高等植物遺傳轉化系統(tǒng)

高等植物遺傳轉化系統(tǒng)第一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二高等植物遺傳轉化系統(tǒng)農(nóng)桿菌介導轉化方法直接轉化（理化法）病毒感染第二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/82

病毒載體介導的植物遺傳轉化植物病毒可以感染植物寄主細胞，并進行復制和表達植物外源DNA。利用植物病毒的特性有希望發(fā)展成為一種有價值的植物遺傳轉化體系。優(yōu)點：部分植物病毒對寄主的感染是系統(tǒng)性的，可擴散到寄主所有細胞，故無需組培再生；可對單子葉植物進行高效浸染；病毒感染的植物能夠繁殖大量病毒顆粒，有望大量生產(chǎn)外源蛋白。第三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/83缺點：目前對植物病毒分子生物學研究十分初淺，還不能建立有效遺傳轉化體系。迄今為止，植物病毒載體尚未發(fā)展到可以廣泛使用的階段。第四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/84重組雙子座病毒載體系統(tǒng)感染植物示意圖DNABDNAA細胞間傳遞外殼蛋白基因及復制NPTIILBRB外殼蛋白基因DNAA-NPTII雙元表達載體農(nóng)桿菌注射葉片組織產(chǎn)生kan抗性三周后第五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/85高等植物細胞直接轉化法基因槍轉化法電擊法生殖細胞原位轉化法（花粉管通道法）顯微注射法激光微束穿刺法PEG介導法（化學共培法）第六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/86一基因槍轉化法

又稱微彈射擊法、粒子轟擊法、高速粒子噴射技術、彈道微靶點射擊，將載有外源DNA的金屬（鎢或金）經(jīng)驅動后通過真空小室進入靶組織的一種遺傳轉化技術。采用的基因槍分為火藥引爆、高壓放電、壓縮氣體等。1987年美國康奈爾大學的Sanford首次用于植物遺傳轉化?？捎檬荏w范圍廣泛，單、雙子葉植物均可，許多單子葉植物遺傳轉化的主要方法。基因槍價格昂貴，轉化成本較高，轟擊過程對細胞損害較大，轉化效率有待進一步提高。第七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/87二電擊法

又稱電擊穿孔法，80年代發(fā)展起來的遺傳轉化技術，利用高壓放電產(chǎn)生的脈沖使細胞膜產(chǎn)生可逆的“微孔”，從而使外源DNA等進入細胞。最早應用于原生質體，近來有直接轉化帶壁植物細胞核組織的報道。

國際公認的一種成熟可靠轉化法，對受體無限制，可用于胚性愈傷組織、懸浮細胞、分生組織、器官等。但需對轉化參數(shù)進一步優(yōu)化，轉化效率低。第八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/88三生殖細胞原位轉化法

植物生殖細胞指雌雄配子體中形成的或參與生殖過程的有關細胞，如大小孢母細胞、卵細胞與花粉。生殖細胞原位轉化法利用天然繁殖過程為轉化系統(tǒng)進行遺傳轉化。1花粉管通道法：周光宇（1981）首先提出，之后有不少改良。使子房預先充分授粉，在授粉后至合子分裂之前，通過花柱斷面滴加或子房注射，使外源DNA到達培囊，搜集成熟種子，篩選轉基因植株。我國目前推廣面積最大的轉基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優(yōu)點是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，第九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/892花粉介導法：收集成熟花粉，基因槍等轉化花粉，后用轉化后的花粉授于成熟的柱頭上，最后搜集成熟的種子。優(yōu)點：避開組織培養(yǎng)再生的過程，技術簡單，不需要裝備精良的實驗室，適合于難以再生的植物，常規(guī)育種工作者易于掌握。缺點：技術尚不成熟；篩選工作量大，轉化效率較低。第十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/810四顯微注射轉化法

利用顯微裝置將大分子物質（DNA）或細胞器注射到培養(yǎng)細胞中。最初主要由于動物，80年代中后期開始用于植物遺傳轉化。用微毛細管在顯微鏡下將外源DNA導入特定細胞，并使其成活、增殖。技術要點：注射針直徑要細（1uM）;選擇生長旺盛的胚性細胞；注射細胞核；進行微培養(yǎng)法。優(yōu)點：可精細選擇受體細胞，并直接導入細胞核。缺點：工作效率低，需要特殊顯微操作系統(tǒng)，操作復雜。第十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/811五激光微束穿刺法

