間充質(zhì)干細胞的臨床應用心得

間充質(zhì)干細胞的臨床應用心得第一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二內(nèi)容MSCs的生物學特性MSCs的免疫調(diào)控作用MSCs與免疫細胞（T、B、DC、NK、CTL）MSCs的免疫調(diào)控機制MSCs的臨床應用第二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二間充質(zhì)干細胞生物學特性來源廣泛自我更新、多向分化潛能易擴增傳代能力MSCsIL-6,IL-7,IL-10,IL-11,SCF,SDF-1GM-CSF,M-CSF..adipocyteosteocytechondrocytemyoblastcardiocyteNervecellhepatocyte可來源于骨髓、胰腺、皮膚、肺臟等多處器官組織

體外能夠傳40代，并保持穩(wěn)定的表型和多向分化的潛能（MesenchymalStemCells，MSCs)第三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二免疫調(diào)節(jié)作用產(chǎn)生多種細胞因子分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、干細胞生長因子（SCF）、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等

表達多種細胞表面分子CD105、CD73、CD44、CD71、CD90、CD166、基質(zhì)細胞抗原（STRO-1）等無MHC限制不管MSCs或T細胞來源種類，MSCs均能對T細胞增殖產(chǎn)生免疫抑制作用第四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二狼瘡骨髓MSCs（BMSCs）SLE骨髓（P0）MSCs第25d倒置顯微鏡觀察×100人正常人與SLE患者BMSCs形態(tài)大小上無差異，均以長梭形為主孫凌云等，中華風濕病學雜志，2005形態(tài)觀察第五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二SLE組正常對照組原代培養(yǎng)時間26±7.76d17±5.46dP=0.029形態(tài)學無區(qū)別SLE與正常對照組BMSCs培養(yǎng)比較張華勇，孫凌云，中華風濕病學雜志，2006擴增效率P5代后降低P10代后降低

第六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二表達CD29、CD44和CD105

不表達CD14、CD34、CD45、HLA-DR

正常組與狼瘡組表型表達并無差異（P<0.05)張華勇，孫凌云，中華風濕病學雜志，2006表面標記測定第七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二dCellpopulation生長曲線呈S形SLE患者BMSCs總體生長較正常人緩慢

張華勇，孫凌云，中華風濕病學雜志，2006正常人與SLE患者BMSCs生長曲線比較第八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二對照SLEBeta-actinIL-7SLE中IL-6、IL-7表達降低（P<0.05）而IL-11,M-CSF表達無區(qū)別張華勇，孫凌云，中華風濕病學雜志，2006正常人與SLE患者BMSCs細胞因子表達比較第九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二張華勇，孫凌云，中華風濕病學雜志，2006SLE患者BMSCs染色體組型

——為正常的染色體組型第十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二鼠

BALB/cNZBWF1/J

（P0）×100

形態(tài)上無顯著差異但狼瘡MSCs增殖速度更快、傳代時間更短不同于人？SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006形態(tài)學第十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二MSCs與免疫細胞MSCs與T細胞不活化異基因T細胞抑制T細胞增殖包括初始和記憶性T細胞的增殖包括同種異基因抗原、絲裂原或抗原特異性刺激對T細胞凋亡影響一：不誘導靜止期T細胞凋亡（TseWTetal.Transplantation，2003，75：389-397.）二：誘導活化的T細胞凋亡（PlumasJetal.Leukemia2005;19:1597-604.）第十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二與正常（BALB/c）及狼瘡鼠（NZBWF1/J）BMSCs共培養(yǎng)均導致活化的T細胞凋亡下降（P<0.05)三：使活化的T細胞凋亡降低SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006

單獨T細胞T＋狼瘡BMSCsT＋正常BMSCs第十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二1.正常鼠BMSCs對狼瘡T細胞IFN-γ、IL-4生成的影響IFN-γ生成T細胞被刺激增多IL-4生成T細胞被抑制減少正常BMSCs可促進TH1而抑制TH2細胞生成—影響SLE病情DengW,etal.DNAandCellBiology.2005;24:458-463對T細胞亞群的影響T細胞內(nèi)細胞因子測定第十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二

與正常鼠BMSCs(BALB/c)共孵育：↑IFN-γ*,IL-12*IL-4*,IL-10,IL-6，TNF-α*

向TH1偏移與狼瘡鼠BMSCs(NZBWF1/J)共孵育：↑IL-6*,IL-4,IL-10

↓TNF-α*

向TH2偏移#*##*##*2.BMSCs與正常T細胞共孵育前后細胞內(nèi)細胞因子的變化SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006*為有統(tǒng)計學意義第十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二

T-betβ-actinA.T＋狼瘡MSCs

B.單獨TC.T＋正常MSCsGATA-3β-actin

ABCABC與正常鼠BMSCs共培養(yǎng)：T-bet↑，GATA-3↓TH1↑與狼瘡鼠BMSCs共培養(yǎng)：T-bet↓，GATA-3↑TH2↑轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3

SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006第十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二正常MSCs：使TH1/TH2平衡向TH1偏移狼瘡鼠病情緩解？狼瘡MSCs：使TH1/TH2平衡向TH2偏移狼瘡鼠病情惡化？

狼瘡鼠BMSCs對T細胞免疫調(diào)節(jié)功能存在缺陷對TH1/TH2平衡影響第十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二MSCs與B細胞人BMSCs可抑制B細胞增殖增殖抑制與B細胞的凋亡無關(guān)，而與細胞周期滯留于G0/G1有關(guān)由可溶性細胞因子介導（不需細胞間直接接觸）抑制抗體生成(IgA、IgM、

IgG)CorcioneA,etal.Blood.2006;107:367-372第十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二MSCs與NK細胞靜止期NK不能裂解人MSCs。IL-2活化的自體及異體NK細胞均可裂解BMSCsBMSCs抑制IL-2誘導的靜止期NK細胞的增殖，部分抑制已活化NK細胞的增殖經(jīng)IFN－γ預處理可抑制該裂解作用—上調(diào)MSCs的HLA-Ⅰ類分子水平阻止NK細胞的活化SpaggiariGM,etal.Blood.2006;107:1484-1490NK對MSCs的裂解作用.（E/T即NK/MSC）

第十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二MSCs與DC細胞人BMSCs與DC共培養(yǎng)對DC分化、成熟、功能影響

顯著抑制單核細胞向DC分化（無需細胞間接觸）

抑制DC分泌TNF-α的能力引起免疫耐受成熟DC（CD83、HLA-DR、CD1a、CD80、CD86）表達↓，IL-12分泌↓向非成熟狀態(tài)的偏離對同種T細胞的活化能力下降

JiangXXetal.Blood，2005;105:4120-4126

第二十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二MSCs與CTL抑制CTLs的細胞毒作用呈時間和劑量依賴不能抑制已活化CTLs的細胞毒作用通過可溶性因子介導

MSCs不是CTLs作用的靶細胞RasmussonI,etal.Transplantation，2003，76:1208-1213

第二十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二MSCs的免疫調(diào)控可能機制MSCs分泌可溶性細胞因子

CD8+調(diào)節(jié)性T細胞吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）

誘導調(diào)節(jié)性APCs

第二十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二機制分泌可溶性細胞因子介導

IL-10、TGF-β1、前列腺素E2（PGE2）、肝細胞生長因子(HGF)、IL-2、IL-2R等不需要細胞間直接接觸矛盾觀點不同細胞因子介導需要與T細胞直接接觸不同的來源、提取、培養(yǎng)、鑒定方法等可能導致收集的MSCs亞群不同（見下表）第二十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二Extractionsites(Prinzetal.,1999)Bonemarrow(livedonors）:hip,sternum,brokenbonesBonemarrow(cadaverdonors):allsites(rare)Othertissue:teeth,fat,muscle,cartilage,synovialfluid,skinDevelopmentaltissue:foetal,umbilical,placentaDissociationmethodTrypsinationScrapingSuspensioncultureMarkercombinationsCD10+,CD13+,CD34+,CD56+,CD90+,MHC-1+(Youngetal.,1999)VCAM+,STRO-1+,CD73+,CD105+(Tulietal.,2003)Wnt2+,Wnt4+,Wnt5a+,Wnt11+,Wnt16+,Fz2+,Fz3+,Fz4+,Fz5+,Fz6+(Etheridgeetal.,2004)…IdentificationAdherencetoplasticMagneticbeadFACScellsortingOtherfactorsCelllineorexvivoDonorageDonorsexDonordiseasestatusMediumcompositionPointoffirstanalysisCultureconditions(temperature,motion,etc.)DifferentiationagentFrequencyofmediumchange…SetheS,etal.AgeingResearchReviews.2006;5:91-116第二十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二DjouadF,etal.Blood.2003;102:3837-3844誘導CD8+調(diào)節(jié)性Ｔ細胞產(chǎn)生MSCs作用的靶T細胞—CD8+亞群通過誘導CD8+調(diào)節(jié)性Ｔ細胞發(fā)揮免疫抑制作用Condedsplenocytes+MSCMLR鼠BMSCs抑制MLR中CD8+亞群的增殖CD8+亞群抑制淋巴細胞增殖第二十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）介導BMSCs在IFN-γ的誘導下大量表達IDO

色氨酸犬尿素

抑制T細胞抗原應答色氨酸加入Ｔ細胞的增殖可顯著恢復

IDO-介導的色氨酸降解—人BMSCs抑制T細胞增殖MeiselR,etal.Blood.2004;103:4619-4621第二十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二誘導調(diào)節(jié)性APCs產(chǎn)生人BMSCs可能干涉APCs的成熟轉(zhuǎn)變?yōu)檎{(diào)節(jié)性APCs

