蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)

蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)第一頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一編制說(shuō)明第二頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽(yáng)性芽胞桿菌。在《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第九版中，歸為芽胞桿菌科芽胞桿菌屬，類似菌有炭疽芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌以及巨大芽胞桿菌。蠟樣芽胞桿菌屬于土壤細(xì)菌，在自然界廣泛分布于塵土、污水、河流和食品中，無(wú)論好氧、厭氧都能增殖、生長(zhǎng)成帶芽胞的大桿菌，在蔬菜、谷類等農(nóng)作物和食品原料中主要以芽胞狀態(tài)存在。背景第三頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一蠟樣芽胞桿菌可引起食物中毒等食源性疾病。國(guó)際上，早在1906年就有由該菌引起的病例報(bào)道，目前全世界每年都有相當(dāng)數(shù)量的病例發(fā)生。在國(guó)內(nèi)，首次報(bào)告是1973年南京某托兒所兒童因進(jìn)食泡飯引起嘔吐型蠟樣芽胞桿菌食物中毒，至今除西藏外，每個(gè)省、自治區(qū)、直轄市已經(jīng)都有報(bào)，有些地區(qū)甚至占細(xì)菌性食物中毒的首位。背景第四頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一蠟樣芽胞桿菌食源性疾病臨床表現(xiàn)有“腹瀉型”和“嘔吐型”兩種形式：“腹瀉型”食源性疾病潛伏期為8h～16h，是由于本菌在腸道內(nèi)增殖過(guò)程中產(chǎn)生腸毒素引起的，原因食品主要為肉類、肉湯和其它食物。“嘔吐型”食源性疾病潛伏期為1h～5h，是由于人攝入本菌在食品中產(chǎn)生的毒素引起的，原因食品主要為米飯類、面類（掛面、蕎麥面餅）等。背景第五頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一為了在食品中有效開(kāi)展蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)，以保障食品安全，降低蠟樣芽胞桿菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，防止食源性蠟樣芽胞桿菌疾病的發(fā)生，我國(guó)在1984年制定了《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》（GB/T4789.14-1988）標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)的頒布為蠟樣芽胞桿菌的規(guī)范檢測(cè)，為蠟樣芽胞桿菌病的監(jiān)測(cè)、預(yù)防、控制起到了重要的作用。背景第六頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一在以后的二十年時(shí)間里，食品中蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過(guò)1994年、2003年二次修訂，但內(nèi)容可以說(shuō)完全與1984年版相同。背景第七頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.對(duì)蠟樣芽胞桿菌含量少于1000cfu/g的樣品計(jì)數(shù)效果差。2.采用的36℃±1℃培養(yǎng)溫度并非是蠟樣芽胞桿菌最適生長(zhǎng)條件。3.檢驗(yàn)結(jié)果與現(xiàn)行的其它國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)存在一定差異。現(xiàn)行GB/T4789.14-2003標(biāo)準(zhǔn)不足處第八頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一重新修訂的意義

（1）提高蠟樣芽胞桿菌檢出率蠟樣芽胞桿菌的最佳生長(zhǎng)溫度為30～32℃。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)修訂協(xié)作組驗(yàn)證：蠟樣芽胞桿菌在MYP培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件以30℃±1℃培養(yǎng)48h的生長(zhǎng)率最高，平均生長(zhǎng)率達(dá)到了93.69%。其次為30℃±1℃培養(yǎng)24h，平均生長(zhǎng)率為92.28%。生長(zhǎng)率最低的培養(yǎng)條件為36℃±1℃培養(yǎng)24h。平均生長(zhǎng)率為82.32%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，30℃±1℃培養(yǎng)溫度的生長(zhǎng)率顯著高于36℃±1℃(P﹤0.05），但在培養(yǎng)溫度相同的情況下，培育時(shí)間24h和48h蠟樣芽胞桿菌生長(zhǎng)率無(wú)顯著差異（P﹥0.05）。第九頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一表1MYP培養(yǎng)條件選擇結(jié)果比對(duì)單位菌量（cfu/皿）MYP平板計(jì)數(shù)結(jié)果30℃±1℃24h30℃±1℃48h36℃±1℃24h36℃±1℃48h計(jì)數(shù)結(jié)果cfu/皿生長(zhǎng)率（%）計(jì)數(shù)結(jié)果cfu/皿生長(zhǎng)率（%）計(jì)數(shù)結(jié)果cfu/皿生長(zhǎng)率（%）計(jì)數(shù)結(jié)果cfu/皿生長(zhǎng)率（%）吉林省CDC8688102.3388102.336474.426474.42湖北省CDC4048120.0048120.0045112.5045112.50江蘇省CDC672537.312638.815074.635074.63浙江省CDC17073104.2873104.286491.436491.43廣東微生物研究所5981137.2988149.1561103.3871120.34浙江省CDC2916571.425964.845964.845054.95浙江省CDC33437108.8237108.822573.532573.53平均值63.8659.5792.2859.8693.6952.5782.3252.7182.54第十頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一

