基因工程的基本操作程序（第1課時(shí)）課件【 知識(shí)精講+ 能力提升 】 高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

人教版·選擇性必修3第三章基因工程

基因工程的基本操作程序第2節(jié)

PCR擴(kuò)增儀2.基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些目錄

/CONTENTS1.基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟轉(zhuǎn)基因抗蟲棉非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉轉(zhuǎn)基因抗蟲棉非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉轉(zhuǎn)基因抗蟲棉非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉資料：1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)，破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲(P76)1.Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理？2.抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會(huì)不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害？P77[相關(guān)信息]你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？

當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生上述影響

從社會(huì)中來3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.目的基因的

檢測(cè)與鑒定基因工程的基本操作程序

從社會(huì)中來基因工程的基本操作程序?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因的檢測(cè)與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)（核心）

從課本中來

一第一步：目的基因的篩選與獲取注意：

所有的基因都編碼蛋白質(zhì)或肽鏈。基因的種類一般分為結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄基因和調(diào)控基因。結(jié)構(gòu)基因的功能：具有轉(zhuǎn)錄和翻譯功能，能控制生物性狀（編碼蛋白質(zhì)或肽鏈）。轉(zhuǎn)錄基因的功能：只有轉(zhuǎn)錄功能，沒有翻譯功能。能轉(zhuǎn)錄形成tRNA和rRNA調(diào)控基因的功能：不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，只能調(diào)控其他基因的表達(dá)。拓展：基因類型目的基因的篩選與獲取一不是(1)概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變

性狀或獲得

等的基因。(2)實(shí)例：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。主要指的是編碼

的基因。1、目的基因資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。科學(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因那么，如何篩選目的基因呢？目的基因的篩選與獲取一受體細(xì)胞預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)課本P76用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害也對(duì)Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)不僅掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因(1).較為有效的方法之一：從相關(guān)的

和

的基因中進(jìn)行篩選2、篩選合適的目的基因目的基因的篩選與獲取一已知結(jié)構(gòu)功能清晰二、篩選合適的目的基因目的基因的篩選與獲取一(2)認(rèn)識(shí)基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法課本P77

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)、序列比對(duì)工具(如BLAST)、公共生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)、分析分子及基因組數(shù)據(jù)的軟件工具NCBI等的應(yīng)用，

越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能。2、篩選合適的目的基因目的基因的篩選與獲取一課本P77DNA測(cè)序序列數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank）序列比對(duì)工具（如BLAST）一第一步：目的基因的篩選與獲取序列數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank）

序列數(shù)據(jù)庫(kù)是分子生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中最基本的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括核酸和蛋白質(zhì)兩類，以核苷酸堿基順序或氨基酸殘基順序?yàn)榛緝?nèi)容，并附有注釋信息。2、篩選合適的目的基因目的基因的篩選與獲取一一第一步：目的基因的篩選與獲取序列比對(duì)工具（如BLAST）BLAST全稱BasicLocalAlignmentSearchTool，即“基于局部比對(duì)算法的搜索工具”，是生物信息學(xué)常用的工具軟件，可將輸入的核酸或蛋白質(zhì)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，獲得序列相似度等信息，從而判斷序列的來源或進(jìn)化關(guān)系。二、篩選合適的目的基因目的基因的篩選與獲取一mRNA基因的一條鏈科學(xué)家分離得到某原核生物基因，并將其解離成兩條單鏈現(xiàn)讓其中一條鏈與由該基因轉(zhuǎn)錄而來的mRNA雜交配對(duì)，結(jié)果如圖所示(1)原核生物基因基因的編碼區(qū)基因的非編碼區(qū)基因的非編碼區(qū)基因的一條鏈成熟mRNA基因的編碼區(qū)基因的非編碼區(qū)基因的非編碼區(qū)(2)真核生物基因科學(xué)家分離得到某真核生物基因，并將其解離成兩條單鏈現(xiàn)讓其中一條鏈與由該基因轉(zhuǎn)錄而來的mRNA雜交配對(duì)，結(jié)果如圖所示目的基因的篩選與獲取一資料2：基因結(jié)構(gòu)CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---某原核細(xì)胞基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)不編碼mRNA不編碼mRNA(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子啟動(dòng)子：給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列RNA聚合酶目的基因的篩選與獲取一基因結(jié)構(gòu)是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列終止子：--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列終止子：給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉(zhuǎn)錄mRNA某原核細(xì)胞基因目的基因的篩選與獲取一基因結(jié)構(gòu)--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白質(zhì)某原核細(xì)胞基因？如果該基因?yàn)檎婧思?xì)胞基因有什么不同？目的基因的篩選與獲取一基因結(jié)構(gòu)CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---某真核細(xì)胞基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)不編碼mRNA不編碼mRNA(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子RNA聚合酶外顯子內(nèi)含子外顯子內(nèi)含子外顯子目的基因的篩選與獲取一基因結(jié)構(gòu)--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉(zhuǎn)錄初始mRNA某真核細(xì)胞基因外顯子內(nèi)含子外顯子內(nèi)含子外顯子目的基因的篩選與獲取一基因結(jié)構(gòu)--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉(zhuǎn)錄某真核細(xì)胞基因外顯子內(nèi)含子外顯子內(nèi)含子外顯子RNA加工CA……UAGGAUCCAGAUG翻譯蛋白質(zhì)初始mRNA成熟mRNA目的基因的篩選與獲取一基因結(jié)構(gòu)--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)（可轉(zhuǎn)錄）啟動(dòng)子終止子某真核細(xì)胞基因外顯子內(nèi)含子外顯子內(nèi)含子外顯子1.外顯子和內(nèi)含子均會(huì)被

