第三章植物基因工程載體及其構(gòu)建

第一節(jié)載體概述1.載體概念載體(vector)：能夠承載外源基因，并將其轉(zhuǎn)入受體細胞進行擴增和表達的DNA分子。運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞；為外源基因提供復(fù)制能力和整合能力；為外源基因的擴增或表達提供必要的條件；功能所以，目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細胞，并在其中維持高效表達，很大程度上取決于載體。當前第1頁\共有93頁\編于星期五\21點具備復(fù)制原點，在宿主細胞內(nèi)能夠自主復(fù)制；具備合適的酶切位點，供外源片段插入；含有供選擇轉(zhuǎn)化子的標記基因；適當?shù)目截悢?shù)：較高的拷貝數(shù)，便于回收、制備；載體的安全性：對受體細胞無毒害，不能隨便轉(zhuǎn)移；載體大?。涸瓌t上要求載體越小越好；如果需要外源基因的表達：啟動子。載體應(yīng)具備的條件當前第2頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第3頁\共有93頁\編于星期五\21點2.載體的種類按來源分：細菌質(zhì)粒載體病毒載體噬菌體載體轉(zhuǎn)座子載體Ti質(zhì)粒Ri質(zhì)粒人工染色體載體、線粒體載體、葉綠體載體等當前第4頁\共有93頁\編于星期五\21點按功能分：克隆載體：主要用來克隆和擴增DNA片段，能帶動外源基因在宿主細胞中復(fù)制擴增。表達載體：除具有克隆載體的基本元件外，還具有轉(zhuǎn)錄、翻譯所必需的DNA元件，使外源基因在宿主細胞中有效表達。整合載體：將目的基因插入到受體染色體中。當前第5頁\共有93頁\編于星期五\21點目的基因克隆載體中間載體卸甲載體轉(zhuǎn)化載體其功能是保存和克隆目的基因。與微生物基因工程相似，通常是由多拷貝的E.Coli小質(zhì)粒為載體。切除致瘤基因的Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒，是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的受體質(zhì)粒。中間克隆載體中間表達載體大腸桿菌質(zhì)粒插入T-DNA片段及目的基因、標記基因等。是構(gòu)建中間表達載體的基礎(chǔ)質(zhì)粒。含有植物特異啟動子的中間載體。作為構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒。最后用于目的基因?qū)胫参锛毎妮d體，工程載體。由中間表達載體和卸甲載體構(gòu)建。當前第6頁\共有93頁\編于星期五\21點第二節(jié)質(zhì)粒載體質(zhì)粒(plasmid)：存在于細菌或真菌染色體外的小型環(huán)狀(線型質(zhì)粒DNA分子——線蟲、衣藻等)雙鏈DNA分子(酵母的“殺傷質(zhì)粒”是RNA)，可自身復(fù)制和表達。不是寄主生長所必需的，但可以賦予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力（帶有抗性基因等）。分子量在1-200kb之間。1、質(zhì)粒（plasmid）概念當前第7頁\共有93頁\編于星期五\21點質(zhì)?？臻g構(gòu)型超螺旋：共價閉合環(huán)狀DNA開環(huán)DNA：1條鏈上有一至數(shù)個缺口線型DNA：最快的是超螺旋，其次是線性DNA，最慢的是開環(huán)DNA。2、質(zhì)粒（plasmid）構(gòu)象當前第8頁\共有93頁\編于星期五\21點3、質(zhì)粒的自主復(fù)制性①嚴緊型質(zhì)粒（stringentplasmid）拷貝數(shù)少，只有1—3份拷貝。②松弛型質(zhì)粒（relaxedplasmid）拷貝數(shù)多，有幾十—幾百份拷貝。

