艾滋病抗病毒治療與實(shí)驗(yàn)室檢測進(jìn)展

艾滋病抗病毒治療與實(shí)驗(yàn)室檢測進(jìn)展實(shí)驗(yàn)室檢測是艾滋病臨床診斷、病程進(jìn)展監(jiān)測、抗病毒治療啟動(dòng)、治療效果監(jiān)測、耐藥性檢測及調(diào)整治療方案等診療工作不可或缺的技術(shù)支撐。為滿足不斷增加的艾滋病診斷和治療相關(guān)的防治需求，全國艾滋病實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)不斷發(fā)展壯大。特別是實(shí)施“四免一關(guān)懷”政策以來，實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)建設(shè)快速持續(xù)發(fā)展，檢測技術(shù)和檢測策略也適時(shí)進(jìn)行完善、更新，為艾滋病診斷和治療提供了有力的技術(shù)支持和質(zhì)量保證，助力我國艾滋病防治工作取得顯著成效。1艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與發(fā)展2006年的《全國艾滋病檢測工作管理辦法》中，將艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室分為三類，分別為參比實(shí)驗(yàn)室、確證實(shí)驗(yàn)室和篩查實(shí)驗(yàn)室［1］，規(guī)定了各類實(shí)驗(yàn)室的具體管理辦法，為全國艾滋病實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)規(guī)范化管理奠定了基礎(chǔ)。在《中國遏制與防治艾滋病行動(dòng)計(jì)劃》（2006－2010年）中提出實(shí)驗(yàn)室建設(shè)發(fā)展應(yīng)建成覆蓋縣級以上的國家艾滋病監(jiān)測體系和篩查實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)［2］，健全市級以上確證實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)。之后的“十二五”和“十三五”《中國遏制與防治艾滋病行動(dòng)計(jì)劃》進(jìn)一步為實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與發(fā)展提供了強(qiáng)大的發(fā)展動(dòng)力［3-4］。截至2021年底，我國已有篩查實(shí)驗(yàn)室13261個(gè)和檢測點(diǎn)35912個(gè)，覆蓋了96.9%的縣級行政區(qū)域。確證實(shí)驗(yàn)室739個(gè)，覆蓋了91.7%的地級行政區(qū)域。遍布全國的篩查和確證實(shí)驗(yàn)室，為各地進(jìn)行艾滋病診斷提供了技術(shù)保證。同時(shí)，隨著抗病毒治療需求增加，CD4細(xì)胞、病毒載量、基因型耐藥檢測技術(shù)平臺也得到了快速發(fā)展。截至2021年底，全國各級疾病預(yù)防控制系統(tǒng)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)等共有1195個(gè)實(shí)驗(yàn)室具備yCD4細(xì)胞檢測能力，446個(gè)實(shí)驗(yàn)室具備了病毒載量檢測能力，61個(gè)實(shí)驗(yàn)室具備了基因型耐藥檢測能力，為國家免費(fèi)抗病毒治療工作的大規(guī)模開展提供了檢測技術(shù)保障，使我國超過百萬HIV感染者的治療效果得到科學(xué)評估。實(shí)施“四免一關(guān)懷”政策以來，2004年在自愿咨詢檢測門診實(shí)施免費(fèi)抗體篩查檢測，2006年起在疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)實(shí)施免費(fèi)CD4細(xì)胞檢測和病毒載量檢測，2008年起在疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)實(shí)施免費(fèi)抗體確證檢測［5］，這些免費(fèi)政策有力促進(jìn)了全國艾滋病篩查、確證和治療相關(guān)的檢測工作。2艾滋病檢測質(zhì)量保證體系的建立和發(fā)展為加強(qiáng)艾滋病檢測工作的規(guī)范化管理，不斷完善檢測質(zhì)量，為臨床診斷和治療監(jiān)測提供準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，有效服務(wù)于臨床診斷和治療相關(guān)的檢測需求，國務(wù)院出臺了一系列政策文件對艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)的建設(shè)提出具體要求和發(fā)展目標(biāo)［2-4］。艾滋病檢測質(zhì)量保證體系也在同步建立和完善，目前已建立了部級質(zhì)量保證體系和省級質(zhì)量保證體系［5］。部級質(zhì)量保證體系部級質(zhì)量保證體系以中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心參比實(shí)驗(yàn)室為核心，負(fù)責(zé)組織編寫和修訂一系列檢測質(zhì)量保證指南，指導(dǎo)各級實(shí)驗(yàn)室的艾滋病檢測質(zhì)量保證工作。