，再經(jīng)過切去

對(duì)應(yīng)部位、連接

對(duì)應(yīng)部位等RNA加工過程，形成可以直接用于翻譯的mRNA目的基因的篩選與獲取一基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄成RNA內(nèi)含子外顯子2.外顯子：3.內(nèi)含子：編碼蛋白質(zhì)的序列稱為外顯子外顯子之間不能編碼蛋白質(zhì)的序列.基因1基因2基因3基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段DNA片段內(nèi)含子外顯子非編碼區(qū)編碼區(qū)啟動(dòng)子終止子真核生物基因放大啟動(dòng)子終止子原核生物基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)目的基因的篩選與獲取一知識(shí)歸納：基因結(jié)構(gòu)知識(shí)歸納：基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)：非編碼區(qū)：原核基因真核基因編碼區(qū)非編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列不編碼蛋白質(zhì)，含有能調(diào)控遺傳信息表達(dá)的DNA序列

(如啟動(dòng)子、終止子等）外顯子：內(nèi)含子：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，然后在翻譯前就被剪切掉能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼出蛋白質(zhì)的DNA序列不編碼蛋白質(zhì)，含有能調(diào)控遺傳信息表達(dá)的DNA序列(如啟動(dòng)子、終止子等）目的基因的篩選與獲取一內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子不間隔的、連續(xù)的非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)啟動(dòng)子終止子(2)真核生物基因(1)原核生物基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄前體mRNA成熟mRNA剪切、拼接間隔的、不連續(xù)的123412341234終止轉(zhuǎn)錄真核生物的基因：起始密碼子和終止密碼子？不能編碼蛋白質(zhì)的序列=非編碼區(qū)+內(nèi)含子能編碼蛋白質(zhì)的序列=外顯子RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA啟動(dòng)子終止子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位于基因上游也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位于基因下游終止轉(zhuǎn)錄本質(zhì)：位置：作用：本質(zhì)：位置：作用：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，外顯子:內(nèi)含子:進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列知識(shí)歸納：基因結(jié)構(gòu)目的基因的篩選與獲取一【總結(jié)】原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較不能編碼蛋白質(zhì)的序列=非編碼區(qū)原核生物的基因：不能編碼蛋白質(zhì)的序列真核生物的基因：=非編碼區(qū)+內(nèi)含子原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的________和具有調(diào)控作用的________區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼知識(shí)歸納：基因結(jié)構(gòu)目的基因的篩選與獲取一1.下列有關(guān)基因結(jié)構(gòu)的敘述，正確的是（

）A.真核細(xì)胞的基因中，編碼區(qū)也含有不能編碼蛋白質(zhì)的堿基序列，叫外顯子B.原核細(xì)胞的基因中，編碼區(qū)的外顯子是連續(xù)的C.無論是真核還是原核生物，能編碼蛋白質(zhì)合成的序列均位于編碼區(qū)D.終止密碼子是轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)，阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)C真核生物的基因結(jié)構(gòu):包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)

