顯微鏡的結構使用及維護與植物制片技術

顯微鏡的結構使用及維護與植物制片技術第一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三一、顯微鏡的結構使用及維護二、植物組織制片技術CompanyLogo基礎知識第二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三一、顯微鏡的結構使用及維護顯微鏡的光學原理顯微鏡的幾個基本概念顯微鏡的結構顯微鏡的使用顯微鏡的維護基礎知識第三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三要知道的幾個重要的分辨率:人眼：0.2mm/250mm毫米光學顯微鏡：0.2um微米電子顯微鏡：0.2nm納米基礎知識第四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三顯微鏡的發(fā)展1.1人眼：人眼觀察物體的能力是有限的。一般的情況下，在25cm的明視距離內(nèi)，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的兩個物體。也就是說，當兩個物體相距不到0.1mm的時候，人眼就會把它們看成是一個物體了。這個極限便稱為人眼的分辨本領。1.2放大鏡：約在四百年前眼鏡片工匠們開始磨制放大鏡。當時的放大鏡的放大倍數(shù)只有3—5x基礎知識第五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三1.3顯微鏡的發(fā)展：

1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者造出類似顯微鏡的放大儀器。

1673～1677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡

19世紀70年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎。

1850年出現(xiàn)了偏光顯微術；

1893年出現(xiàn)了干涉顯微術；

1935年荷蘭物理學家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術基礎知識第六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三基礎知識第七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三列文虎克和他的顯微鏡（約1680）基礎知識第八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三顯微鏡的使用第九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三基礎知識顯微鏡概述

顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，后者則以電子束為光源。1.光學顯微鏡普通生物顯微鏡由3部分構成：①照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。②光學放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體。③機械裝置：用于固定材料和觀察方便，包括鏡臺(載物臺)、調節(jié)器和物鏡轉換器(旋轉器)等。第十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三光學顯微鏡基本結構：1.照明燈(Lamp)2.聚光器(Condenser)3.載物臺和切片夾(Mechanicalstageandspecimenretainer)4.推進器(Mechanicalstageadjustmentknob)5.物鏡(Objectives)6.粗細螺旋(Courseandfinefocusknob)7.目鏡(Oculars)8.照相機等接口(Connectiontocamera,etc.)基礎知識第十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三第十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三顯微鏡的幾個基本概念：1、光源：能發(fā)射光波的物體?？梢姽忸l率范圍：7.5×1014-3.9×1014Hz。真空中對應的波長范圍：390nm–760nm

相應光色：紫、藍、青、綠、黃、橙、紅基礎知識第十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三

2、

數(shù)值孔徑

數(shù)值孔徑又叫鏡口率。它是指所觀察的物體與鏡頭間介質的折射率n與物鏡鏡口角α一半的正弦值的乘積。用N.A或A.來表示。即：N.A.＝nsin（α/2）

所謂鏡口角是指被觀察點射入物鏡前透鏡的邊緣光線之間的夾角。

數(shù)值孔徑是物鏡與聚光鏡的重要參數(shù)，一般希望它越大越好。

一是增大鏡口角，可以讓標本與物體盡量靠近。但無論怎樣靠近，α總是小于180°。這樣，sin（α/2）也小于１。而空氣的折射率n＝1。因此，干燥系物鏡的數(shù)值孔徑nsin（α/2）總是小于1，一般在0.04～0.95之間。

二是增大物鏡與標本之間的折射率，可在物鏡與標本之間加入折射率較大的介質。如香柏油的折射率n＝1.515，使用香柏油為介質時，可使數(shù)值孔徑達到1.2以上。

第十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三物鏡數(shù)值孔徑基礎知識第十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三

3、分辨率

分辨率是指顯微鏡分辨被檢物體細微結構的能力。它與分辨距離成反比。分辨距離是指能被分辨開的兩物點間的最小距離。分辨距離越小，顯微鏡的分辨率越高。如果兩物點間的距離小于分辨距離，就會把兩點誤看成一點，無法看清其結構。顯微鏡的分辨率是由物鏡決定的。目鏡只起放大作用，不能增加顯微鏡的分辨率。在普通中心照明的情況下，物鏡的分辨距離ｄ由下式?jīng)Q定。

ｄ＝0.61*λ/N.A.