質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進行自主復(fù)制質(zhì)粒。DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：當前第9頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第10頁\共有93頁\編于星期五\21點4、質(zhì)粒的不相容性同種的或親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒，含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，不能同時穩(wěn)定地保持在一個細胞內(nèi)的現(xiàn)象，稱為質(zhì)粒不相容性。不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群。在第二個質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及DNA限制系統(tǒng)時，不相容的質(zhì)粒一般為利用同一復(fù)制系統(tǒng)，質(zhì)粒分配到子細胞時會發(fā)生競爭，隨機挑選，最終放大。當前第11頁\共有93頁\編于星期五\21點5、質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性接合型質(zhì)粒：能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞（接合作用）。甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到受體菌種。非接合型質(zhì)粒：不能再天然條件下獨立地發(fā)生接合作用。某些非接合型質(zhì)粒在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移。由mob、tra基因順式因子bom及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點nic決定。當前第12頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第13頁\共有93頁\編于星期五\21點6、攜帶特殊的遺傳標記物質(zhì)抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質(zhì)合成：抗生素、細菌毒素、有機堿對重組DNA分子的篩選十分重要！選擇標記：用于轉(zhuǎn)化子的挑選；篩選標記：用于重組子的挑選；轉(zhuǎn)化子：成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主細胞；重組子：真正含有重組DNA的轉(zhuǎn)化子。按用途可分為選擇標記基因和篩選標記基因。當前第14頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第15頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第16頁\共有93頁\編于星期五\21點篩選標記基因插入失活法當前第17頁\共有93頁\編于星期五\21點互補篩選法lacZ編碼β-半乳糖苷酶，乳糖及其衍生物可誘導(dǎo)其表達(乳糖既是誘導(dǎo)物,也是底物)；IPTG：乳糖衍生物，可作為lac操縱子的誘導(dǎo)物，但不能

作為反應(yīng)底物；X-gal：可作lac操縱子的底物，不能作為誘導(dǎo)物。還可

作為生色劑，被β-半乳糖苷酶分解后產(chǎn)生蘭色物質(zhì)，使

菌落呈現(xiàn)蘭色。當前第18頁\共有93頁\編于星期五\21點lacZΔM15放在F質(zhì)粒上，隨宿主傳代；lacZ’

放在載體上，作為篩選標記；受體菌有JM系列、TG1和XL1-Blue等。lacZ

ΔM15：缺失β-半乳糖苷酶第11-41個aa；lacZ’

：只編碼N端140個aa；lacZ

ΔM15+lacZ’

=功能互補在lacZ’