(編碼區(qū)又分為內(nèi)含子和外顯子，內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄后被剪切掉)原核生物的基因結(jié)構(gòu):包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)

(編碼區(qū)無內(nèi)含子和外顯子之分，是連續(xù)的)終止密碼子位于mRNA上，作用是終止翻譯的過程，而RNA聚合酶則是用于轉(zhuǎn)錄的酶當(dāng)堂檢測(cè)2、篩選合適的目的基因目的基因的篩選與獲取一(2)認(rèn)識(shí)基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法課本P77

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)、序列比對(duì)工具(如BLAST)、公共生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)、分析分子及基因組數(shù)據(jù)的軟件工具NCBI等的應(yīng)用，

越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能。明確了目的基因后，該怎么獲得它呢？一第一步：目的基因的篩選與獲取人工合成從基因文庫(kù)中獲取利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因目的基因的篩選與獲取一3.獲取目的基因的方法

先對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增獲得目的基因后是否就該立即開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)基因操作？

抗蟲基因快速獲得大量抗蟲基因蘇云金桿菌提取目的基因的篩選與獲取一思考:課本P77(1)人工合成目的基因DNA合成儀①前提：②方法：3獲取目的基因的方法目的基因的篩選與獲取一基因比較

、核苷酸序列

。小已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因【思考】若不明確基因堿基序列呢？蛋白質(zhì)氨基酸序列mRNA序列基因序列

反轉(zhuǎn)錄法(1)人工合成目的基因目的基因的篩選與獲取一DNA合成儀(1)人工合成目的基因目的基因的篩選與獲取一(2)從基因文庫(kù)中直接獲取將含有某種生物不同基因的許多

片段，導(dǎo)入

的群體中

，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的

，稱為基因文庫(kù)(主要指cDNA文庫(kù))基因文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)3獲取目的基因的方法目的基因的篩選與獲取一DNA儲(chǔ)存不同基因受體菌一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取某種生物體內(nèi)的

DNA適當(dāng)?shù)牟煌拗泼盖懈钆c質(zhì)粒連接目的基因的篩選與獲取一①基因組文庫(kù)全部一第一步：目的基因的篩選與獲取某種生物體內(nèi)的全部DNA適當(dāng)?shù)牟煌拗泼盖懈钆c質(zhì)粒連接受體菌導(dǎo)入受體菌——獲取目的基因的篩選與獲取一①基因組文庫(kù)一第一步：目的基因的篩選與獲取受體菌導(dǎo)入受體菌每個(gè)受體菌都含有了一段不同的

。這個(gè)群體包含了這種生物的所有基因，叫做這種生物的基因組文庫(kù)。該受體菌群為基因組文庫(kù)——獲取目的基因的篩選與獲取一某種生物體內(nèi)的全部DNA適當(dāng)?shù)牟煌拗泼盖懈钆c質(zhì)粒連接DNA片段①基因組文庫(kù)一第一步：目的基因的篩選與獲?、赾DNA文庫(kù)

如果用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA

產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA(也叫cDNA)片段，與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，那么，這個(gè)受體菌群體就叫做這種生物的

。某種生物體內(nèi)的全部DNA某個(gè)時(shí)期基因選擇性表達(dá)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯翻譯翻譯翻譯蛋白質(zhì)——獲取目的基因的篩選與獲取一反轉(zhuǎn)錄cDNA文庫(kù)包含某種生物