主要包括《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴細(xì)胞檢測質(zhì)量保證指南》《HIV-1病毒載量檢測及質(zhì)量保證指南》《HIV-1基因型耐藥檢測及質(zhì)量保證指南》等［6-8］。此外，參比實(shí)驗(yàn)室組織各類檢測項(xiàng)目的部級培訓(xùn)，對各級實(shí)驗(yàn)室開展現(xiàn)場技術(shù)督導(dǎo)，以及對艾滋病檢測試劑質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測。部級質(zhì)量保證體系的一個(gè)重要技術(shù)支撐是參比實(shí)驗(yàn)室組織的部級能力驗(yàn)證（ProficiencyTesting,PT）。自1998年啟動(dòng)血清學(xué)檢測能力驗(yàn)證（包括快速篩查、ELISA篩查、WB確證）以來，先后啟動(dòng)CD4細(xì)胞檢測能力驗(yàn)證（2003年）、HIV-1病毒載量檢測能力驗(yàn)證（2005年）、HIV-1基因型耐藥檢測能力驗(yàn)證（2006年）。部級質(zhì)量保證體系的不斷發(fā)展完善，有效覆蓋了全國各省的確證實(shí)驗(yàn)室，CD4細(xì)胞、病毒載量和耐藥檢測實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室的考評合格率不斷提升，近年來各檢測項(xiàng)目的考評合格率均穩(wěn)定達(dá)到95%以上。此外，參比實(shí)驗(yàn)室還組織開展乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、梅毒非特異性抗體、梅毒特異性抗體、HIV-1新發(fā)感染等檢測項(xiàng)目的能力驗(yàn)證。每年對所有能力驗(yàn)證結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理情況進(jìn)行綜合考評。自2013年起，全國艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室管理信息全部納入電子信息管理平臺，所有質(zhì)量管理考評結(jié)果通過電子信息系統(tǒng)進(jìn)行錄入和統(tǒng)計(jì)，極大提升了網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室的信息收集和管理能力。省級質(zhì)量保證體系各?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）也逐步建立和發(fā)展了以艾滋病確證中心實(shí)驗(yàn)室為核心的省級質(zhì)量保證體系，包括對轄區(qū)內(nèi)篩查實(shí)驗(yàn)室的血清學(xué)抗體檢測能力驗(yàn)證，對轄區(qū)內(nèi)所有艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理考評，對下級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測技術(shù)和質(zhì)量控制的分級培訓(xùn)和現(xiàn)場技術(shù)督導(dǎo)。部分省份實(shí)現(xiàn)了質(zhì)量管理考評的電子化數(shù)據(jù)上報(bào)與管理。省級質(zhì)量保障體系的建立有力推動(dòng)和促進(jìn)了省級以下艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理和檢測質(zhì)量，基本滿足了各地不斷增加的診斷和治療檢測需求。3艾滋病檢測技術(shù)和檢測策略的發(fā)展自1985年美國批準(zhǔn)第一種HIV抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑以來,艾滋病檢測技術(shù)和策略不斷發(fā)展。作為我國艾滋病檢測工作的綱領(lǐng)性文件，《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》不斷發(fā)展和完善（2004版，2009版、2015版、2020版）［9］，適時(shí)納入國內(nèi)外最新的檢測技術(shù)和策略進(jìn)展，更好地滿足我國艾滋病檢測工作需求，有效指導(dǎo)各級實(shí)驗(yàn)室的艾滋病檢測工作。HIV血清學(xué)檢測HIV血清學(xué)檢測可用于陽丫感染者的篩查和確證。我國目前廣泛用于陽丫感染者血清學(xué)篩查的酶聯(lián)免疫檢測和快速檢測主要使用檢測抗HIV1/2抗體的第三代篩查檢測試劑，檢測窗口期為感染后3?4周。近年發(fā)展的可同時(shí)檢測HIV-1p24抗原和抗HIV1/2抗體的第四代篩查檢測試劑，檢測窗口期縮短到感染后2周左右，在我國各級檢測實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用日益增加。化學(xué)發(fā)光免疫檢測是近年來發(fā)展的新技術(shù)，由于用發(fā)光底物替代ELISA顯色底物，背景很低，因此靈敏度優(yōu)于常規(guī)的酶聯(lián)免疫檢測。化學(xué)發(fā)光免疫檢測可以實(shí)現(xiàn)高度自動(dòng)化和高通量分析、快速出報(bào)告，已成為臨床測定微量抗原或抗體的主流技術(shù)［10］?？焖贆z測試劑一般操作簡單，在10~30分鐘內(nèi)出結(jié)果。目前，我國批準(zhǔn)的快速檢測試劑可使用包括血液、口腔黏膜滲出液、尿液在內(nèi)的多種樣本，滿足了不同應(yīng)用場景的需求。