染井吉野櫻組培育苗技術(shù)規(guī)程

染井吉野櫻組培育苗技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了良種染井吉野櫻（Prunus×yedoensis）組培育苗中的普通術(shù)語、組培育苗過程中外植體材料的選擇、消毒滅菌、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽、管護(hù)、運輸?shù)确椒凹夹g(shù)檔案管理。本標(biāo)準(zhǔn)適用于染井吉野櫻在全國范圍內(nèi)的工廠化組織培養(yǎng)育苗生產(chǎn)作業(yè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。GB/T14071-1993林木良種審定規(guī)范NY/T2306-2013花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程GB3095環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)LY/T2289林木種苗生產(chǎn)經(jīng)營管理檔案中華人民共和國國務(wù)院令第645號危險化學(xué)品安全管理辦法3普通術(shù)語下列術(shù)語適用于本文件。3.1植物組培planttissueculture將從植物體分離出的符合需要的組織、器官或細(xì)胞及原生質(zhì)體等材料，通過無菌操作接種在含有各種營養(yǎng)物質(zhì)及植物激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株的技術(shù)。3.2接種inoculation將消毒后的外植體或干凈培養(yǎng)材料在無菌條件下接入培養(yǎng)容器內(nèi)培養(yǎng)基中的過程。3.3消毒disinfection通過物理、化學(xué)方法去除物體表面大部分有害病原微生物（孢子除外）的過程。3.4滅菌sterilization通過物、化學(xué)及一些理化方法殺滅一切微生物（包括孢子等）的過程。3.5外植體explant從自然生長的活體植物上獲取的用于建立植物組培快繁體系的起始材料。3.6初代培養(yǎng)primaryculture指直接從機(jī)體取下的細(xì)胞、組織和器官等材料的培養(yǎng)。3.7繼代培養(yǎng)subculture將培養(yǎng)材料從老培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)的過程。3.8生根培養(yǎng)rootingculture將繼代增殖后的無根芽苗轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)上誘導(dǎo)生根培養(yǎng)得到完整的植株的過程。3.9組培工廠planttissuecultureproductionlaboratory利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)植物組培苗的工廠。3.10煉苗acclimatization