基因部分cDNA文庫(kù)如果用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA(也叫cDNA)片段，與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，那么，這個(gè)受體菌群體就叫做這種生物的cDNA文庫(kù)。目的基因的篩選與獲取一基因結(jié)構(gòu)--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白質(zhì)某原核細(xì)胞基因目的基因的篩選與獲取一基因結(jié)構(gòu)--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白質(zhì)某原核細(xì)胞基因反轉(zhuǎn)錄GT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTACCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……GT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……cDNA復(fù)制雙鏈DNA受體菌無啟動(dòng)子、終止子等非編碼區(qū)目的基因的篩選與獲取一基因結(jié)構(gòu)--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉(zhuǎn)錄某真核細(xì)胞基因外顯子內(nèi)含子外顯子內(nèi)含子外顯子RNA加工CA……UAGGAUCCAGAUG翻譯蛋白質(zhì)初始mRNA成熟mRNA目的基因的篩選與獲取一基因結(jié)構(gòu)--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)(編碼mRNA)啟動(dòng)子終止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG轉(zhuǎn)錄某真核細(xì)胞基因外顯子內(nèi)含子外顯子內(nèi)含子外顯子RNA加工CA……UAGGAUCCAGAUG翻譯蛋白質(zhì)初始mRNA成熟mRNA反轉(zhuǎn)錄GT……ATCCTAGGTCTACGT……ATCCTAGGTCTACCA……TAGGATCCAGATG復(fù)制受體菌無啟動(dòng)子、終止子等非編碼區(qū)及無內(nèi)含子基因結(jié)構(gòu)部分基因文庫(kù)和基因組文庫(kù)的比較文庫(kù)類型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子(非編碼區(qū))基因中內(nèi)含子基因多少小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因

使用cDNA文庫(kù)獲得目的基因更加高效，除去了不能編碼蛋白質(zhì)的序列(如非編碼區(qū)、內(nèi)含子)目的基因的篩選與獲取一(2)從基因文庫(kù)中直接獲取3獲取目的基因的方法一第一步：目的基因的篩選與獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(kù)。（了解）基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)某種生物體內(nèi)的全部DNA適當(dāng)?shù)牟煌拗泼盖懈钆c質(zhì)粒連接受體菌導(dǎo)入受體菌怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因呢？目的基因的篩選與獲取一(2)從基因文庫(kù)中直接獲取3獲取目的基因的方法一第一步：目的基因的篩選與獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(kù)。（了解）基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)某種生物體內(nèi)的全部DNA適當(dāng)?shù)牟煌拗泼盖懈钆c質(zhì)粒連接受體菌導(dǎo)入受體菌怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因呢？

這還是一件比較復(fù)雜的事情，簡(jiǎn)單地說就是根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，例如根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA以及基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。目的基因的篩選與獲取一(2)從基因文庫(kù)中直接獲取3獲取目的基因的方法★(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因

PCR由穆里斯等人（先入為主）于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

如果說，沃森和克里克發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，標(biāo)志著分子生物學(xué)時(shí)代的開啟，那么PCR技術(shù)則標(biāo)志著分子生物學(xué)的騰飛。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，徹底變革了生物化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)等。

目的基因的篩選與獲取一3獲取目的基因的方法穆里斯合作探究：請(qǐng)同學(xué)們自主閱讀教材P76-77，小組合作思考討論完成問題。

1.總結(jié)出PCR的概念、原理、目的、優(yōu)點(diǎn)。2.結(jié)合體內(nèi)DNA復(fù)制過程，思考PCR的進(jìn)行需要哪些條件？所需設(shè)備是什么？3.構(gòu)建出PCR的大致過程。4.PCR擴(kuò)增為什么需要引物？5.如何對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？6.PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程比較？目的基因的篩選與獲取一3獲取目的基因的方法PCR技術(shù)：PCR是_______________的縮寫，是一項(xiàng)根據(jù)________________的原理，在_____提供參與DNA復(fù)制的_________與_________，對(duì)______________________進(jìn)行_________的技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外各種組分反應(yīng)條件目的基因的核苷酸序列大量復(fù)制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制原理操作環(huán)境目的全稱PCR擴(kuò)增儀目的基因的篩選與獲取一3獲取目的基因的方法★(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因【重溫】DNA體內(nèi)復(fù)制的過程及條件合成子鏈解旋形成新DNA參與的組分在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈4種脫氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶引物提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸目的基因的篩選與獲取一3′5′DNA的合成方向：DNA聚合酶3′5′模板鏈子鏈因?yàn)镈NA聚合酶不能直接將單個(gè)的核苷酸聚合成鏈原因：DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有鏈的3′-端子鏈合成需要引物：從子鏈的5′端向3′端延伸【重溫】DNA體內(nèi)復(fù)制的過程及條件目的基因的篩選與獲取一引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2引物:3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2引物可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈·細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制通常以RNA單鏈為引物·細(xì)胞外（PCR）一般以DNA單鏈為引物用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20~30個(gè)核苷酸引物結(jié)合在模板鏈的3’端目的基因的篩選與獲取一參與的組分在DNA復(fù)制中的作用打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸緩沖液（含Mg2+）DNA母鏈4種脫氧核苷酸90℃以上高溫耐高溫的DNA聚合酶引物激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶（2種）不同的溫度：變性、復(fù)性和延伸需要不同溫度（Taq酶）4.PCR技術(shù)課本P77-79(1)DNA體外復(fù)制（PCR）的條件目的基因的篩選與獲取一微量離心管緩沖液PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行。真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要

