法當(dāng)前第60頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)SMART全長cDNA文庫的構(gòu)建方法：在第一鏈cDNA合成時(shí)，由于反轉(zhuǎn)錄酶帶有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，當(dāng)其到達(dá)mRNA5′端時(shí)會(huì)自動(dòng)在第一鏈cDNA的3′末端加上幾個(gè)d（C）。加入帶有3個(gè)d（G）的特異性引物，該引物會(huì)與全長cDNA第一鏈互補(bǔ)結(jié)合，，然后繼續(xù)以該引物為模板合成互補(bǔ)鏈。當(dāng)前第61頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)Cap-Trapper法構(gòu)建全長cDNA文庫：首先利用3′帶錨定堿基的oligo（dT）12引物引導(dǎo)合成第一鏈cDNA。合成第一鏈cDNA時(shí)用dm5CTP代替dCTP，使所有的胞嘧啶都被5-甲基-dCTP取代，以保護(hù)cDNA不被隨后的限制性內(nèi)切酶消化。其次在mRNA的5′和3′末端標(biāo)記上生物素，并用RNaseⅠ消化單鏈RNA。然后利用偶聯(lián)了生物素抗體的磁珠分離出生長的cDNA-mRNA雜合雙鏈，水解mRNA鏈后再利用加尾法在第一鏈cDNA末端加上oligo（dG），并合成第二鏈cDNA。最后用合適的限制性內(nèi)切酶消化雙鏈cDNA，與載體連接，包裝后感染大腸桿菌即可獲得全長的cDNA文庫當(dāng)前第62頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第63頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)煙草酸焦磷酸酶法構(gòu)建全長cDNA文庫:煙草酸焦磷酸酶（tobaccoacidpyrophosphatase,TAP）法能特異地識(shí)別真核生物mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)并將其去除，暴露出切口5′端的磷酸基團(tuán)，可以在該切口處連接一段特異的接頭來引導(dǎo)cDNA第二鏈的合成。當(dāng)前第64頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第65頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較當(dāng)前第66頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)第三節(jié)基因克隆的篩選策略表型篩選法雜交篩選和PCR篩選免疫篩選酵母雙雜交系統(tǒng)篩選當(dāng)前第67頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)表型篩選法表型篩選法是根據(jù)目的基因編碼比較特殊的功能，并且其與載體作用可以在宿主菌（如大腸桿菌）中表達(dá)該基因，表現(xiàn)出其特殊的功能所決定的表型性狀來，這樣就很容易通過導(dǎo)入的基因帶來新的功能或恢復(fù)其缺失的功能來確定目的基因。表型特征一般要求是直接的形態(tài)學(xué)特征或比較容易檢測(cè)的生化酶學(xué)的特征，比如營養(yǎng)缺陷型相關(guān)的基因和抗性基因（類似抗逆性基因）等。對(duì)于表型篩選法來說，其對(duì)所使用的宿主有相應(yīng)的要求，宿主為不攜帶該種基因或是該基因的缺失突變體。當(dāng)前第68頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)(1)抗藥性篩選:這是利用載體DNA分子上的抗藥性選擇標(biāo)記進(jìn)行的篩選方法。當(dāng)前第69頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)(2)插入失活篩選法經(jīng)過上述抗藥性篩選獲得的大量轉(zhuǎn)化子中既包括需要的重組子，也含有不需要的非重組子。為了進(jìn)一步篩選出重組子，可利用質(zhì)粒載體的雙抗藥性進(jìn)行再次篩選。當(dāng)前第70頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)(3)顯色反應(yīng)選擇法(α-互補(bǔ)法)將含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和氨基端（N端）146個(gè)氨基酸編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至可編碼β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主細(xì)胞中，可使各自無活性的片段實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，融為一體，產(chǎn)生具有酶學(xué)活性的蛋白，從而使轉(zhuǎn)化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷)的培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落，這種現(xiàn)象就稱為α-互補(bǔ)。當(dāng)前第71頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第72頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)雜交篩選和PCR篩選當(dāng)目標(biāo)基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表達(dá)的真核生物的基因，可以利用的可能只是該基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，此時(shí)就必須考慮其它的方法來篩選。雜交篩選法是應(yīng)用最為廣泛的篩選目標(biāo)基因克隆的一種方法。用已知序列的基因的篩選保存于384孔培養(yǎng)板的大片段DNA文庫時(shí)，還可以采用更加簡(jiǎn)單快捷的方法——混合池PCR篩選法。當(dāng)前第73頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)列混合池行混合池123456789101112131415161718192021222324ABCDEFGHIJKLMNOP當(dāng)前第74頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)免疫篩選免疫篩選法和核酸雜交的方法類似，只是其使用的探針不是核酸，而是特異性的抗體。適合免疫雜交法篩選的外源基因首先要在宿主細(xì)胞中存在抗原蛋白的表達(dá)，用于篩選的DNA文庫必須是表達(dá)文庫，通常是原核生物的基因組DNA文庫和真核生物的cDNA表達(dá)文庫。而且，所檢測(cè)的對(duì)象為宿主中不編碼的基因或宿主中缺失表達(dá)的基因。根據(jù)檢測(cè)方法的不同，可以分為原位檢測(cè)和免疫沉淀檢測(cè)當(dāng)前第75頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)濾膜（固定抗原）+當(dāng)前第76頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)免疫沉淀檢測(cè)法菌落沉淀素當(dāng)前第77頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。用來篩選與已知基因的產(chǎn)物發(fā)生相互作用的蛋白的編碼基因。典型的真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子，如GAL4、GCN4等都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain)。前者可識(shí)別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前第78頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第79頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。單獨(dú)的DB能和啟動(dòng)子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。如酵母細(xì)胞的Gal4蛋白的DB與大腸桿菌的一個(gè)酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點(diǎn)并激活轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前第80頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)雙雜交系統(tǒng)的另一個(gè)重要的元件是報(bào)道株。報(bào)道株指經(jīng)改造的、含報(bào)道基因(reportergene)的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。最常用的是酵母細(xì)胞。酵母細(xì)胞作為報(bào)道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn):〈1〉易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒?！?〉具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)道基因?！?〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動(dòng)物的蛋白結(jié)合。當(dāng)前第81頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)原理：在以上研究的基礎(chǔ)上，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Baitprotein。將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達(dá)載體上。同時(shí)將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因HIS、ADE、LACZ等，從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。當(dāng)前第82頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第83頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)⑴作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后，在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。⑵檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。⑶檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。⑷酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。當(dāng)前第84頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)酵母雙雜交系統(tǒng)局限性和存在的問題⑴雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進(jìn)行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助，這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究；⑵酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)重要的問題是"假陽性"。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達(dá)時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。另外某些蛋白表面含有對(duì)多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域，能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而引起報(bào)告基因的表達(dá)，產(chǎn)生"假陽性"結(jié)果。當(dāng)前第85頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)克隆基因的驗(yàn)證和分析