式中：ｄ表示分辨距離,單位是微米，λ表示照明光線的波長，單位也是微米。

在可見光中，亮度最大而且對人眼最敏感的波長為0.55μm，物鏡最大的N.A.為1.4。代入上式可得ｄ近似為0.2μm。即，使用普通光學顯微鏡，在中心照明的情況下，分辨距離的極限為0.2μm。也就是說，小于0.2μm的兩物體，普通光學顯微鏡無法區(qū)分。

基礎知識第十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三第十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三4、

放大率

顯微鏡的放大率等于物鏡的放大率和目鏡的放大率的乘積。從原理上講，放大率可以做的非常大。但是，如果標本的細節(jié)不能被物鏡分辨開來，放大的再大，也毫無意義。理論上可以推導出來，顯微鏡最合適的放大率（稱為有效放大率，用Ｍ有效表示）是在物鏡的數(shù)值孔徑的500～1000倍之間。即

500N.A.≤Ｍ有效≤1000N.A.

在有效放大率范圍內(nèi)，眼睛可以長時間觀察而不易疲勞。如果放大率低于500N.A.，觀察起來就很吃力。如果高于1000N.A.，則會使像質變壞，甚至造成不真實的像。因此，超過1000N.A.的放大率稱為無效放大率。

基礎知識第十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三

在物鏡上，有鏡口率(N.A.)的標志，它反應該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨率越高，各物鏡的鏡口率如下表：物鏡鏡口率(N.A.)工作距離(mm)10×0.255.4040×0.650.39100×1.300.11顯微鏡的總放大倍數(shù)等于目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，

公式為:M=K1xK2。基礎知識第十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三5、工作距離

工作距離是指顯微鏡調焦后，在使用標準蓋玻片和標準機械筒長的情況下，物鏡的下表面至蓋玻片上表面之間的距離。物鏡的放大率越高，工作距離越短。一般10倍以下的低倍物鏡，工作距離為5～7mm，而100倍的油鏡，其工作距離只有0.19mm左右?；A知識第二十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三6、焦點深度

當顯微鏡調焦于標本中某一平面后，不僅這一物平面可以看清楚，而且和它相連的上下兩個物平面也能同時看清楚。這上下兩個物平面之間的距離叫做焦點深度，簡稱焦深。

顯微鏡的焦深是很小的，而且數(shù)值孔徑越大、總放大率越大，焦深越小。例如，使用N.A.為1.25/100倍的油鏡、12.5倍的目鏡觀察時，焦深只有0.27μm。這就是說，調焦后一次只看清楚0.27μm厚的一個薄層。而普通標本一般都有幾個微米厚。要想看完整個標本，需要使用顯微鏡的微調機構，自上而下分層觀察。

基礎知識第二十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三焦點深度第二十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三7、視場

視場又叫視野。是指顯微鏡一次能夠看到的被檢物體的范圍。顯微鏡的視場由物鏡的視場和目鏡的視場共同決定的。普通物鏡的視場小于20mm，大的可達40mm以上。普通10倍目鏡的視場為14mm，大的可達24mm以上。物鏡與目鏡一旦設計好后，其視場便固定了。

視場的大小與顯微鏡的總放大率成反比?？偡糯舐试酱螅晥鲈叫?。解決的辦法是利用移動器，使標本的各部分依次進入視場，輪流觀察?；A知識第二十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三8、鏡像亮度

鏡像亮度是指顯微鏡中所看到的物像的亮暗程度。為了便于觀察，我們希望所成的像亮一些。在外部光線不變的情況下，鏡像亮度與數(shù)值孔徑的平方成正比，而與總放大率的平方成反比。要想使鏡像亮度大些，應使用大數(shù)值孔徑的物鏡，配以低放大率的目鏡。例如，在物鏡相同的情況下，使用5倍的目鏡與使用10倍的目鏡相比，其鏡像亮度要大4倍。