2019年，我國藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了國際上首個(gè)基于尿液樣本檢測的快速檢測試劑，也可用于陽丫自我檢測，進(jìn)一步提高yHiv篩查檢測的可及性［11］。篩查檢測的技術(shù)進(jìn)步促進(jìn)了電丫感染者的早期檢測和發(fā)現(xiàn)。HIV-1病毒載量檢測我國于1997年引進(jìn)HIV-1病毒載量檢測技術(shù)，早年主要使用基于反轉(zhuǎn)錄PCR(Reversetranscriptase-polymerasechainreac-tion,RT-PCR)、核酸序列依賴性擴(kuò)增(Nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA)＞分枝口M(BranchedDNAsignalamplification,bDNA)等原理的檢測技術(shù)，2010年以來基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Re-al-timePCR)原理的檢測技術(shù)逐漸發(fā)展。2015年和2019年，基于bDNA和NASBA原理的檢測技術(shù)已經(jīng)分別停用，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的病毒載量檢測技術(shù)逐漸成為主流［12］。2016年以來國產(chǎn)HIV-1病毒載量檢測試劑不斷發(fā)展,多項(xiàng)研究顯示國產(chǎn)檢測試劑與進(jìn)口檢測試劑之間的差距逐漸縮?。?3-14］。HIV-1病毒載量即時(shí)檢測(molecularpoint-of-careTest-ing,POCT)技術(shù)可快速獲得結(jié)果,有效減少從采樣到反饋結(jié)果的時(shí)間,適合在資源有限地區(qū)應(yīng)用。近年來，WHO推薦將病毒載量即時(shí)檢測用于及時(shí)監(jiān)測HIV感染者的抗病毒治療效果，以加快結(jié)果返回和臨床決策的時(shí)間［15］。我國已有通過國家藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的HIV-1病毒載量即時(shí)檢測設(shè)備，檢測過程可在90分鐘內(nèi)完成［16］。既往HIV-1病毒載量檢測主要用于監(jiān)測抗病毒治療的效果，或輔助HIV感染診斷。隨著我國持續(xù)推動(dòng)擴(kuò)大檢測策略，越來越多的早期感染者可以通過抗原抗體或抗體篩查發(fā)現(xiàn)，而抗體確證檢測方法由于窗口期較長（4~5周），存在延遲診斷的情況［17］。為盡早明確感染狀態(tài)，2015年的《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》明確提出使用病毒載量檢測作為補(bǔ)充試驗(yàn)的策略［18］，對于篩查試驗(yàn)有反應(yīng)者建議核酸檢測或2~4周后復(fù)查。在2018年的《中國艾滋病診療指南》和2019年的《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中［19-20］也明確提出對于成人、青少年及18月齡以上兒童，HIV抗體篩查試驗(yàn)有反應(yīng)和血漿病毒載量大于5000拷貝/mL時(shí)，即可診斷用丫感染。核酸檢測作為補(bǔ)充試驗(yàn)策略，可極大提高HIV-1抗體不確定樣本的診斷率及診斷效率，縮短診斷周期，使感染者及早獲得治療［21-22］。CD4細(xì)胞檢測CD4細(xì)胞檢測是判斷陽丫感染者免疫狀況、臨床分期，評價(jià)抗病毒藥物治療效果的重要指標(biāo)。常用的CD4細(xì)胞檢測方法分為兩類，一類是流式細(xì)胞儀測定法，包括雙平臺法（DPT）和單平臺法（SPT）,另一類是非流式細(xì)胞儀測定法，如基于成像技術(shù)的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。雙平臺法始于20世紀(jì)90年代，使用血液分析儀檢測淋巴細(xì)胞總數(shù)，同時(shí)使用流式細(xì)胞儀CD3/CD4或CD3/CD4/CD45抗體檢測CD4細(xì)胞所占淋巴細(xì)胞百分比，由此計(jì)算出細(xì)胞數(shù)。雙平臺法計(jì)算結(jié)果的影響因素較多，不同實(shí)驗(yàn)室差異較大且操作步驟復(fù)雜，結(jié)果穩(wěn)定性較低。單平臺法于1996年提出，可應(yīng)用流式細(xì)胞儀配以三色、四色流式試劑和內(nèi)參絕對計(jì)數(shù)微球，一步獲得T細(xì)胞亞群的相對數(shù)（百分比）和絕對數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性都能得到良好保證。我國學(xué)者通過研究確定了我國部分省及少數(shù)民族健康人T淋巴細(xì)胞參考值范圍［23］,并通過研究我國感染者的外周血T淋巴細(xì)胞14種表型正常參考值［24］，以及樣本存放溫度及時(shí)間對于外周血CD4細(xì)胞測定結(jié)果的影響［25］,為我國建立CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)平臺奠定了基礎(chǔ)。