煉苗是在保護(hù)地育苗的情況下，采取放風(fēng)、降溫、適當(dāng)控水等措施對幼苗強(qiáng)行鍛煉的過程。4組培4.1外植體材料選擇從健壯母樹上截取半木質(zhì)化的單芽莖段或頂芽作為外植體材料。4.2消毒滅菌先用洗衣粉水浸泡20-30min，再輕輕清洗外植體表面將其表面的塵土和部分有害病原微生物去除，然后用流動的自來水沖洗2-4h后置于超凈工作XX；在鼓風(fēng)狀態(tài)下于超凈工作臺上先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)70-75%乙醇消毒8-15s后用無菌水清洗3-6次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%次氯酸鈉溶液消毒8-15min后用無菌水洗4-6次，最后用無菌紗布或無菌濾紙吸干外植體表面水珠后待用。所用消毒劑遵照GB3095執(zhí)行。4.3初代培養(yǎng)cm小段并接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+BA0.5-1.0mg/L+NAA0.02mg/L+TDZ2.0－3.0mg/L+蔗糖20－30gmg/L）中，先在22-25℃條件下全暗培養(yǎng)5-7d，然后置于每天光照10-12h，光照強(qiáng)度1500~2000lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，25d左右繼代一次，直至誘導(dǎo)形成叢生芽。4.4繼代培養(yǎng)mg/L）上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后置于每天光照10-12h，光照強(qiáng)度為2000lx，培養(yǎng)溫度22-25℃的條件下培養(yǎng)，多次反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到健壯叢生芽。4.5生根培養(yǎng)mg/L）中進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在22-25℃左右條件下暗培養(yǎng)0-5d，然后置于光照10-12h，光照強(qiáng)度2000lx，溫度為22-25℃左右的培養(yǎng)室中培養(yǎng)30-35d即可出瓶。5煉苗5.1生根苗移栽標(biāo)準(zhǔn)cm，基部長出3-5根不定根時，即可進(jìn)行煉苗。5.2煉苗方法將培養(yǎng)瓶放置在有散射光的溫室中，溫度控制在（25±5）℃，松蓋封口3-5d。6移栽6.1移栽時間為了提高成活率，建議生根瓶苗一般在春季和秋季煉苗移栽。6.2栽培基質(zhì)及準(zhǔn)備在保證組培穴盤苗正常生長的前提下，可因地制宜選擇基質(zhì)種類及配比，采用泥炭土：園土：珍珠巖＝5：3：2為最佳。將泥炭土、園土及珍珠巖按一定比例混配好，用800ppm多菌靈或百菌清噴透混勻，裝入穴盤中并稍壓緊待用。6.3洗苗輕輕取出組培苗，放入清水中，輕輕漂洗干凈組培苗表面培養(yǎng)基，并用500ppm多菌靈或百菌清溶液浸泡20-30min，最后沖洗一次。6.4移栽用小拇指粗細(xì)的樹枝將事先裝好的穴盤基質(zhì)搗個洞，之后將洗凈的組培苗塞入其中，并稍壓實。覆蓋基質(zhì)以剛蓋過組培苗基部為宜，以幼苗不倒即可。6.5擺放穴盤苗分移栽日期，在苗床上整齊擺放。7溫室苗期管理7.1栽后15d內(nèi)管理栽后15天內(nèi)要精心管護(hù)。溫度一般控制在15-30℃；每天至少分5次給幼苗噴霧保濕，保持葉面濕度在75-90%；遮蔭。7.215d后管理待15d緩苗期即長出新葉、新根后便可以進(jìn)入正常小苗期管理了，大棚相對濕度保持在60-80%即可。7.3施肥移栽4至8周內(nèi)，每隔7天可噴施高氮型葉面肥一次，稀釋濃度為500-800ppm。8周后視植株生長情況，調(diào)整施肥濃度及施肥次數(shù)。8質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)8.1組培苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)8.1.1株形苗粗壯、挺直有活力，葉片大小協(xié)調(diào)、有層次感、色澤正常，葉色具原品種特性。8.1.2根系有不定根長出（一般3條以上），根長適中，色白健壯，根基處基本無愈傷。8.1.3苗高組培苗高度適中，一般3cm-8cm。8.1.4葉片數(shù)展開的葉片具4片以上。8.1.5整齊度同一批次90%以上的苗高度一致。8.1.6病蟲害狀況無污染及病蟲害。8.2組培穴盤苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)8.2.1株形苗健壯、挺拔，株形飽滿、完整，葉片大小協(xié)調(diào)，葉色具母本特性、有XX。8.2.2根系應(yīng)具有完整而發(fā)達(dá)的根第，根系充滿穴盤孔，能夠易拔出而基質(zhì)不變。8.2.3苗高穴盤苗矮壯墩實，一般10～15cm。8.2.4整齊度同一批次95%以上的苗高度一致。8.2.5純度變異率低于5%。8.2.6病蟲害狀況穴盤苗無檢疫性病蟲害，無其他侵染性和非侵染性病害及蟲害的危害癥狀。9包裝、標(biāo)簽和運輸9.1包裝9.1.1組培苗產(chǎn)品應(yīng)按照客戶（或者訂單）要求包裝，同時保證組培苗成活率。9.1.2X脂苗包裝：X脂苗仍保留在培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶放在泡沫箱里，箱外再用紙箱包裝，高溫季節(jié)泡沫箱最好加冰袋。為防止上下倒置，運輸時可使用托盤。9.1.3無X脂苗包裝：生根組培苗洗去X脂后，先裝入小塑料盒（袋），再放在泡沫箱里，箱外再用紙箱包裝，高溫季節(jié)泡沫箱里放冰塊，運輸時可不用托盤。9.1.4穴盤苗包裝：穴盤裝在小紙箱內(nèi)，再將小紙箱裝入大紙箱內(nèi)，每箱裝3-4個穴盤，運輸時宜使用托盤。9.2標(biāo)簽每箱應(yīng)貼上標(biāo)簽，注明品種、等級、規(guī)格、數(shù)量、產(chǎn)地、出苗日期、目的地、聯(lián)系人、注意事項等。9.3運輸裝車時切勿倒置，用廂式貨車運輸以避免日曬、雨淋，運輸途中溫度保持10-25℃，應(yīng)在5d內(nèi)到達(dá)目的地。10檔案管理執(zhí)行林木種苗生產(chǎn)技術(shù)經(jīng)營管理檔案（LY/T2289）。