利用激光微束（0.3-0.5uM）射擊靶細胞，引起可逆性穿孔，從而直接導入外源DNA。首先在動物與人的細胞中獲得成功，80年代后期用于植物。技術原理：激光照射系統(tǒng)產(chǎn)生高能量激光脈沖，照射經(jīng)高滲處理的材料，產(chǎn)生穿孔后，外源DNA向靶細胞滲入。然后培養(yǎng)靶組織，產(chǎn)生轉化植株。優(yōu)點：可瞄準靶細胞定位導入外源DNA，與其他方法比較對靶細胞損傷小、恢復快。單、雙子葉植物均可，受體細胞可以是花粉、單細胞或組織、器官。缺點：需要相應昂貴的設備，穿刺處理速度較慢。第十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/812六PEG介導法

PEG為化學滲透劑，通過改變細胞膜的通透性促使外源DNA進入靶細胞。所引起的膜透性可以恢復，但引起的外源DNA進入機制尚不清楚。技術原理：首先獲得原生質體，并有相應的組培再生體系。在一定滲透壓體系內(nèi)將外源DNA直接導入。改進的方法有（1）脂質體法，將外源DNA與脂質體（磷脂雙分子膜）的復合體用于轉化；（2）電擊法與PEG法相結合等，可提高轉化效率。特點：由于原生質體及相應的組培體系的獲得較難，且培養(yǎng)周期長、細胞遺傳背景易變異，故PEG法使用日趨減少。第十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/813基因槍及動力源的類型火藥爆炸轟擊載體塑料子彈為載體，火藥爆炸為動力，擋板阻擋塑料載體，而金屬子彈高速轟擊靶細胞。壓縮氣體沖擊載體以壓縮氦氣動力，可裂膜攜帶微彈高速運動，以阻網(wǎng)阻擋可裂膜，微彈轟擊靶細胞。高壓放電基因槍高壓放電使水氣化產(chǎn)生動力，驅動微彈載體。壓縮氣流直接傳送以氦氣動力直接驅動微彈。微靶點射擊無需載體，將DNA與金屬顆?；旌蠟樾∫旱危瑝嚎s氣體為動力轟擊。第十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/814基因槍轉化法的影響條件1DNA：高純度的DNA；質?；蚵懵禗NA片段大小在20-25kb以內(nèi)都可以；DNA濃度2ug/mg鎢粒；加入攜帶DNA（4-6kb小牛胸腺或鮭魚精DNA）。2金屬粒的選擇：金粒、鎢粒。鎢粒子較小也較便宜，但形狀不規(guī)則，對某些細胞具毒性；金粒子呈圓球形，大小均勻，在經(jīng)費許可下，可使用金粒子。金屬粒越大，速度及穿透力也越大。3微彈速率：樣品與微彈間距、壓力、真空度。4DNA沉淀劑：氯化鈣、亞精胺、聚乙二醇等。5植物材料受體:第十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/815影響基因槍法遺傳轉化的因素根據(jù)植物的種類不同，所選擇的最佳轟擊材料不同。不同類型的品種，其轉化頻率也不相同。同一品種來源的不同時期愈傷組織，轉化頻率也不盡相同。第十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/816轟擊前后的培養(yǎng)條件在對材料轟擊前，進行預培養(yǎng)、高滲處理及轟擊后的繼續(xù)高滲處理，延遲篩選都可以提高基因槍法的轉化頻率。轟擊后的材料，在一定的時間內(nèi)只進行抑菌培養(yǎng)而不進行篩選，對轉化頻率有一定的影響，因為轟擊對材料造成的機械的損傷，轟擊后需要一段時間的損傷修復。第十七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/817基因槍的轟擊參數(shù)DNA的濃度DNA的沉淀劑微彈的速度、射程和轟擊次數(shù)微彈的用量培養(yǎng)基成分微彈粒徑樣品室高度樣品室內(nèi)真空度轟擊前的輻照劑處理第十八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/818基因槍轉化操作第十九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/819PDS-1000