我國CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測一直使用進(jìn)口儀器配套進(jìn)口試劑，價(jià)格昂貴且實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行成本高，通過對臨床通用性CD4細(xì)胞檢測試劑進(jìn)行研制，國產(chǎn)CD4熒光單克隆抗體試劑于2014年獲得國家藥品監(jiān)督管理局注冊［26］。近年來CD4細(xì)胞的即時(shí)檢測設(shè)備也在不斷發(fā)展,目前國內(nèi)外已有多種基于微流控芯片或成像技術(shù)的CD4細(xì)胞即時(shí)檢測設(shè)備。我國藥品監(jiān)督管理局也批準(zhǔn)了多個(gè)CD4細(xì)胞即時(shí)檢測設(shè)備，檢測過程可在20分鐘內(nèi)完成，為HIV感染者提供yCD4細(xì)胞的現(xiàn)場檢測方式［27］,為基層艾滋病治療效果監(jiān)測提供了更多便捷可靠的技術(shù)手段。HIV-1基因型耐藥檢測HIV耐藥是指病毒因發(fā)生變異而對某種藥物敏感性降低。耐藥變異株的出現(xiàn)源于HIV的快速復(fù)制更新和HIV反轉(zhuǎn)錄酶的高錯(cuò)配率，導(dǎo)致高突變率和新病毒株不斷產(chǎn)生。在抗病毒藥物存在的情況下,耐藥毒株被藥物選擇成為優(yōu)勢株。H1V感染者的耐藥檢測對于抗病毒治療具有重要指導(dǎo)意義。HIV耐藥檢測方法可分為基因型檢測和表型檢測。HIV-1耐藥基因型檢測基于對耐藥相關(guān)基因突變的檢測，檢測病毒基因的pol區(qū)是否存在與抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物（如蛋白酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶抑制）易感性降低相關(guān)的突變,并利用耐藥基因型解釋系統(tǒng)判斷是否耐藥以及耐藥程度。目前我國HIV-1基因型耐藥檢測采用商品化試劑盒或?qū)嶒?yàn)室自建(In-house)方法。商品化耐藥檢測試劑盒檢測費(fèi)用高昂，難以在我國廣泛應(yīng)用，因此我國主要使用5-卜0我&方法。2010年國內(nèi)首個(gè)以h-標(biāo)我一方法為基礎(chǔ)的全國HIVT基因型耐藥檢測質(zhì)量保證參考標(biāo)準(zhǔn)的研究，推動(dòng)了國內(nèi)HIV-1基因型耐藥檢測的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化［28-29］。2015年我國自主研究制備的基因型耐藥能力驗(yàn)證質(zhì)控品保證了從耐藥樣本采集、保存到傳遞送樣的標(biāo)準(zhǔn)化和檢測結(jié)果準(zhǔn)確性［30］。近期有研究根據(jù)中國HIV-1主要流行株，在擴(kuò)增蛋白酶區(qū)和反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的基礎(chǔ)上，建立了擴(kuò)增整合酶區(qū)的基因型耐藥檢測方法［31］。近年發(fā)展的二代測序技術(shù)是一種快速、高通量的測序方法，能同時(shí)對多個(gè)樣本進(jìn)行全基因深度測序，也被廣泛應(yīng)用于HIV-1耐藥基因型檢測［32］。HIV-1耐藥表型檢測基于體外培養(yǎng)技術(shù)，通過檢測待檢樣本中病毒生長所需的藥物半抑制濃度或90%抑制濃度(IC50或IC90),與敏感參考株的IC50或式90進(jìn)行比較，得到耐藥倍數(shù)，進(jìn)而判斷待檢測樣本的耐藥程度。國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室基于假病毒pNL4-3Lac的表型耐藥性檢測方法結(jié)合ypSG3Aenv和PNL4-3檢測系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，能高通量評價(jià)HIV對藥物的耐受性，可用于感染者耐藥性分析和抗病毒藥物篩選［33］。4挑戰(zhàn)與展望我國已經(jīng)建立了數(shù)目龐大的艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)和較為完善的分級質(zhì)量保證體系，實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)能力不斷增強(qiáng)，國產(chǎn)檢測試劑與進(jìn)口試劑的差距逐漸縮小，為全國艾滋病治療工作提供了有力的技術(shù)保障。但檢測工作仍然面臨著新的挑戰(zhàn)，在實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)建設(shè)方面，艾滋病確證實(shí)驗(yàn)室布局不合理問題日益突出。目前全國70%~80%的確證實(shí)驗(yàn)室分布在疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，如何推動(dòng)醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展確證檢測，推動(dòng)核酸診斷策略的臨床應(yīng)用，是盡快廣泛實(shí)現(xiàn)艾滋病一站式診療服務(wù)面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一。此外，對于數(shù)量持續(xù)增長的各類艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室，如何進(jìn)行合理有效的分級管理和分級質(zhì)控，也是保證檢