附錄A（資料性附錄）表A組培工廠設(shè)計、所需面積及設(shè)計要求組培工廠功能區(qū)面積，m2設(shè)計要求/說明年產(chǎn)50萬株年產(chǎn)100萬株年產(chǎn)200萬株組培車間200370700需配置自動檢測和噴淋的消防系統(tǒng)洗滌間152040通風(fēng)、干燥;室內(nèi)要有上、下水設(shè)施；地面防潮、防滑并便于清洗；內(nèi)做大小水槽若干培養(yǎng)瓶晾干室52040通風(fēng)、干燥，整潔，內(nèi)置空調(diào)和通風(fēng)裝置試劑室（稱量室）202020清潔、干燥、通風(fēng);終年保持相對較低溫度;避免陽光直射；放置天平的臺面要水平、穩(wěn)固培養(yǎng)基配制室152040通風(fēng)、干燥;配備大容量用電器專用線路;上下水道通暢培養(yǎng)基滅菌室52020地面與墻面必須能夠耐受高濕狀態(tài);地面防滑，白瓷磚墻面;配備大容量用電器專用線路培養(yǎng)基儲存室102040低溫、干燥、整潔;避免光照；配置空調(diào)，通風(fēng)裝置、紫外燈等更衣室101020通風(fēng)、干燥、整潔;緊連接種室;配置衣櫥、鞋柜、洗手盆等接種室（無菌操作室）2050100控溫（25±2）°C；控濕（相對濕度70%?75%）；整潔、通風(fēng)、光線好；內(nèi)墻白色光滑;配置空調(diào)、超凈工作臺、紫外燈、移動臭氧發(fā)生器等培養(yǎng)室60150300控溫（25±2）°C;控濕（相對濕度70%?75%）；干凈、整潔；內(nèi)墻白色光滑;配制空調(diào)、通風(fēng)裝置、日光燈、培養(yǎng)架、獨立控制紫外燈、自動定時設(shè)備等;設(shè)計時應(yīng)考慮用電負(fù)荷，設(shè)置專線和配電設(shè)備出苗室202040控溫、通風(fēng)、光線好;內(nèi)墻白色光滑;上下水道暢通貯存室202040通風(fēng)、干燥;存儲組培用的洗滌用品、放蒸倦水、酒精等物品母本圃50100100控溫、控濕、控光、防蟲、能釆用自然光組培苗馴化區(qū)5050100控溫、控濕、可調(diào)控光裝置、防蟲組培苗移栽圃60012502700控溫、控濕、控光、防蟲、能釆用自然光輔助用房50100100包括控制間、物料間、包裝間等辦公室204080配置辦公桌（椅）、電話、傳真電話機(jī)、電腦、打印機(jī)、復(fù)印機(jī)、文件柜等辦公設(shè)備其他生活空間204060包括休息室、洗手間等;休息室可加裝飲水機(jī)、冰箱、微波爐、桌椅等

附錄B（資料性附錄）表B組培工廠所需主要設(shè)備及說明儀器設(shè)備名稱年生產(chǎn)規(guī)模，萬株規(guī)格型號用途說明50100200滅菌設(shè)備、器械立式高壓滅菌鍋（臺）11150L，3.5kW；不銹鋼內(nèi)壁；自動控溫、控壓、定時；自動斷電；最高工作壓力0.165MPa；最高工作溫度126°C培養(yǎng)基滅菌臥式高壓蒸汽滅菌鍋（臺）012360L，不銹鋼內(nèi)壁，電加熱;單門或雙門，自動控溫培養(yǎng)基滅菌電熱干燥箱（臺）111最高溫度300°C;溫度變化幅度±2°C玻璃器皿滅菌、干燥紫外燈（盞）若干若干若干30W/40W；接口類型與日光燈同房間消毒臭氧機(jī)（臺）122220V，50Hz；160W?180W亍滅菌時間可調(diào)；可移動房間消毒過濾滅菌器（只）若干若干若干過濾器濾膜孔徑0.22 無菌封裝；20mL塑料注射器及配套針頭，無菌封裝滅菌不能高溫滅菌的試劑接種設(shè)備及器械超凈工作臺（臺）4816雙人或單人;水平或垂直送風(fēng)；百級潔凈度；接種，過濾滅菌等電熱滅菌器（臺）4816電加熱；溫度可調(diào)、可控，數(shù)字顯示；最高溫度350°C；溫度變化幅度±10°C接種器械滅菌石英玻璃珠若干若干若干2mm?2.5mm電熱滅菌器導(dǎo)熱、保溫槍狀鑷（把）16326425cm，不銹鋼材質(zhì)接種用3#手術(shù)刀柄（把）12244812cm，不銹鋼材質(zhì)接種用10#手術(shù)刀片（包）若干若干若干圓頭不銹鋼刀片；10片/包接種用11#手術(shù)刀片（包）若干若干若干尖頭不銹鋼刀片；10片/包接種用手術(shù)剪（把）81632直剪；20cm不銹鋼材質(zhì)接種用接種器械擱置架（只）4816不銹鋼材質(zhì)擱置、冷卻熱的、已滅菌的接種器械接種盤（個）若干若干若干不銹鋼材質(zhì)盛裝，切割植物材料培養(yǎng)設(shè)備和容器光照培養(yǎng)箱（個）122溫度5°C?50°C可調(diào)組培試驗用組培用托盤（個）100020004000420minX490mmX4.5mm，可高溫滅菌，鏤空放置培養(yǎng)瓶空調(diào)（臺）510201.5P-2.0P，壁掛式培養(yǎng)室溫度控制培養(yǎng)架（組）60120240噴塑角135mm*50mm*1800mm，5層，層高300mm，每層2支36W熒光燈管放置培養(yǎng)瓶，植物培養(yǎng)晾瓶架（組）248噴塑角鋼，135mmX50mmX1800mm，5層洗凈培養(yǎng)瓶晾干培養(yǎng)瓶，萬只3.5714250mL，內(nèi)徑6cm，高度9cm；耐高溫玻璃或透光塑料材質(zhì)，配套耐高溫透光塑料蓋組培用瓶

