實驗十 水中大腸菌群的含量測定

實驗十水中大腸菌群的含量測定第一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二一、目的要求

1．學習測定水中大腸菌群數(shù)量的多管發(fā)酵法。2．了解大腸菌群的檢測作為飲水衛(wèi)生指標的重要性。第二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二二、基本原理

多管發(fā)酵法包括初（步）發(fā)酵試驗、平板分離和復發(fā)酵試驗三個部分。1．初（步）發(fā)酵試驗發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣。為便于觀察細菌的產(chǎn)酸情況，培養(yǎng)基內(nèi)加有溴甲酚紫作為pH指示劑，細菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色。溴甲酚紫還有抑制其他細菌如芽胞菌生長的作用。第三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二

水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，37℃下培養(yǎng)，24小時內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說明水中存在大腸菌群，為陽性結(jié)果，但也有個別其他類型的細菌在此條件下也可能產(chǎn)氣；此外產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的也不能完全說明是陰性結(jié)果。在量少的情況下，也可能延遲到48小時后才產(chǎn)氣，此時應(yīng)視為可疑結(jié)果，因此，以上兩種結(jié)果均需繼續(xù)做下面兩部分實驗，才能確定是否是大腸菌群。48小時后仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。第四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二2．平板分離平板培養(yǎng)基一般使用復紅亞硫酸鈉瓊脂（遠藤氏培養(yǎng)基，Endo＇smedium）或伊紅美藍瓊脂（eosinmethyleneblueagar，EMBagar），前者含有堿性復紅染料，在此作為指示劑，它可被培養(yǎng)基中的亞硫酸鈉脫色，使培養(yǎng)基呈淡粉紅色，大腸菌群發(fā)酵乳糖后產(chǎn)生的酸和乙醛即和復紅反應(yīng)，形成深紅色復合物，使大腸菌群菌落變?yōu)閹Ы饘俟鉂傻纳罴t色。亞硫酸鈉還可抑制其他雜菌的生長。第五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二

伊紅美藍瓊脂平板含有伊紅與美藍染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時，該兩種染料即結(jié)合成復合物，使大腸菌群產(chǎn)生與遠藤氏培養(yǎng)基上相似的、帶核心的、有金屬光澤的深紫色（龍膽紫的紫色）菌落。初發(fā)酵管24小時內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣和48小時產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需在以上平板上劃線分離菌落。3．復發(fā)酵試驗

以上大腸菌群陽性菌落，經(jīng)涂片染色為革蘭氏陰性無芽胞桿菌者，通過此試驗再進一步證實。原理與初發(fā)酵試驗相同，經(jīng)24小時培養(yǎng)產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽性結(jié)果。第六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二三、器材

1、培養(yǎng)基乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有倒置小套管），三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管（瓶）（內(nèi)有倒置小套管），伊紅美藍瓊脂平板，滅菌水；2、儀器或其他用具載玻片，滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌吸管，滅菌試管等。第七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二四、操作步驟1．水樣的采取

1)自來水先將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌，再開放水龍頭使水流5min后，以滅菌三角燒瓶接取水樣，以待分析。

2）池水、河水或湖水應(yīng)取距水面10～15cm的深層水樣，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。最好立即檢查，否則需放入冰箱充分冷卻。第八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二2．自來水檢查（1）初（步）發(fā)酵試驗在2個含有50ml三倍濃縮的乳糖蛋白胨發(fā)酵燒瓶中，各加入100ml水樣。在10支含有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，各加入10ml水樣（如圖ⅩⅣ-1）?；靹蚝?，37℃培養(yǎng)24小時，24小時未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至48小時。（2）平板分離經(jīng)24小時培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及48小時產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（瓶），分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板上，再于37℃下培養(yǎng)18～24小時，將符合下列特征的菌落的一小部分，進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。第九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二

（a）深紫黑色、有金屬光澤。（b）紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。（c）淡紫紅色、中心顏色較深。（3）復發(fā)酵試驗經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落1～3個，37℃培養(yǎng)24小時，結(jié)果若產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，即證實有大腸菌群存在。證實有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試驗的陽性管（瓶）數(shù)查表ⅩⅣ-2，即得大腸菌群數(shù)。第十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二第十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二3．池水、河水或湖水等的檢查（1）將水樣稀釋成10-1與10-2。（2）分別吸取1ml10-2、10-1的稀釋水樣和1ml原水樣，各裝入有10ml普通濃度乳糖蛋白胨發(fā)酵管中。另取10ml和100ml原水樣，分別注入裝有5ml和50ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵液的試管（瓶）中。

第十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二

（3）以下步驟同上述自來水的平板分離和復發(fā)酵試驗。（4）將100、10、1、0.1（10-1）ml水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表ⅪⅤ-3，將10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）ml水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表ⅪⅤ-4，即得每升水樣中的大腸菌群數(shù)。第十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二第十四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二第十五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二第十六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二初發(fā)酵前第十七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二初發(fā)酵后陽性管---產(chǎn)酸、產(chǎn)氣結(jié)果第十八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二EMB平板分離典型結(jié)果1---綠色金屬光澤菌落第十九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二EMB平板分離典型結(jié)果2---黑紫色不帶或略帶金屬光澤菌落第二十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二EMB平板分離典型結(jié)果3---淡紫紅色中心顏色較深菌落第二十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二復發(fā)酵實驗結(jié)果----產(chǎn)酸、產(chǎn)氣第二十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二五、實驗報告

（1）自來水

100ml水樣的陽性管數(shù)是多少？

10ml水樣的陽性管數(shù)是多少？查表ⅪⅤ-2得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？（2）池水、河水或湖水陽性結(jié)果記“+”；陰性結(jié)果記“-”。查表ⅪⅤ-3得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？查表ⅪⅤ-4得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？第二十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期二第二十四頁，共二十五頁，編輯