第二十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/820一種手持基因槍第二十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/821基因槍轉化流程表達載體構建微彈制備裝彈轟擊組培分化轉基因植株第二十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/822轉化方法農(nóng)桿菌法PEG法電擊法微針注射法基因槍法花粉管通道法受體材料完整細胞原生質體原生質體原生質體完整細胞卵細胞宿主范圍有無無無無有性繁殖植物組培條件簡單復雜復雜復雜簡單無嵌合體比例有無無無多無操作復雜性簡單簡單復雜復雜復雜簡單設備要求便宜便宜昂貴昂貴昂貴便宜工作效率高低低低高低單子葉植物應用少可行可行可行廣泛廣泛常用植物基因轉化方法特點比較第二十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/823七葉綠體基因工程葉綠體本身為半自主復制，大部分組分有核基因組編碼。葉綠體基因組為雙鏈環(huán)狀分子，約120-217kb，編碼120-160個基因。單個葉綠體中含20-900個拷貝。葉綠體基因組顯著特點為具反向重復序列，大小約6-67kb。葉綠體基因工程原理：通過一定方法使外源基因穿過細胞膜和葉綠體雙層膜進入葉綠體，在兩端同源片段的介導下與葉綠體基因組之間發(fā)生同源重組，以定點整合的方式插入到葉綠體基因組，在其中表達。第二十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/824葉綠體基因工程內(nèi)容1將外源DNA送入葉綠體主要通過基因槍轉化法2外源DNA整合到葉綠體基因組中*在目的基因兩側各加一段受體葉綠體基因組同源片段，大小一般1.5kb，過短降低轉化效率，過長操作復雜；*選擇合適插入位點，不影響受體；*如在反向重復區(qū)內(nèi)，還需通過拷貝糾正作用才能完成。3篩選帶有外源基因的轉基因植株4經(jīng)多輪篩選達到同質化通常在一定篩選壓下多代選擇，獲得同質系。篩選標記有：aadA基因（提供鏈霉素與壯觀霉素抗性）、GFP（綠色熒光蛋白）等。第二十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/825葉綠體基因工程的優(yōu)越性1高效表達目的基因2安全性好(母系遺傳，不可能通過花粉擴散)3消除位置效應（定點整合）4無基因沉默現(xiàn)象（無位置效應、甲基化少）5原核基因表達方式6適宜的表達環(huán)境

具雙層膜的細胞器，形成獨立的小環(huán)境；葉綠體對物質積累具較強的承受能力；產(chǎn)物區(qū)域化，便于提取。第二十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/826煙草葉綠體轉基因載體（圖例）葉綠體基因組表達載體第二十七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/827八轉基因沉默

外源基因在轉基因植物中表達受抑制的現(xiàn)象為轉基因沉默，表現(xiàn)為表達不穩(wěn)定、表達量低甚至完全不表達。轉錄水平transcriptionalgenesilenceing,TGS轉錄后水平post-transcriptionalgenesilenceing,PTGS

第二十八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/828轉基因沉默機制轉錄水平的基因沉默TranscriptionalGeneSilencing,TGS

轉基因及其啟動子甲基化多拷貝重復轉基因序列引起的轉錄水平基因沉默同源基因間的反式失活轉基因位置效應染色體包裝對轉基因沉默的影響后修飾作用

轉基因無法被順利轉錄成相應的RNA而導致基因沉默

第二十九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/829轉基因沉默機制轉錄后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)RNA閾值模型(RNAthresholdmodel)異常RNA模型(aberrantRNAmodel)分子間(內(nèi))堿基配對模型

轉錄后水平的基因沉默是指轉基因在細胞核里能穩(wěn)定轉錄，但在細胞質里卻無相應的穩(wěn)定態(tài)mRNA存在，例如共抑制(co-suppression)。

第三十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/830克服轉基因沉默的策略1對轉基因進行修飾

利用氨基酸密碼子的簡并性，對核酸序列進行修飾，選擇適合的密碼子，如調(diào)整GC含量。2啟動子選擇

過強的或帶有病毒感染特征的啟動子往往導致基因沉默，選擇中等強度、組成型的啟動子，避免帶有同源序列的啟動子、終止子可有效避免基因沉默。第三十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/8313利用MAR序列MAR為基質附著區(qū)，核酸與核骨架結合的序列。一般認為MAR位于轉錄活躍的DNA環(huán)狀結構邊界，可阻斷附近序列對基因表達的影響。將MAR序列構建到轉基因的兩側，可使轉基因穩(wěn)定、高效表達。4利用位置特異性重組系統(tǒng)Cre/lax、Flp/frt、R/rs、Gin/gix四種重組系統(tǒng)可實現(xiàn)單拷貝、位點特異性整合。方法為將Cre、Flp、R、Gin四種重組酶基因構建到轉基因表達載體上，轉化受體植物帶有l(wèi)ax、frt、rs、gix識別位點。可避免多拷貝失活及位置效應。5選擇單拷貝轉化體第三十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/832轉基因植物安全性爭議1Pusztai事件