編碼區(qū)上游插入一小片段DNA(如51bp的MCS)，不影響β-半乳糖苷酶的功能互補。但在該小片段DNA中再插入一個片段，將導(dǎo)致產(chǎn)生無互補能力的β-半乳糖苷酶片段；當前第19頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第20頁\共有93頁\編于星期五\21點7、天然質(zhì)粒載體的局限性（1）分子量大，拷貝數(shù)低第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長9.1kb。但只有一個EcoRI切點充當克隆位點，Tetr作為篩選標志。（2）篩選標志不理想，合適的單一酶切位點少ColE1質(zhì)粒的篩選標志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點EcoRI正好位于這個基因的內(nèi)部。當前第21頁\共有93頁\編于星期五\21點改造策略：去掉多余片段：縮小質(zhì)粒分子量，提高外源DNA片段的裝載量；減少限制性酶切位點：缺失突變，限制性酶、核酸外切酶和連接酶...；提供多克隆位點易識別的選擇標記：通過質(zhì)粒之間的重組導(dǎo)入；安全性改造：質(zhì)粒載體不能在細菌間隨便轉(zhuǎn)移；增加輔助功能：表達載體。當前第22頁\共有93頁\編于星期五\21點8、常用的質(zhì)粒載體（1）pBR322質(zhì)粒載體F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構(gòu)建載體。復(fù)制起點：pMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點，高達1000-3000個拷貝；Ampr基因：pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因；Tetr基因：pSC101的Tetr基因；長度：4361bp；選擇標記：氨芐青霉素和四環(huán)素抗性；多克隆位點：24個克隆位點；其中9個會導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個會導(dǎo)致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。當前第23頁\共有93頁\編于星期五\21點衍生質(zhì)粒：pBR325、pBR327及pAT153等。當前第24頁\共有93頁\編于星期五\21點（2）pUC質(zhì)粒載體UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。復(fù)制起點：pBR322的oriAmpr基因：pBR322Ampr基因，不含原有酶切位點；lacZ啟動子：大腸桿菌；lacZ'基因：大腸桿菌lacZ的氨基酸片段；長度：約2.7kb；克隆位點：10個連續(xù)的單一酶切位點，位于lacZ'基因5’端。選擇標記：氨芐青霉素和藍白斑篩選；當前第25頁\共有93頁\編于星期五\21點pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19更小的分子量；選擇方便：正向選擇，可顯色和抗菌素雙重直接選擇；克隆便利：具有多克隆位點，外源DNA方便插入；測序方便：pUC的MCS與M13噬菌體載體的MCS完全相同，便于把外源DNA轉(zhuǎn)移到M13載體上測序。當前第26頁\共有93頁\編于星期五\21點（3）pGEM系列載體由pUC派生而來。與pUC的主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別加了一個噬菌體啟動子T7和SP6?？蓪Σ迦肫芜M行轉(zhuǎn)錄。還加入了絲狀噬菌體f1的復(fù)制起點。當前第27頁\共有93頁\編于星期五\21點（3）pBluescriptIIKS(±)系列載體在MCS的兩側(cè)分別加了一個噬菌體啟動子T7和T3?？蓪Σ迦肫芜M行轉(zhuǎn)錄。還加入了絲狀噬菌體f1的復(fù)制起點。當前第28頁\共有93頁\編于星期五\21點9、PCR產(chǎn)物克隆載體（1）T載體PCR產(chǎn)物往往在3’端突出一個或多個A，將T-載體的MCS中部已經(jīng)切開，各有一個3’端突出的T。所以能與這個載體直接連接，這種克隆稱為T-A克隆。目前，目的基因的獲得幾乎都是用PCR的方法，如何將PCR產(chǎn)物連接到載體上？克隆載體線性化；克隆載體末端補平；克隆載體末端加T。