蛋白質(zhì)的分離純化和表征

蛋白質(zhì)的分離純化和表征第一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)

1.蛋白質(zhì)的酸堿性蛋白質(zhì)也是兩性電解質(zhì)，溶液的pH可以改變蛋白質(zhì)的帶電情況。蛋白質(zhì)的等電點（等離子點）受組成蛋白質(zhì)的酸性氨基酸和堿性氨基酸數(shù)目的影響。第二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一

2.蛋白質(zhì)的大分子特性

a滲透與滲透壓

溶劑分子由稀溶液向濃溶液單方面的凈移動稱為稱為滲透。滲透壓是溶液分子在平衡濃度時的凈水壓，是蛋白質(zhì)的依數(shù)性之一。

第三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一第四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一

b蛋白質(zhì)分子的擴散現(xiàn)象由于濃度差導致的溶質(zhì)分子的凈遷移，稱為擴散。擴散系數(shù)的大小與蛋白質(zhì)形狀、大小及溶劑的粘度有關。

c蛋白質(zhì)分子的沉降特性蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強大的離心力作用時發(fā)生移動的現(xiàn)象稱為沉降。沉降的速度與蛋白質(zhì)分子的大小、形狀、密度及溶劑的密度和粘度、溫度等有關。沉降系數(shù)用S做單位。第五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一

d蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)及沉淀分散相質(zhì)點的半徑介于1-100nm時形成的均勻分散的溶液，稱為膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液作為膠體溶液，穩(wěn)定的原因是蛋白質(zhì)分子表面的水化層和雙電層。沉淀蛋白質(zhì)的方法：大量的中性鹽、極性有機溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑、加熱第六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一二、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法

1.透析和超濾

2.密度梯度離心：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度

3.凝膠過濾層析(分子排阻層析)

分離蛋白質(zhì)常用的凝膠的商品名：Sephadex

某一蛋白質(zhì)樣品在凝膠柱上的分配系數(shù)

Kav=Ve:該蛋白質(zhì)的洗脫體積

Vo:凝膠柱的空隙體積(外水體積)Vt:凝膠柱的總體積Ve－VoVt－Vo第七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一凝膠過濾層析原理示意圖第八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一（二）利用溶解度差別純化蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的溶解度受到溶液的pH、離子強度、介電常數(shù)和溫度等因素的影響，所以改變以上條件，可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度，達到分離純化蛋白質(zhì)的目的。

1.通過改變?nèi)芤簆H值的等電點沉淀法

2.通過改變?nèi)芤弘x子強度的鹽析、鹽溶

3.有機溶劑的分級沉淀

4.通過改變溫度的沉淀法第九頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一（三）根據(jù)電荷不同純化蛋白質(zhì)

1.電泳紙電泳或薄膜電泳粉末電泳細絲電泳

凝膠電泳平板電泳柱狀電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳第十頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一

（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)第十一頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一濃縮膠樣品分離膠在PAGE中，除了一般的電荷效應外，還有凝膠對樣品的分子篩效應和濃縮效應，三種效應共同起作用，使樣品的分離效果大大提高。第十二頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一

（2）等電聚焦電泳(IEF)Ph=3pH=10連續(xù)pH梯度的凝膠和樣品電泳第十三頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一兩性電解質(zhì)載體

ampholite第十四頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一（3）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)在SDS和少量的巰基乙醇存在時，蛋白質(zhì)分子解聚并處于完全展開的狀態(tài)，SDS以其烴基鏈與蛋白質(zhì)分子的側鏈結合成復合物，每兩個氨基酸殘基相當于結合一個SDS分子，使得蛋白質(zhì)分子在電場中的遷移率完全取決于相對分子量而同本身所帶的電荷及形狀無關。第十五頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一第十六頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一

2.離子交換層析纖維素離子交換層析交鏈葡聚糖離子交換層析第十七頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一

（三）根據(jù)對配基的生物學特性的分離：

親和層析親和層析是利用生物親和力，即蛋白質(zhì)分子和其配基之間特有的識別能力而建立的一種純化方法。第十八頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一三、蛋白質(zhì)分子量的測定方法

1.根據(jù)化學組成測最低相對分子量

2.由滲透壓測相對分子量

3.沉降分析法測相對分子量

沉降速度法：蛋白質(zhì)分子在離心力作用下沿旋轉中心向外周方向移動，產(chǎn)生沉降界面，通過測定界面的移動速度求出蛋白質(zhì)的分子量。

沉降平衡法：蛋白質(zhì)在高速離心力作用下逐漸沉降，直至其浮力與離心力相等時為止。第十九頁，共二十一頁，編輯于2023年，星期一

4.凝膠過濾法測相對分子量在一定的分子