酶切指紋圖譜主要用于鑒定一些已知酶切位點(diǎn)基因的目的克隆，由于酶切的指紋圖譜已知，當(dāng)采用某種酶來消化待鑒定的克隆時(shí)，真陽性克隆會(huì)在電泳之后出現(xiàn)預(yù)期的指紋圖譜。Southern雜交可真實(shí)的判斷重組子中含有與探針DNA雜交的片段。二次雜交法主要用于核酸雜交法或PCR方法篩選的陽性克隆的重新鑒定，一般是提取待鑒定克隆的重組質(zhì)?；蚴删wDNA，用一種或兩種酶消化后電泳并轉(zhuǎn)膜，然后用起始探針重新雜交，結(jié)合陽性片段的大小來進(jìn)一步確定陽性克隆。DNA序列分析法是根據(jù)陽性克隆的序列與已有信息進(jìn)行比較，判斷篩選到的克隆真假，是一種最準(zhǔn)確可靠的鑒定方法。當(dāng)前第86頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)重組DNA導(dǎo)入宿主的方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)染感染當(dāng)前第87頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)轉(zhuǎn)化1928，Grffith在觀察肺炎鏈球菌（Diplococcuspneumoniae）有毒株和無毒株在活體內(nèi)的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)：把加熱殺死的S型菌株和活的R型菌株混合培養(yǎng)時(shí)，能從中分離出活的S型菌，并能繼續(xù)傳代。定義：來自一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞（供體）的DNA（片段）被另一個(gè)細(xì)胞（受體）所吸收（隨后同受體染色體一起進(jìn)行重組）的過程。

當(dāng)前第88頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)對(duì)DNA的吸收，僅在受體生長周期中的一個(gè)短暫階段。能夠吸收DNA的細(xì)胞，稱作感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）。在轉(zhuǎn)化中有功能的DNA是ds或ssDNA，線狀或環(huán)狀。當(dāng)前第89頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)（一）CaCl2

轉(zhuǎn)化法

核心：目標(biāo)細(xì)胞在CaCl2·H2O溶液中浸泡一段時(shí)間，轉(zhuǎn)化效率107-109

cell/μgDNA。

E.coli:DH5α,TG1,XL-1Blue,JM105

（1）冰上30min

（2）熱激42℃90"

（3）恢復(fù)1～2min

（4）復(fù)蘇37℃45-60min

當(dāng)前第90頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)（二）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法protoplast

適用于G+

細(xì)菌，特別是芽孢桿菌、酵母。

過程：

（1）等滲環(huán)境下，脫細(xì)胞壁（溶菌酶、溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶、果膠酶）

（2）細(xì)胞壁再生（三）電轉(zhuǎn)化法（electroporation）

緩沖液：10%甘油或蔗糖，含（或不含）Mg2+離子。

轉(zhuǎn)化條件：2.5KV/0.2cm當(dāng)前第91頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)當(dāng)前第92頁\共有108頁\編于星期五\23點(diǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）定義：由噬菌體將外源基因由一個(gè)細(xì)菌（供體）轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌（受體）的過程。1、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）：供體的單個(gè)或緊密連鎖的少數(shù)幾個(gè)基因被噬菌體因錯(cuò)誤裝配