使用電光源的顯微鏡，其鏡像亮度可以通過調節(jié)照明燈的亮度來控制。

基礎知識第二十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三9、清晰度

顯微鏡成像的清晰度取決于其光學系統(tǒng)，尤其是物鏡的光學性能。影響清晰度的主要原因有以下5點：（1）所使用的蓋玻片的厚度不合格（2）調焦沒有調到理想位置（3）總放大率用得過大（4）油鏡的鏡頭沒有擦干凈（5）鏡片生霉等。

第二十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三

物鏡

(objective)

物鏡是光學顯微鏡成像系統(tǒng)中決定其分辨率或叫分辨本領的最關鍵部件。物鏡是由若干個透鏡組合而成的一個透鏡組，組合使用的目的是為了克服單個透鏡的成像缺陷，提高物鏡的光學質量。顯微鏡的放大作用主要取決于物鏡，物鏡質量的好壞直接影響顯微鏡映像質量，它是決定顯微鏡的分辨率和成像清晰程度的主要部件?；A知識第二十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三物鏡類型：(1)按顯微鏡鏡筒長度

(以mm計):透射光用160筒,0.17mm厚或更厚的蓋玻片;反射光用190鏡筒,不帶蓋玻片;透射光與反射光用鏡筒,筒長無限大(2)按浸法特征:非浸式(干式)、浸式(油浸、水浸、甘油浸及其它浸法)。(3)按光學裝置:透射式、反射式以及折反射式(4)按數(shù)值孔徑和放大倍數(shù):低倍(NA≤0.2與β≤10X),中倍(NA≤0.65與β≤40X),高倍(NA＞0.65與β＞40X)。(5)按校正象差的情況不同,通常分為消色差物鏡,半復消色差物鏡,復消色差物鏡,平視場消色差物鏡,平視場復消色差物鏡和單色物鏡?；A知識第二十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三

物鏡結構第二十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三目鏡

目鏡的作用是把物鏡放大的實象再放大一級，并把物象映入觀察者的眼中，實質上目鏡就是一個放大鏡。顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。對于物鏡不能分辨出的結構。目鏡通常由若干個透鏡組合而成，具有較大的視場和視角放大率

基礎知識第二十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三

聚光鏡用于照明物體并保證物鏡具有一定數(shù)值孔徑的會聚透鏡。聚光鏡裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補光量的不足和適當改變從光源射來的光的性質，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。基礎知識第三十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三

聚光鏡光欄

所謂光欄，從廣義的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可認為光欄。聚光鏡光欄作用（1）改變聚光鏡的數(shù)值孔徑以便與物鏡的數(shù)值孔徑相匹配，可調整圖象的分辨率和反差。（2）輔助調整亮度。第三十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三聚光器數(shù)值孔徑第三十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三孔徑光欄開度與圖象100%70%30%第三十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三顯微鏡的使用觀察前的準備工作(1)觀察者要養(yǎng)成顯微鏡鏡檢的工作習慣，觀察時要雙眼同時睜開，一邊觀察一邊進行記錄或描繪。(2)觀察時所用的材料、藥品和各種器具要預先準備好。(3)顯微鏡在使用之前應檢查一下它的各個部件是否完整和正常，并對載物臺、目鏡、物鏡以及聚光器上端透鏡進行必要的清潔工作。第三十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三瞳距調節(jié)2.顯微鏡的調節(jié)第三十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三屈光度調節(jié)調節(jié)第三十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三粗細螺旋調節(jié)旋鈕基礎知識第三十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三觀察操作低、高倍鏡的使用:先把低倍的物鏡用粗調焦螺旋下降至離蓋玻片0.5cm處，然后一邊觀察視野一邊上升物鏡，直至看到圖像，再將標本移到視野中心，用細調焦螺旋把物鏡調至最清晰處，若要用高倍鏡觀察時，把所要進一步放大觀察的部位移至視野中央，直接順時針轉換成高倍物鏡，然后用細調焦螺旋調焦，至看清物像。