當前第29頁\共有93頁\編于星期五\21點商業(yè)化T載體一般來說，商業(yè)化的T載體多是先使用平端限制性內(nèi)切酶（如EcoRV）將克隆載體進行線性化，然后再單獨加入dTTP和Taq酶72～75℃反應(yīng)，進行末端的加T。自制T載體一種常見的自制方法是利用限制性內(nèi)切酶制造出具有單個T末端突出的片段，最常用的內(nèi)切酶為XcmI，其識別和切割特點如下：當前第30頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第31頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第32頁\共有93頁\編于星期五\21點TOPO技術(shù)拓撲異構(gòu)酶I在位點CCCTT切斷并松弛超螺旋DNA，然后重新連接末端。這樣，其同時作為限制酶和連接酶。TOPO克隆是一種將拓撲異構(gòu)酶與T-載體相結(jié)合的PCR產(chǎn)物快速克隆系統(tǒng)pCR-TOPO，無需DNA連接酶做連接。3'末端的突出T上共價結(jié)合了一個拓撲異構(gòu)酶Ⅰ，當帶3'末端的突出A的PCR產(chǎn)物與該T載體互補配對時，拓撲異構(gòu)酶Ⅰ就將該缺口連接起來。當前第33頁\共有93頁\編于星期五\21點因為越來越多高確限度熱穩(wěn)定酶如Pfx、Pfu被用于PCR擴增，使到PCR后都只是平端產(chǎn)物。這種平端克隆往往效率低，并且有非特異性背景菌落產(chǎn)生，造成篩選困難。（2）平末端PCR產(chǎn)物載體當前第34頁\共有93頁\編于星期五\21點TOPO-Blunt載體在lacZ’基因的下游融合了一個ccdB（Controlofcelldeath）基因，該基因?qū)Υ竽c桿菌是致死的。載體切成線狀，再與目標DNA連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。外源DNA片段與載體連接后，ccdB基因的表達受到阻斷，重組質(zhì)粒才能在大腸桿菌中存在下來。如果沒有DNA片斷插入，ccdB基因則會表達，造成細菌染色體的降解導(dǎo)致細菌死亡。當前第35頁\共有93頁\編于星期五\21點TOPO克隆高效性原理Topo連接反應(yīng)有兩個分子參與，而傳統(tǒng)的連接反應(yīng)有三個分子參與，其熱力學上的優(yōu)勢導(dǎo)致5分鐘的快速連接。當前第36頁\共有93頁\編于星期五\21點10、質(zhì)粒提取細菌培養(yǎng)和富集細胞懸浮細胞破碎細胞碎片基因組去除蛋白去除質(zhì)粒收集溶液1：50mM葡萄糖，25mMTris-Cl，10mMEDTA，pH8.0溶液2：0.2NNaOH，1%SDS；溶液3：3M醋酸鉀，2M醋酸苯酚、氯仿抽提異丙醇/乙醇沉淀，70%乙醇清洗當前第37頁\共有93頁\編于星期五\21點具備復(fù)制原點，在宿主細胞內(nèi)能夠自主復(fù)制；具備合適的酶切位點，供外源片段插入；含有供選擇轉(zhuǎn)化子的標記基因；適當?shù)目截悢?shù)：較高的拷貝數(shù)，便于回收、制備；載體的安全性：對受體細胞無毒害，不能隨便轉(zhuǎn)移；載體大?。涸瓌t上要求載體越小越好；如果需要外源基因的表達：啟動子。載體應(yīng)具備的條件當前第38頁\共有93頁\編于星期五\21點11、大腸桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化（1）熱激法挑選單菌落過夜振蕩培養(yǎng)取1ml菌液+50ml培養(yǎng)基2-3h，OD600=0.6取1ml菌液+50ml培養(yǎng)基2-3h，OD600=0.6低溫低速離心收集細胞0.1MCaCl2懸浮處理細胞2ml0.1MCaCl2懸浮細胞，分裝，-80℃保存。感受態(tài)細胞制備轉(zhuǎn)化取出感受態(tài)冰浴解凍加入連接產(chǎn)物/質(zhì)粒冰浴30min42℃熱激90S冰浴1min加入1mlLB培養(yǎng)基培養(yǎng)45min復(fù)蘇產(chǎn)物體系不超過1/10收集菌體，涂板篩選，過夜培養(yǎng)當前第39頁\共有93頁\編于星期五\21點（2）電擊法當細菌長到對數(shù)中期；冷卻，離心；然后用冷卻的去離子水反復(fù)清洗；最后用10%甘油重懸；超低溫保存。感受態(tài)細胞制備轉(zhuǎn)化受電場強度、電脈沖長度和DNA濃度等參數(shù)的影響。電壓和電脈沖長度增高，轉(zhuǎn)化的細胞數(shù)量也有所提高，但存活率下降。電壓：2.5kv，電阻：300歐；電容：2.5uF當前第40頁\共有93頁\編于星期五\21點12、大腸桿菌重組子篩選和檢測當前第41頁\共有93頁\編于星期五\21點思考題