１.增加食品中蠟樣芽胞桿菌定性檢測(cè)方法。

5家標(biāo)準(zhǔn)修訂協(xié)作組，按新修訂的《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》方法進(jìn)行蠟樣芽胞桿菌定性試驗(yàn)結(jié)果，生肉樣品的平均最低檢出限為5.56cfu/g，熟肉樣品的平均最低檢出限為1.94cfu/g，米飯樣品的平均最低檢出限為1.03cfu/g，3種樣品蠟樣芽胞桿菌定性試驗(yàn)的平均最低檢出限為2.84cfu/g

（2）擴(kuò)大檢測(cè)范圍第十一頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.在定量檢測(cè)方面，美國(guó)FDA、ISO、以及SN0176-92標(biāo)準(zhǔn)除采用平板計(jì)數(shù)外，還采用了MPN法。新標(biāo)準(zhǔn)增加MPN法可以彌補(bǔ)樣品中蠟樣芽胞桿菌帶菌量少于103cfu/mL時(shí)用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)不準(zhǔn)的問(wèn)題，同時(shí)該方法操作與現(xiàn)行大腸菌群的操作類似，容易推廣使用。（2）擴(kuò)大檢測(cè)范圍第十二頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一隨著經(jīng)濟(jì)全球化的發(fā)展，食品貿(mào)易不斷擴(kuò)大，食品安全問(wèn)題已越來(lái)越收到各國(guó)政府的重視，為了保護(hù)我國(guó)消費(fèi)者健康，避免貿(mào)易摩擦，急需對(duì)原標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，使其與國(guó)際接軌。（3）便于與國(guó)際接軌第十三頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一新標(biāo)準(zhǔn)將考慮我國(guó)的實(shí)際情況，使蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)方法具有更好的適用性和可操作性。并保持與原標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)性。（4）提高方法的適用性和可操作性第十四頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（1）與國(guó)際接軌的原則，該標(biāo)準(zhǔn)的起草內(nèi)容主要參考了美國(guó)食品藥品管理局（FDA）BacteriologicalAnalyticalManual，Chapter14：Bacilluscereus

（2001）并部分參考采用了英國(guó)NHA、美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）等標(biāo)準(zhǔn)。盡量做到與國(guó)際上的蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)方法相統(tǒng)一，便于與國(guó)際蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)接軌修訂原則第十五頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（2）保持與原標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)性。與現(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)統(tǒng)一，鑒于我國(guó)已有相關(guān)的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，在內(nèi)容設(shè)計(jì)時(shí)多參考了目前現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)條款，如樣品前處理步驟與沙門菌、大腸菌群檢測(cè)方法盡量相同，在常規(guī)生化、生化分型方面盡量沿用原標(biāo)準(zhǔn)中的方法。這樣既便于試驗(yàn)和操作，又節(jié)省了檢測(cè)成本。修訂原則第十六頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一——增加定性檢測(cè)內(nèi)容；——增加MPN計(jì)數(shù)內(nèi)容；——將選擇性分離培養(yǎng)基（MYP）培養(yǎng)條件由37℃培養(yǎng)12h～20h改為30℃±1℃培養(yǎng)24h～28h；——生化試驗(yàn)增加了溶菌酶試驗(yàn)；新標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.14－2003相比主要修改如下第十七頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)

蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)

（修訂版）第十八頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中蠟樣芽胞桿菌的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品及食物中毒樣品中的蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)。1范圍

第十九頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1冰箱：2℃～8℃、-15℃2.2恒溫培養(yǎng)箱：30℃±1℃、36℃±1℃。2.3厭氧培養(yǎng)裝置。2.4顯微鏡：10～100×。2.5均質(zhì)器或無(wú)菌乳缽。2.6天平：感量0.1g。2.7無(wú)菌試管：18mm×180mm、15mm×100mm。2.8無(wú)菌刻度吸管：1mL（具0.01mL刻度），10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。2.9無(wú)菌廣口瓶：500mL，250mL。2.10無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。2設(shè)備和材料

第二十頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.1磷酸鹽緩沖液（PBS）、3.2甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂(MYP)、3.3胰酪胨大豆多粘菌素肉湯、3.4營(yíng)養(yǎng)瓊脂、3.5胰酪胨大豆羊血瓊脂(TSSB)、3.6酪蛋白瓊脂、3.7動(dòng)力培養(yǎng)基、3.8V-P培養(yǎng)基、3.9硝酸鹽肉湯、3.10西蒙氏檸檬酸培養(yǎng)基、3.11明膠培養(yǎng)基、3.12葡萄糖發(fā)酵管、3.13甘露醇發(fā)酵管、3.14木糖發(fā)酵管、3.15溶菌酶營(yíng)養(yǎng)肉湯3培養(yǎng)基和試劑第二十一頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一檢樣25g（mL）樣品+225mLPBS，均質(zhì)定性檢測(cè)定量檢測(cè)24h2h30℃1℃24h~48h30℃1℃24h~48h24h2h30℃1℃30℃1℃24h2h30℃1℃原液或1:10樣品勻液+胰酪胨大豆多粘菌素肉湯10倍系列稀釋MPN計(jì)數(shù)10-1～10-3的稀釋度3管胰酪胨大豆多粘菌素肉湯

平板計(jì)數(shù)選擇2～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，各取0.1mL，涂布到MYP平板MYP平板劃線分離

計(jì)數(shù)接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板確證實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)果MPN計(jì)數(shù)平板計(jì)數(shù)定性檢測(cè)4檢驗(yàn)程序第二十二頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一5操作步驟第二十三頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過(guò)15min或在2℃～8℃不超過(guò)18h解凍。若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)放于-15℃左右保存；非冷凍而易腐的樣品應(yīng)盡可能及時(shí)檢驗(yàn)。若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)置于2℃～8℃冰箱保存，在24h內(nèi)檢驗(yàn)。5.1樣品處理第二十四頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一以無(wú)菌操作取樣品25g（mL），加入PBS225mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊2min。如無(wú)均質(zhì)器，則將樣品放入無(wú)菌乳缽中磨碎，然后稱取25g（mL）置合適的容器中，加225mLPBS，充分振蕩混勻。制成1:10的樣品勻液。5.2樣品制備

第二十五頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一5.3.1增菌取1：10的樣品勻液10mL（液體樣品可以選擇原液），加入90mL胰酪胨大豆多粘菌素肉湯中，于30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。5.3定性檢測(cè)

第二十六頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一5.3.2分離取胰酪胨大豆多粘菌素增菌液劃線接種于MYP瓊脂平板上。于30℃±1℃培養(yǎng)24h～48h。觀察平板上生長(zhǎng)的菌落。在MYP瓊脂平板上，典型菌落為灰白色至微粉紅色，周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)。5.3定性檢測(cè)第二十七頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一MYP瓊脂平板第二十八頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一5.3.3純培養(yǎng)從每個(gè)平板選取至少5個(gè)典型或可疑菌落，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，典型菌落在為灰白色，偶有黃綠色，不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴(kuò)展?fàn)?，直徑?mm～10mm；5.3定性檢測(cè)第二十九頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三十頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一5.4.1樣品的稀釋吸取1：10的樣品勻液1mL加到裝有9mLPBS的稀釋管中，充分混勻制成1：100的樣品勻液。據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。5.4定量檢測(cè)

