第十一章固相膜免疫分析技術(shù)

第十一章固相膜免疫分析技術(shù)第一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一【目的要求】1、掌握：免疫金標(biāo)記技術(shù)、膠體金、免疫金的概念，金免疫測定技術(shù)的類型、原理和臨床應(yīng)用；2、了解：斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)。第二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一概述固相膜免疫分析技術(shù)以微孔膜作為固相載體，利用液體可以流過微孔膜也可以通過毛細(xì)血管作用在膜上向前移行的特性，以酶標(biāo)記或各種有色微粒子標(biāo)記抗體或抗原作為標(biāo)記物，通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行抗原或抗體檢測的快速檢驗(yàn)方法。第三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一固相膜免疫分析技術(shù)其他膜載體免疫分析技術(shù)膠體金免疫技術(shù)斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)免疫印跡試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)第四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)膠體金免疫技術(shù)膠體金免疫技術(shù)：是一種以膠體金作為標(biāo)記物的免疫標(biāo)記技術(shù)。第五頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一一、膠體金與免疫金的制備（一）、膠體金的特性1、膠體特征膠體金也稱金溶膠，是由金鹽被還原成原子金(Au)后形成的金顆粒懸液。第六頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一膠體金顆粒大小多在1~100nm，微小金顆粒穩(wěn)定、均勻、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液。第七頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一2、呈色性和光吸收性第八頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一3、穩(wěn)定性對(duì)電解質(zhì)較敏感，電解質(zhì)可破壞膠體金外周水化層，而使其聚體沉淀下來。第九頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一（二）膠體金的制備

向一定濃度的金溶液中加入一定量的還原劑使金離子還原成為金原子，形成金顆粒懸液。常用的還原劑有：枸櫞酸鈉、白磷、乙醇、過氧化氫、硼氫化鈉、抗壞血酸、鞣酸等。第十頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一以枸櫞酸鈉為例說明制備方法：1、制備一定濃度的HAuCl4水溶液，加熱至沸。2、攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入一定量的枸櫞酸三鈉水溶液。3、繼續(xù)加熱煮沸一定時(shí)間。觀察溶液變化：淡黃色灰色黑色紅色。4、冷卻至室溫后加蒸餾水恢復(fù)至原體積。第十一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一膠體金的鑒定主要鑒定指標(biāo)有：顆粒大小、粒徑的均一呈度、有無凝集顆粒。良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的，如混濁或液體表面有漂浮物，提示制備的膠體金有較多的凝集顆粒。第十二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一第十三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一膠體金的保存：膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長時(shí)間保存。第十四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一制備膠體金的注意事項(xiàng)：(1)氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。(2)氯金酸對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此，在配制及保存時(shí)不能用金屬器皿。(3)制備膠體金的水應(yīng)是雙蒸餾水或三雙蒸餾水。(4)用于制備膠體金的玻璃容器必須是約對(duì)清潔的。第十五頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一（三）免疫金的制備膠體金與抗原(抗體)的結(jié)合物稱為免疫金或膠體金標(biāo)記物。第十六頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一免疫金的制備方法：1、膠體金溶液的PH調(diào)整：PH值的確定原則上是選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。2、蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量的確定：用稀釋法確定。蛋白質(zhì)不足的管顏色由紅變藍(lán)；蛋白質(zhì)足的管保持紅色來變。3、標(biāo)記過程：在電磁攪拌下將1/10體積的合適濃度的蛋白溶液加入膠體金溶液中，反應(yīng)一定時(shí)間后加入BSA并調(diào)整至PH8.5，放置室溫?cái)?shù)分鐘。4、離心去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)。第十七頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一（一）斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)(DIGFA)原理：是以硝酸纖維素膜為載體并包被了抗原或抗體的滲濾裝置中，依次滴加標(biāo)本、免疫金及洗滌液，因微孔濾膜帖置于吸水材料上故溶液流經(jīng)滲濾裝置時(shí)與膜上的抗原或抗體快速結(jié)合并起到濃縮作用，達(dá)到快速檢測目的。陽性反應(yīng)在膜上呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。二、膠體金免疫技術(shù)的方法種類和原理第十八頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一第十九頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一第二十頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一（二）斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)(DIGA)原理：是將膠體金標(biāo)記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)相結(jié)合的以硝酸纖維素膜為載體的固相膜免疫技術(shù)，與斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)的過濾性能不同，DIGA中滴加在膜一端的標(biāo)本溶液受載體膜的毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)，猶如層析一般，在移動(dòng)過程中被分析物與固定于載體上某一區(qū)域的抗體或抗原結(jié)合而被固相化，無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。第二十一頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一A.B都為吸水材料，R為金標(biāo)抗體干片，T區(qū)包被特異性抗體，C區(qū)包被羊抗兔免疫球蛋白抗體第二十二頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一第二十三頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一（1）雙抗體夾心法A第二十四頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一（2）間接法第二十五頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一（3）結(jié)果判斷第二十六頁，共二十七頁，編輯于2023年，星期一（三）臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：本法操作簡單、快捷以及操作人員不需技術(shù)培