第三十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三油鏡的操作方法:

將高倍鏡觀察到的目標移動至視野中央將高倍鏡鏡頭挪開，于載玻片上滴一滴香柏油將油鏡鏡頭移動至視野中央，讓油鏡鏡頭浸入香柏油（至油暈不再擴大為止）用微調焦螺旋調節(jié)至清晰注意：油鏡的操作需要較強的光線，故需將光線調至最強。油鏡用后處理：第一遍：用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油第二遍：用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡第三遍：再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。

第三十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三光線通過幾種介質的折射率（n）比較：介質空氣水石蠟油香柏油玻璃折射率1.01.331.471.5151.52第四十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三倒置顯微鏡

倒置顯微鏡中最常用的觀察方法就是相差。由于這種方法不要求染色，是觀察活細胞和微生物的理想方法。這種方法提供帶有自然背景色的、高對比度的、高清晰度的圖像。倒置顯微鏡與正置顯微鏡的主要區(qū)別在于物鏡位于載物臺下方，這樣有利于觀察時在上方對樣品進行一些實時操作。第四十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三倒置顯微鏡操作過程基本與雙筒的正置顯微鏡相似，需注意以下幾點：觀察時可調節(jié)鉸鏈式雙目目鏡至舒適的位置。組織培養(yǎng)液或水濺到載物臺上、物鏡上或顯微鏡鏡架上可能會損傷設備。如果濺上后，應該立即從墻上插座拔下電源線，擦去濺出液或水。一定要輕柔轉動光強調節(jié)鈕，不要試圖將旋鈕轉過終點位置。使用后一定要先將燈的強度調至最小再關電源。使用后要旋轉三孔轉換器，使物鏡鏡片置于載物臺下側，防止灰塵的沉降。第四十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三體視顯微鏡它在觀察物體時能產(chǎn)生正立的三維空間影像。立體感強，成像清晰和寬闊，又具有長工作距離，并可根據(jù)觀察物的特點選用不同的反射和透射光照明，是適用范圍非常廣泛的常規(guī)顯微鏡。由雙筒目鏡和物鏡構成。放大率7～80倍。在目鏡內(nèi)形成一個直立的放大實像，可以觀察未經(jīng)加工的物體的立體形狀、顏色及表面微細結構,并能進行顯微解剖操作,也可以觀察生物機體的組織切片。第四十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三體視顯微鏡特點

1．雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行，而是具有一定的夾角——體視角（一般為12度---15度），因此成像具有三維立體感；2．像是直立的，便于操作和解剖，這是由于在目鏡下方的棱鏡把像倒轉過來的緣故；3．雖然放大率不如常規(guī)顯微鏡，但其工作距離很長4．焦深大，便于觀察被檢物體的全層。5．視場直徑大。

第四十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三體視顯微鏡的使用方法：調焦：觀察透明標本時，選用毛玻璃臺板；觀察不透明標本時，選用黑白臺板。然后松開調焦滑座上的緊固螺釘，調節(jié)鏡體的高度，使其與所選用的物鏡放大倍數(shù)大體一致的工作距離。調好后，須鎖緊緊固螺釘。調焦時，建議選用平面物體，如印有字符的平整紙張、直尺、三角板等。視度調節(jié)：調節(jié)目鏡筒上的視度圈，直至標本的圖像清晰為止。瞳距調節(jié)：扳動兩目鏡筒，可以改變兩目鏡筒的出瞳距離。當使用者觀察視場中的兩個圓形視場完全重合時，說明瞳距已調節(jié)好?；A知識第四十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三數(shù)碼生物顯微鏡數(shù)碼顯微鏡是在光學顯微鏡的基礎上加了一個數(shù)碼成像裝置，可以將顯微鏡所成的像，在電腦屏幕上直接顯示出來