BeythS,etal.Blood.2005;105:2214-2219缺乏T細胞活化能力接觸依賴性伴前炎癥分子IL-12,TNF-α，MHC-Ⅱ表達↓抗炎癥細胞因子IL-10表達↑MSCs調(diào)節(jié)性APCs防止或減輕GVHD？第二十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二MSCs的臨床應用優(yōu)點無或低免疫原性

無MHC限制誘導宿主免疫耐受降低移植排斥反應第二十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二體外培養(yǎng)擴增MSCs作為組織工程的種子細胞，修復各種組織、器官作為基因治療的載體細胞：轉(zhuǎn)基因或基因修飾MSCs植入，替代有缺陷的骨髓利用免疫抑制、降低移植排斥，用于器官或組織移植與HSCs共移植治療血液、腫瘤、免疫性等臨床疾病防治GVHD

主要應用皮膚骨、軟骨、肌腱關(guān)節(jié)腦神經(jīng)組織心肌等第二十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二

DiseaseNo.SourceofMSCs/SCTOutcomeRef.StudyPatientsSettingHematologic15AutologousIVNoadverseeventsof1,Lazarusetal.malignanciesinfusion10,and50×106cellsBreastcancer28AutologousinIVinfusionwassafe;Ko?etal.autologousSCTautologousSCTrecoverywasrapidInbornerrorsof11HLA-identicalNoimmuneresponseagainstkocetal.MetabolismfromSCTdonordonor;improvednerveconductiovelocityinmetachromaticleukodystrophyOsteogenesis5HLA-identicalfromGene-markedMSCsengrafted;Horwitzetal.ImperfectaSCTdonornewdenseboneformation;fewfracturesAcutemyeloid1HLA-haploidenticalSCTengraftmentwithnoGVHDLeeetal.LeukemiafromSCTdonorLeukemia31HLA-identicalfromRapidplateletengraftment;lowrassonietal.SCTdonorincidenceofacuteGVHDSevereaplastic1AllogeneicMSCEngraftment;improvedstromaFouillardetal.anemiaSevereacute1HaploidenticalMSC;ClearanceofgradeIVacuteLeBlancetal.GVHDunrelateddonorSCTGVHD,twice

MSCs與HSCs共移植的臨床研究LeBlancC,etal.BiologyofBloodandMarrowTransplantation.2005;11:321-334第三十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二1.血液疾病女，20歲，急性白血病

—全身照射+傳統(tǒng)化療—5.7×106CD34+cells/kg+1.5×106MSCs/kg（來自患者父親）—無急性GVHD或慢性GVHD發(fā)生—移植后31月血象正常，無病情復發(fā)LeeST,etal.BrJHaematol.2002;118:1128-1131.第三十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二2.腫瘤28名乳腺癌患者－接受高劑量化療＋自體干細胞移植－靜脈輸注1～2×106/kg

MSCs－無輸注后毒性反應發(fā)生－治療后血小板>0.5×109/L的平均時間9d(4-19d)

中性粒細胞>0.5×109/L的平均時間8d(6-11d)KocON,etal.ClinOncol,2000;18:307-316MSCs可促進HSCs移植第三十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二3.GVHD（移植物抗宿主?。镠SCT常見并發(fā)癥（20％－60％）預防方法

傳統(tǒng)移植物中除去供者T細胞（體外T細胞清除）T細胞抗體處理(體內(nèi)T細胞清除）免疫抑制藥物使用新策略MSCs輸注下調(diào)宿主抗原呈遞細胞第三十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二31名患者接受HLA相匹配的同胞HSCs＋MSCs移植MSCs劑量1－5×106/kg無MSCs輸注相關(guān)毒性反應急性II～IVGVHD發(fā)生率為15%(對照組40%,P=0.01)慢性GVHD發(fā)生率為12%（對照組67%,P=0.002)6月存活率88%（對照組67%)ASCT同時輸入MSCs可促進移植，降低GVHD,提高生存率FrassoniF,etal.BoneMarrowTransplant2002;29(suppl2)第三十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二MSCs治療急性GVHD一例男，9歲，急性淋巴細胞白血病HSCT后發(fā)生Ⅳ型急性GVHD癥狀：腹瀉，高膽紅素血癥，反復細菌、真菌、病毒感染常規(guī)抗GVHD治療無效移植后73d予靜脈輸注2×106/kg

MSCs（來自患者母親），第170d予1×106/kg

MSCs治療效果：癥狀好轉(zhuǎn)至消失，血膽紅素正常，急淋緩解該中心1000例接受異基因HSCT患者中，25例發(fā)生急性Ⅳ型GVHD，除此例外，另24例均死亡（移植后0.5－5.5月，平均2月）如下圖第三十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二患者移植臨床過程LeBlancK，etal.Lancet.2004;363:1439–41結(jié)論:

利用MSCs的免疫抑制作用可治療急性GVHD第三十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期二MSCs治療激素難控制型急性GVHD8例治療組例數(shù)/次數(shù)急性GVHD8慢性GVHD1MSCs治療1次6MSCs治療2次3移植后急性GVHD消失6移植后死亡3巨細胞病毒胃腸炎1存活（2