附錄C（資料性附錄）表C組培工廠所需玻璃器皿、器材及說明儀器設(shè)備名稱年生產(chǎn)規(guī)模，萬株規(guī)格用途說明50100200燒杯，套23350mL/100mL/250mL/500mL/1000mL/2000mL配母液、培養(yǎng)基用廣口試劑瓶，套41010125mL/250mL/500mL/1000mL/2000mL存儲母液用量筒，套22225mL/50mL/100mL/250mL/500mL/1000mL配培養(yǎng)基用容量瓶，套222100mL/250mL/500mL/1000mL/2000mL配母液用玻璃棒，根10202030cm配母液、培養(yǎng)基用棕色滴瓶，只222125mL配培養(yǎng)基用塑料洗瓶，只222500mL配母液、培養(yǎng)基用搪瓷杯，只5551000mL ，配培養(yǎng)基用鋁盤，個255280mmX390mm配培養(yǎng)基用搪瓷盤，個255280mmX390mm配培養(yǎng)基用電飯煲，只11113L或以上配培養(yǎng)基用電水壺，只1115L或以上配培養(yǎng)基用塑料筐，個2510540mmX440mmX72mm組培室生產(chǎn)周轉(zhuǎn)稱量紙，包若干若干若干75mmX75mm；500張/包配母躍培養(yǎng)基用稱量紙，包若干若干若干100mmX100mm；500張/包配母液及培養(yǎng)基用稱量紙，包若干若干若干150mmX150mm；500張/包配母祕培養(yǎng)基用pH試紙，本若干若干若干pH5.4?7.0配培養(yǎng)基用定性濾紙，盒若干若干若干90mm，中速，100張/包外植體接種用試管刷，支若干若干若干各式規(guī)格洗瓶用塑料大盆，只244洗瓶用三防袖套，副若干若干若干防水、防靜電、防菌洗瓶用乳膠手套，副若干若干若干洗瓶用棉布，米若干若干若干包接種盤用工作服，件81632大號/中號/小號接種用接種三防工作服，件81632防水、防靜電、防菌;分體式，全套三件接種用實驗帽，頂81632接種用一次性手套，副若干若干若干PE塑料薄膜手套接種用一次性口罩，只若干若干若干接種用一次性鞋套，副若干若干若干臨時人員出入用脫脂紗布，包若干若干若干醫(yī)用敷料級接種人員用醫(yī)用脫脂棉，包若干若干若干接種人員用涼拖鞋，雙61220各種尺碼接種人員用棉拖鞋，雙61220各種尺碼接種人員用垃圾箱，只101525接種人員用垃圾袋，捆若干若干若干接種人員用