激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2+。DNA模板四種脫氧核苷酸(dNTP)引物分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）目的基因的篩選與獲取一Mg2+微量離心管緩沖液離心處理后目的基因的篩選與獲取一緩沖液目的基因的篩選與獲取一(2)PCR反應(yīng)過程3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性當(dāng)溫度上升到

以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為

。

B.復(fù)性當(dāng)溫度下降到

左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合C.延伸當(dāng)溫度上升到

左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的

的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’4.PCR技術(shù)目的基因的篩選與獲取一90℃單鏈50℃72℃DNA聚合酶第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的

，經(jīng)過

和

三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪循環(huán)的產(chǎn)物完成以后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物4.PCR技術(shù)目的基因的篩選與獲取一(2)PCR反應(yīng)過程模板變性、復(fù)性延伸一——獲取a、變性（超過90℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成

。

b、復(fù)性（下降到50℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板通過堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成局部

。c、延伸（上升到72℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，溶液中的的

在

的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，合成與模板互補(bǔ)的

的新的DNA鏈。氫鍵單鏈DNA雙鏈4種脫氧核苷酸5′端→3′端耐高溫的DNA聚合酶過程歸納：4.PCR技術(shù)目的基因的篩選與獲取一(2)PCR反應(yīng)過程P77-79

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在第幾次循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段(即出現(xiàn)完整的目的基因)？第三次循環(huán)目的基因的篩選與獲取一3獲取目的基因的方法★(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因合作探究1:3’5’目的基因目的基因第一次循環(huán)90℃以上，DNA雙鏈解開50℃左右，引物與DNA結(jié)合72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’目的基因的篩選與獲取一第二次循環(huán)5’3’5’5’3’5’高溫變性、低溫復(fù)性目的基因的篩選與獲取一中溫延伸第二次循環(huán)3’5’高溫變性、低溫復(fù)性目的基因的篩選與獲取一第三次循環(huán)3’5’中溫延伸目的基因的篩選與獲取一第三次循環(huán)3’5’目的基因目的基因目的基因的篩選與獲取一第一輪循環(huán)第二輪循環(huán)第三輪循環(huán)3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’非目的基因序列目的基因序列引物★(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因P77-79復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)

含引物的DNA分子數(shù)

DNA鏈數(shù)目共消耗引物的個(gè)數(shù)

含脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)

22204460881422n2n2n+1-22n-2n呈指數(shù)形式擴(kuò)增（n次擴(kuò)增循環(huán)后，DNA數(shù)量約為2n）PCR結(jié)果：48162n+1目的基因的篩選與獲取一★(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因以_______方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）

指數(shù)2n可采用

來鑒定PCR的產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)的結(jié)果：目標(biāo)DNA為：2n-2n產(chǎn)物鑒定：一第一步：目的基因的篩選與獲取——獲取4.PCR技術(shù)目的基因的篩選與獲取一(2)PCR反應(yīng)過程設(shè)計(jì)引物的要求：①引物自身

有互補(bǔ)序列②引物之間

有互補(bǔ)序列③引物長(zhǎng)度要

。④引物能與目的基因兩側(cè)特異性

?！乐挂镒陨砘パa(bǔ)折疊防止兩引物之間配對(duì)，導(dǎo)致引物不能各自同模板鏈結(jié)合【拓展】設(shè)計(jì)引物的注意事項(xiàng)3獲取目的基因的方法★(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因目的基因的篩選與獲取一不能不能適宜結(jié)合設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請(qǐng)分別說明理由。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效引物Ⅰ′自身內(nèi)部部分堿基發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)而失效思考討論目的基因的篩選與獲取一思考：用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將