英國蘇格蘭Rowett研究所的研究人員ArpadPusztai于1998年在電視臺宣稱，用轉雪蓮凝集素基因的馬鈴薯飼喂大鼠，“導致大鼠體重及器官重量嚴重減輕，免疫系統(tǒng)被損壞”，引發(fā)了國際上對轉基因作物安全性的爭論。英國皇家學會對此十分重視，組織了專門的同行評議，并于1999年5月公布報告，指出Pusztai的研究從試驗設計、方法，到研究結果及數(shù)據(jù)分析都有嚴重缺陷。Pusztai本人也因此而被勸提前退休。

第三十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/8332帝王蝶（Monarchbutterfly）事件

1999年美國康奈爾大學Losey等報道實驗室內(nèi)以拌有轉Bt基因抗蟲玉米花粉的馬利筋草喂養(yǎng)帝王蝶幼蟲可導致死亡，并認為轉基因威脅非目標昆蟲?！碍h(huán)境主義”組織據(jù)此提出應限制轉基因玉米的生產(chǎn)與銷售。美國環(huán)境保護局（EPA）組織昆蟲專家們進行了專題研究，結論認為抗蟲玉米花粉在田間對帝王蝶并無威脅，原因:（1）玉米花粉大而重，擴散不遠，在田間花粉只落在10碼以內(nèi)，距玉米5米的馬利筋雜草每平方厘米葉子上只發(fā)現(xiàn)一粒花粉；（2）帝王蝶通常不吃玉米花粉，且在玉米散粉后才大量產(chǎn)卵；（3）美國中西部轉Bt基因玉米占玉米面積的25％，但田間的帝王蝶數(shù)量卻很大。

EPA報告指出，評價轉基因作物對非靶標昆蟲的影響，應以野外實驗為準，而不能僅僅依靠試驗室的數(shù)據(jù)。第三十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/8343墨西哥轉基因玉米“污染”事件

美國加利福尼亞大學伯克利分校的伊格納西奧·查佩拉和戴維·奎斯特在２００１年１１月２９日的《自然》雜志上發(fā)表論文，將從墨西哥瓦哈卡山區(qū)采集的野生玉米樣本與美國孟山都公司的轉基因玉米及確信未被污染的天然玉米進行了比較。這些野生玉米生長的地點離工業(yè)化耕作的玉米地至少有１００公里遠。結果發(fā)現(xiàn)一部分野生玉米樣本受到了轉基因玉米的ＤＮＡ片斷污染。他們猜測污染源可能來自美國的糧食援助，這種基因污染可能破壞墨西哥野生玉米寶貴的生物多樣性。由于基因污染是轉基因農(nóng)作物是否安全的核心問題之一，這篇文章發(fā)表后引起了很大的爭議。一部分反對轉基因農(nóng)業(yè)的人士將它作為新的論據(jù)，但也有科學家對這項研究的可靠性提出質疑，認為實驗中ＤＮＡ樣本存在技術問題，得出的結果是一種假象。論文發(fā)表后招致了一些批評，兩位作者為此提出了新的研究數(shù)據(jù)，但仍不能平息爭論。《自然》雜志承認現(xiàn)有的證據(jù)“不足以表明發(fā)表原始論文是合適的”。該雜志在辦刊１３３年的歷史中，極少作這種表態(tài)。為了使事態(tài)明朗化，雜志決定把兩位作者支持自己結論的新論文和另兩篇質疑這項研究的文章同時發(fā)表，讓讀者自行判斷。第三十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/835科學界對轉基因安全性的態(tài)度12000年7月11日，英國皇家學會、巴西、中國、印度、墨西哥、美國科學院及第三世界科學院發(fā)表聯(lián)合聲明，利用基因改造技術能生產(chǎn)出更有營養(yǎng)、更宜儲存和促進健康的食品，對工業(yè)化國家和發(fā)展中國家的消費者都會帶來好處。應該通過有計劃地一致行動研究基因改造技術可能給環(huán)境帶來的正面和負面的影響，但這些影響應與目前使用的常規(guī)農(nóng)業(yè)技術所產(chǎn)生的影響相比較而加以評估。2由美國Tuskegee大學Prakash教授2000年1月起草了題為“科學家支持農(nóng)業(yè)生物技術的聲明”，已征集到世界上3,000多位科學家的簽名。“對植物負責任的遺傳修飾既不新也不危險。如抗病蟲等諸多性狀已通過有性雜交和細胞培養(yǎng)的方法經(jīng)常性地引入作