第三十一頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一5.4.2.1選擇2～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度分別吸取0.1mL接種到MYP瓊脂平板上，每稀釋度接種兩個(gè)MYP瓊脂平板。用無(wú)菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如MYP瓊脂平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。5.4.2平板計(jì)數(shù)

第三十二頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一5.4.2.2涂布后，將平板置于30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h后（原標(biāo)準(zhǔn)為36℃±1℃培養(yǎng)12h～20h），選取具有15個(gè)～150個(gè)典型或可疑蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，進(jìn)行計(jì)數(shù)。并計(jì)算同一稀釋度兩個(gè)平板的平均菌落數(shù)。如果菌落不典型，可繼續(xù)培養(yǎng)18h～24h再計(jì)數(shù)。第三十三頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一5.4.2.3計(jì)數(shù)后，從每個(gè)平板選取至少5個(gè)已計(jì)數(shù)的典型或可疑菌落，如果一個(gè)平板上少于5個(gè)典型或可疑菌落，則取所有典型或可疑菌落，分別劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。第三十四頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一5.4.2.4根據(jù)確證實(shí)驗(yàn)確定為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)，按比例計(jì)算出該平板上蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)，然后計(jì)算同一稀釋度兩個(gè)平板的平均蠟樣芽胞桿菌數(shù)，再乘其稀釋倍數(shù)，再乘以10，即得每g（mL）樣品中蠟樣芽胞桿菌數(shù)并作出報(bào)告。第三十五頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一例：將檢樣10-4稀釋液0.1mL涂布于MYP瓊脂平板上，一塊平板形成的可疑菌落數(shù)為65個(gè)，另一塊平板形成的可疑菌落數(shù)為56個(gè)，各取5個(gè)進(jìn)行鑒定，證實(shí)第一塊平板蠟樣芽胞桿菌的是4個(gè)，第二塊平板蠟樣芽胞桿菌的是5個(gè)，則1g（mL）樣品中蠟樣芽胞桿菌數(shù)[cfu/g(mL)]為[(65×4/5)+(56×5/5)]÷2×104×10＝5.4×106。第三十六頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一適用于蠟樣芽胞桿菌污染數(shù)小于103cfu/g(mL)的食品。5.4.3.1取10-1、10-2、10-3三個(gè)稀釋度的樣品勻液，接種于10mL胰酪胨大豆多粘菌素肉湯中，每一稀釋度接種3管，每管接種1mL（如果接種量需要超過(guò)1mL，則用雙料胰酪胨大豆多粘菌素肉湯）。于30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。5.4.3最可能數(shù)(MPN)計(jì)數(shù)第三十七頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一5.4.3.2用直徑3mm左右的接種環(huán)，從各管中移取1環(huán)，劃線接種到MYP瓊脂平板上，30℃±1℃培養(yǎng)24h～48h。

5.4.3.3從每個(gè)平板選取至少5個(gè)典型或可疑菌落，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。第三十八頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一6.1形態(tài)挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落，作革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽(yáng)性芽胞大桿菌，大小為（1～1.3）μm×（3～5）μm，芽胞呈橢圓形位于菌體中央或偏端，不膨大于菌體，菌體兩端較平整，多呈短鏈或長(zhǎng)鏈狀排列。6確證實(shí)驗(yàn)

第三十九頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落，進(jìn)行酪蛋白分解試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、溶菌酶耐性試驗(yàn)，蠟樣芽胞桿菌的主要生化特征見(jiàn)表1。6.2生化鑒定第四十頁(yè)，共四十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一挑取單個(gè)可疑菌落劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，30℃±1