BamHⅠ

XbaⅠEcoRIBamHIXbaIPCR檢測正確，片段已經(jīng)整合進載體；用BamHⅠ和XbaⅠ切不出目的片段；載體酶切位點在大腸桿菌中被甲基化；載體構(gòu)建過程中出現(xiàn)星活性；當前第42頁\共有93頁\編于星期五\21點第三節(jié)工程載體植物基因轉(zhuǎn)化載體必須具備的功能能作為媒介將外源基因?qū)氲街参锛毎?，并整合到宿主細胞的基因組DNA上；能提供被寄主細胞的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識別的DNA序列，即啟動子和復(fù)制子，以保證轉(zhuǎn)化的外源基因能在植物細胞中進行復(fù)制和表達。當前第43頁\共有93頁\編于星期五\21點一、根瘤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體1、Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子，約有200kb組成。章魚堿型(octopine)；胭脂堿型(nopaline)；農(nóng)桿堿型(agropine)；農(nóng)桿菌素堿型(agrocinoine)或稱琥珀堿型。根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中合成的冠癭堿種類的不同，Ti質(zhì)?？煞殖伤姆N類型：當前第44頁\共有93頁\編于星期五\21點Agrobacteriumtumefaciens章魚堿型(octopine)當前第45頁\共有93頁\編于星期五\21點2.Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的onc基因與腫瘤的形成有關(guān)。Vir區(qū)（virulenceregion）該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。Con區(qū)（regionsencodingconjugations）該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。Ori區(qū)（originofreplication）該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。當前第46頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第47頁\共有93頁\編于星期五\21點T-DNA區(qū)(transferredDNAregions)T-DNA：農(nóng)桿菌侵染植物時，從Ti質(zhì)粒上導(dǎo)入植物細胞的一段DNA。23kb左右，攜帶有致瘤基因和冠癭堿合成酶基因；T-DNA區(qū)的致瘤基因是一些與激素合成有關(guān)的基因。這些基因的表達，破壞了植物體內(nèi)正常的激素平衡，導(dǎo)致植物冠癭廇的出現(xiàn)；T-DNA兩端各有一高度同源的25bp的重復(fù)序列，分別稱為左邊界序列(LB)和右邊界序列(RB)，對T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞至關(guān)重要(尤其是RB)。當前第48頁\共有93頁\編于星期五\21點Vir區(qū)的基因與T-DNA從細菌轉(zhuǎn)移到植物細胞的遺傳過程有關(guān)，能夠使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性；Vir區(qū)總長約35kb，包括7個基因，VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH；VirA：組成性表達；

VirB、VirC、VirD、VirE：誘導(dǎo)性表達：

VirG：受信號分子誘導(dǎo)后表達量提高10多倍；信號分子：乙酰丁香酮等。Vir區(qū)(毒性區(qū))植物細胞創(chuàng)傷信號（AS）結(jié)合并激活VirA，VirA轉(zhuǎn)移磷酸基團激活VirG，形成二聚物，結(jié)合到Vir基因啟動子區(qū)域，激活這些基因的表達。雙因子調(diào)控體系。當前第49頁\共有93頁\編于星期五\21點毒性區(qū)對T-DNA的作用既可以順式作用進行，也可以反式作用進行。兩種情況下T-DNA都可在毒性區(qū)作用下轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中；順式作用：指T-DNA區(qū)與毒性區(qū)位于同一個Ti質(zhì)粒上；反式作用：指T-DNA與毒性區(qū)不在同一Ti質(zhì)粒上，而位于另一個相應(yīng)的中間載體質(zhì)粒上。當前第50頁\共有93頁\編于星期五\21點調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制。Con區(qū)(接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū))具有在細菌間進行接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因(tra)，調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。Ori區(qū)(originofreplication)細菌吸收和利用冠癭堿的區(qū)域，具有冠癭堿分解酶基因如章魚堿分解酶基因Occ。冠癭堿代謝區(qū)(opinecatabolism)當前第51頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第52頁\共有93頁\編于星期五\21點4、Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機理農(nóng)桿菌附著到植物細胞后，只留在細胞間隙中。（1）T-DNA的加工及轉(zhuǎn)移下鏈25bp重復(fù)序列的右邊界左起第3和第4堿基間缺口剪切，然后從缺口5’端開始合成新的DNA鏈，并一直延伸到左邊界第22堿基處，置換出原來的下鏈，形成ssDNA，即T鏈。當前第53頁\共有93頁\編于星期五\21點VirD:包含VirD1、VirD2、VirD3、VirD4。

VirD1具有拓撲異構(gòu)酶活性，將超螺旋DNA變?yōu)樗沙贒NA；VirD2具有核酸內(nèi)切酶活性，切割雙鏈DNA的一條鏈。C端有核定位信號。VirC:包含VirC1和VirC2。