表C組培工廠所需玻璃器皿、器材及說明（續(xù)）儀器設(shè)備名稱年生產(chǎn)規(guī)模，萬株規(guī)格用途說明50100200垃圾袋，捆若干若干若干接種人員用記錄本，本若干若干若干記錄用中性筆，支若干若干若干記錄用打碼機(jī)，只61018編碼打碼用標(biāo)簽紙，卷若干若干若干編碼打碼用定時器，只若干若干若干記錄時間

附錄D（資料性附錄）表D.植物組培常用化學(xué)試劑、藥品藥品中文名稱分子式分子量級別保存方法無機(jī)鹽類——大量元素硝酸銨NH4NO380.05AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好硝酸鉀KNO3101.11AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好二水合氯化鈣CaCl2?2H2O147.02AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好無水氯化鈣CaCl2111.02AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好七水合硫酸鎂MgSO4?7H2O246.47AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好磷酸二氫鉀kh2po4136.09AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好硫酸銨（nh4）2so4132.13AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好一水合磷酸二氫鈉NaH2PO4?H2O138.00AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好磷酸二氫鈉NaH2PO4120.05AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好四水合硝酸鈣Ca（NO3）2?4H2O236.15AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好七水合硝酸鈣Ca（NO3）2?7H2O290.20AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好氯化鉀KC174.55AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好硫酸鈉Na2SO4142.04AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好無機(jī)鹽類——微量元素四水合硫酸錳MnSO4?4H2O223.01AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好一水合硫酸錳MnSO4?H2O169.02AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好七水合硫酸鋅ZnSO4?7H2O287.55AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好硼酸H3BO361.83AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好碘化鉀KI166.01AR室溫、干燥、避光、通風(fēng)良好二水合鑰酸鈉Na2MoO4?2H2O241.95AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好五水合硫酸銅CuSO4-5H2O249.68AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好六水合氯化鉆CoC12-6H2O237.93AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好表D（續(xù)）藥品中文名稱分子式分子量級別保存方法無機(jī)鹽類——鐵鹽七水合硫酸亞鐵FeSO4-7H2O278.03AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好硫酸鐵Fe2（SO4）3399.88AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好乙二胺四乙酸二鈉C10H14N2O8Na2?2H2O372.25AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好有機(jī)物甘氨酸75.07BR99.5%室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好鹽酸硫氨素337.27BR99.6%室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好鹽酸吡哆醇205.64BR99.7%室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好煙酸123.11BR99.8%室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好肌醇180.16BR99.9%室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好水解酪蛋白BR冷藏（4°C），避光水解乳蛋白BR冷藏（4°C），避光蔗糖342.30AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好葡萄糖180.00AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好X脂凝結(jié)強(qiáng)度1200g?cm2?1300g?cm2室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好植物生長調(diào)節(jié)劑6-苯基嘌呤225.25BR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好6-糖氨基嘌呤215.21BR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好玉米素219.24BR99%冷凍（-20°C），避光噻苯隆220.32BR99%冷藏（4°C），避光6-異戊烯基腺嘌呤203.24BR冷藏（4°C），避光a-苯乙酸186.21BR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好吲哚乙酸175.19BR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好

表D（續(xù)）藥品中文名稱分子式分子量級別保存方法吲哚丁酸203.23BR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好2，4-二氯苯氧乙酸221.04BR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好腺嘌呤135.13BR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好赤霉素346.38BR冷藏（4°C），避光乙烯利144.50BR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好脫落酸264.32BR冷凍-20°C），避光消毒劑甲醛30.03AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好高錠酸鉀158.03AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好乙醇46.07CP95%室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好新潔爾滅溶液384.445%室溫、干燥、避光、通風(fēng)良好次氯酸鈉溶液74.44AR5.2%室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好氯化汞271.5AR室溫、干燥、避光、通風(fēng)良好吐溫-20CP冷藏（4°C），避光洗滌劑洗衣粉中性室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好洗潔精中性室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好其他活性炭12AR粉室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好鹽酸HC136.46AR低溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好氫氧化鈉NaOH40.01AR室溫、干燥、避直射光、通風(fēng)良好

附錄E（資料性附錄）組培快繁規(guī)模化生產(chǎn)

附錄F（資料性附錄）

表FMS基本培養(yǎng)基母液配制母液種類試劑名稱標(biāo)準(zhǔn)重量，mg/L擴(kuò)大倍數(shù)稱取重量，mg/L保存方式大量元素硝酸鉀19002038000冷藏（4°C）避光保存硝酸銨165033000磷酸二氫鉀17034