為ATPase，對質(zhì)粒DNA的準確剪切是必需的。當前第54頁\共有93頁\編于星期五\21點（2）T鏈復(fù)合物的形成T鏈必須橫向跨越細菌細胞膜、細菌細胞壁、植物細胞壁、植物細胞膜及核膜，才能整合進植物基因內(nèi)。Ｔ鏈必須避免被核酸降解，因此Ｔ鏈可能以一種DNA-蛋白復(fù)合體形式存在。VirD2從T-DNA的產(chǎn)生到整合到植物基因組整個過程，都與T-DNA共價結(jié)合在一起。VirE2編碼ssDNA結(jié)合蛋白,與任何ssDNA結(jié)合。通達與Ｔ鏈非共價結(jié)合，VirE2可包被T鏈,形成細長的核-蛋白絲,因而故VirE2不僅保護ssDNA,使ssDNA抗3′和5′外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶，而且T使鏈形變成一種可轉(zhuǎn)運的形式。當前第55頁\共有93頁\編于星期五\21點（3）T鏈復(fù)合物的轉(zhuǎn)運形成跨膜孔道，需要跨膜或者膜結(jié)合蛋白的參與；VirB蛋白在膜上形成一種類似于細菌結(jié)合轉(zhuǎn)移時從工體菌轉(zhuǎn)至受體菌所必需的結(jié)構(gòu)，即接合孔或性毛，T-DNA通過這種孔由細菌進入到植物細胞。同時VirB也可能起運輸和提供能量的作用。當前第56頁\共有93頁\編于星期五\21點（4）T鏈復(fù)合體靶向植物細胞核

VirD2及VirE2上有核定位信號，但VirE2與VirD2相比，其核定位功能較弱。VirD2可能以一種極性方向，首先將T復(fù)合體定向至核孔，而virE2則作為一種促進因子，保證很長的T復(fù)合體在進入核孔時不受干擾。VirD2及VirE2蛋白上的核定位信號與動物相似，說明植物和動物的這種信號從進化上講是保守的。當前第57頁\共有93頁\編于星期五\21點（5）T鏈整合到基因組T-DNA在植物染色體中的插入是隨機的。它可插入任何一條植物染色體。但插入位點常有以下特點：T-DNA優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍的植物基因位點；T-DNA與植物DNA連接處富含A，T堿基對；植物DNA上的插入靶位點與T-DNA邊界序列有一定程度的同源性。由于這種同源性才使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地發(fā)生DNA鏈的交換。T-DNA的整合是異常重組的結(jié)果。T-DNA右未端在靶序列的識別及連接中是必需的，T-DNA左未端和兩個靶DNA未端則參與部分配對和DNA修復(fù)。當前第58頁\共有93頁\編于星期五\21點T-DNA插入的遺傳特性：T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多數(shù)插入會導(dǎo)致靶位點處小的缺失，缺失多至79個核苷酸。另一個常見的結(jié)果是，在T-DNA／植物DNA連接處，會有幾個至33個核苷酸的“填充”DNA（FillerDNA）存在，這些“填充”DNA的序列與靠近連接處的植物DNA序列相似。在植物靶位處不要求有特異的序列，但若在T-DNA兩端和植物靶位處之間有一段短序列（5～10b）同源，則可以在整合中起作用。當前第59頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第60頁\共有93頁\編于星期五\21點4、Ti質(zhì)粒的生物學功能為農(nóng)桿菌提供附著于植物細胞壁的能力；為寄主細胞合成植物激素IAA和細胞分裂素；誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導(dǎo)的腫瘤的形態(tài)學特征和冠癭堿成分；賦予寄主菌株分解代謝各種冠癭堿的能力；賦予寄主菌株對土壤桿菌素的反應(yīng)性；決定寄主菌株的植物寄主范圍；抑制某些根瘤農(nóng)桿菌噬菌體的生長和發(fā)育。當前第61頁\共有93頁\編于星期五\21點4、Ti質(zhì)粒的改造Ti質(zhì)粒分子量過大，200kb左右，難以操作；分布著各種限制酶的多個切點，難以找到可利用的單一限制性內(nèi)切酶位點；T-DNA區(qū)Onc基因的產(chǎn)物干擾宿主植物中內(nèi)源激素的平衡，誘發(fā)腫瘤，阻礙細胞的分化和植株的再生；Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制,即使得到重組質(zhì)粒，也只能在農(nóng)桿菌中進行擴增；而農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率極低（10％左右）拷貝數(shù)少；Ti質(zhì)粒上還存在一些對于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的序列。野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：當前第62頁\共有93頁\編于星期五\21點一元載體和雙元載體當前第63頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第64頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第65頁\共有93頁\編于星期五\21點酶切連接系統(tǒng)當前第66頁\共有93頁\編于星期五\21點同源重組系統(tǒng)Gateway克隆技術(shù)是利用λ噬菌體與大腸桿菌的染色體之間發(fā)生的λ嗜菌體位點特異重組系統(tǒng)的重組整合與切出反應(yīng)。創(chuàng)建Gateway克隆，通過PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將目的基因克隆進入門載體?；旌习康幕虻娜腴T克隆和合適的目的載體及Gateway?LRClonase?酶，產(chǎn)生表達克隆。（表達克隆用來在合適的宿主中進行蛋白的表達和分析。）Gateway?技術(shù)也利用了ccdB選擇方法，以確保高效率的分離重組克隆。典型的效率是＞95％。當前第67頁\共有93頁\編于星期五\21點infusion重組系統(tǒng)當前第68頁\共有93頁\編于星期五\21點5、表達載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)制備CaCl2法：與大腸桿菌基本一致區(qū)別：菌液需加入抗生素篩選；

培養(yǎng)時間更長；培養(yǎng)溫度28℃；

超低溫保存用甘油。轉(zhuǎn)化當前第69頁\共有93頁\編于星期五\21點轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后如何進行酶切鑒定？當前第70頁\共有93頁\編于星期五\21點二、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒載體發(fā)根農(nóng)桿菌與根癌農(nóng)桿菌都能侵染植物細胞，但病癥不同。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植物細胞產(chǎn)生許多不定根。能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物及裸子植物。發(fā)根農(nóng)桿菌同樣具有與Ti質(zhì)粒相似的稱之為Ri的巨大質(zhì)粒。Ri質(zhì)?？梢圆挥谩敖獬溲b”進行轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的發(fā)根能夠再生；發(fā)狀根是單細胞克隆，避免產(chǎn)生嵌合體；可直接作為中間載體；發(fā)根適于離體培養(yǎng)，離體培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物合成能力更強。根據(jù)轉(zhuǎn)化植物后產(chǎn)生的毛狀根合成冠癭堿的類型不同，分為：甘露堿型、黃瓜堿型和農(nóng)桿堿型。當前第71頁\共有93頁\編于星期五\21點從發(fā)展植物基因工程載體考慮，Ri質(zhì)粒是頗有吸引力的。這是因為在不同的雙子葉植物中，由Ri質(zhì)粒誘發(fā)產(chǎn)生的合成冠癭堿不定根組織，經(jīng)過培養(yǎng)基中的植物激素的刺激作用，都可再生成可育的完整的植株。解釋Ti質(zhì)粒載體的許多概念對于Ri質(zhì)粒載體也是適用的?，F(xiàn)在已發(fā)展出了Ri質(zhì)粒載體的共合體系當前第72頁\共有93頁\編于星期五\21點三、植物病毒載體植物病毒及其它的一些病原體，是一類能夠在感染的植物寄主細胞中進行復(fù)制和表達的“外來的”核酸類型。以植物病毒作為植物基因工程的克隆載體具有的優(yōu)點。有一部分植物病毒對寄主的感染是系統(tǒng)性的，它能夠?qū)⑵浠蚪M擴散到被感染植株的所有細胞。植物病毒載體，如雙子座病毒組病毒由于具有廣泛的寄主范圍，存在著被發(fā)展作為單子葉植物基因克隆載體的潛力。被感染的植株能夠繁殖出大量的病毒顆粒。類型：單鏈的RNA植物病毒、單鏈的DNA植物病毒和雙鏈的DNA植物病毒。當前第73頁\共有93頁\編于星期五\21點1、單鏈的RNA植物病毒90％以上的植物病毒的遺傳物質(zhì)，都是具有感染性的正鏈RNA。反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶，將單鏈的病毒RNA轉(zhuǎn)變成雙鏈的DNA；然后把這種DNA克隆到一種原核生物的質(zhì)?；蚩滤官|(zhì)粒載體上；在形成的重組質(zhì)粒分子中，外源基因是插入在dcDNA部分；將帶有外源基因的病毒載體重新導(dǎo)入植物寄主細胞。當前第74頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第75頁\共有93頁\編于星期五\21點2、單鏈植物DNA病毒載體當前第76頁\共有93頁\編于星期五\21點當前第77頁\共有93頁\編于星期五\21點3、雙鏈DNA植物病毒載體花椰菜花葉病毒組和黃瓜脈病毒組將目的基因插入到CaMVDNA上特定的非功能區(qū)域，不影響病毒基因組的侵染性。CaMV侵染植物以后復(fù)制在寄主核內(nèi)；目的基因不能整合到染色體上，但是可以穩(wěn)定表達；基因組35S啟動子可在植物細胞內(nèi)高效表達，可用于基因過表達。局限性：容納外源基因能力有限，寄主范圍也有限；感染后寄主植物易患病，產(chǎn)量品質(zhì)下降；不能感染整個植株，需通過原生質(zhì)體克服。當前第78頁\共有93頁\編于星期五\21點第四節(jié)標記基因選擇標記基因(selectablemarkergene)：編碼產(chǎn)物能使轉(zhuǎn)化的細胞、組織具有對抗生素、除草劑的抗性或代謝的優(yōu)越性，從而將轉(zhuǎn)化的細胞、組織篩選出來的一類基因；報告基因(reportergene)：編碼產(chǎn)物能夠被快速測定，用來判斷外源基因是否已成功導(dǎo)入受體細胞、組織，并檢測其表達活性的一類基因；報告基因?qū)嵸|(zhì)上起到了標記基因的作用，故當其被用來區(qū)分轉(zhuǎn)化細胞時,也可將其稱為標記基因。當前第79頁\共有93頁\編于星期五\21點1

標記基因和報告基因的構(gòu)建標記基因：與適當?shù)慕M成型啟動子構(gòu)成嵌合基因，克隆在質(zhì)粒載體上，導(dǎo)入受體細胞內(nèi)；報告基因：將其編碼區(qū)

與位于其上游或下游的

目的基因融合，置于目

的基因啟動子的控制之

下,克隆到質(zhì)粒載體上，

導(dǎo)入細胞內(nèi)。當前第80頁\共有93頁\編于星期五\21點2轉(zhuǎn)基因植物常用的標記基因編碼正常植物細胞中不存在的產(chǎn)物；基因較小，易構(gòu)成嵌合基因；能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達；容易檢測，并能定量分析。選擇標記基因應(yīng)具備的特征當前第81頁\共有93頁\編于星期五\21點常用的選擇標記基因抗生素抗性基因：npt(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶),hpt(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶),cat(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)等；除草劑抗性基因：pat(抗磷化麥黃酮),sul(抗磺胺類除草劑),epsps(抗草甘膦)；糖代謝途徑相關(guān)基因：pmi(6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶)激素代謝途徑相關(guān)基因：ipt(異戊烯基轉(zhuǎn)移酶),iaah(吲哚乙酰胺水解酶),dhfr(二氫葉酸還原酶)。當前第82頁\共有93頁\編于星期五\21點3轉(zhuǎn)基因植物常用的報告基因已被克隆，全序列已測定；表達產(chǎn)物在受體細胞中不存在，也無相似的內(nèi)源性表達產(chǎn)物，且對受體細胞無毒；表達產(chǎn)物能進行定量測定。報告基因應(yīng)具備的特征β-葡萄糖酸苷酶基因(gus),螢光素酶基因(luc),綠色熒光蛋白基因(gfp)等。常用的報告基因當前第83頁\共有93頁\編于星期五\21點Gus基因的檢測Gus：來源于細菌，催化β–葡萄糖苷酯類物質(zhì)的水解。絕大多數(shù)植物細胞不存在內(nèi)源的GUS活性，因而被廣泛用作轉(zhuǎn)基因植物的報告基因；常用底物有3