第四十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三motic數(shù)碼顯微鏡的使用方法

1、準備

請將隨機配件“A-B型USB線”的A端（矩形端口）插入計算機的USB端口，將B端（方型端口）插入顯微鏡的USB端口。

將隨機配件“雙插頭主電源線”的一端插入100V-240V開關電源輸入端，另一端與供電電源相接。

將12VDC開關電源輸入端插入顯微鏡的12VDC電源輸入端。打開顯微鏡的電源開關，適當調整底座上的亮度調節(jié)手輪，此時底座內(nèi)燈亮?；A知識第四十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三2、光學部分的操作步驟

將所觀察的標本放在載物臺中央，使要觀察的物體大致在載物臺的通光孔中央，用切片壓簧壓緊。將各倍率物鏡依次裝于物鏡轉換器上，目鏡插入目鏡筒中。

操作時用低倍鏡觀察，通過聚光鏡下的可變光欄來獲得最佳的視野效果。

將鏡筒下降使物鏡靠近切片，然后眼睛觀察目鏡，旋轉粗準焦螺旋使鏡筒慢慢上升，在低倍鏡下觀察清楚后，把要放大觀察的物象移至視野中央。

用轉換器轉到高倍物鏡并用細準焦螺旋調整到清晰的物象，再調節(jié)光欄，以便獲得最清晰的物象。基礎知識第四十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三3、

白平衡的操作步驟：如果觀察到的樣本所顯示的圖象背景色及目鏡視場背景色失真的情況下，就需要進行白平衡的操作： （1）、將蘭色濾色片或其他種類的濾色片放入光道中，這時目鏡視場的背景將會逐漸接近所期望的背景色。為達到最佳背景效果，請按住白平衡開關1-2秒，調節(jié)背景色至你所希望的背景色后，即松開白平衡開關，這時白平衡的調節(jié)也就完成了。 （2）、如果需要改變已調好的圖象背景，須將濾色片取出或通過調節(jié)顯微鏡上的調光旋鈕來調節(jié)照明亮度，再上述步驟，即可重新調整圖象背景。第四十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三4、數(shù)碼部分的操作步驟：1）、將MoticLmagesPlus2.0ML安裝至電腦中，數(shù)碼顯微鏡才可正常使用。2）、將數(shù)碼顯微鏡頭部上的拉桿拉出至最后一檔，此時顯微鏡處于既可目視觀察又可進行CCD攝像狀態(tài)。3）、雙擊計算機桌面上的Moticimages圖標，顯微鏡將自動進入預覽狀態(tài)。此時CCD罩上的指示燈亮，表明顯微鏡已經(jīng)進入數(shù)碼工作狀態(tài)。在視窗中將顯示被觀察切片的圖象，該圖象與從顯微鏡目鏡觀察到的一致。第五十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三5、顯微鏡測量軟件MoticImagesPlus2.0簡介實時靜態(tài)圖像捕捉；可以JPG、BMP、TIF及SFC形式保存圖像；圖像有1280x1024，1024x768，800x600，640x480，320x240等像素大??；計算機上全屏實時顯示活體圖像；以AVI格式攝錄運動影像。先進的測量功能，包括周長、寬度、半徑、圓周及角度的計算；通過選擇一個區(qū)域或圖像，即時簡便地進行測量；數(shù)據(jù)可以導入電子數(shù)據(jù)表或數(shù)據(jù)庫，以備分析。第五十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三熒光顯微鏡

熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一熒光顯微鏡用于研究細胞內(nèi)物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。

第五十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下區(qū)別：2.光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；3.有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人眼。

1.照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上；第五十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三

放大倍數(shù)1、放大倍數(shù)＝目鏡x物鏡2、顯微鏡放大的長度或寬度，而不是面積。3、放大倍數(shù)變大,視野中細胞數(shù)目變少有兩種情況：

10x1010x40細胞單行排列

細胞均勻分布擴大4倍82除以擴大的倍數(shù)（4）644除以擴大的倍數(shù)的平方（42）第五十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三玻片的移動與物像的移動由于是倒立的像，玻片的移動方向與物像的移動方向相反。物像偏左下方結論：物像偏什么方向，玻片向什么方向移動第五十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三視野中污點的判斷轉動目鏡，污點移動的則污點在目鏡上，不動的不在目鏡上。移動玻片，污點移動的則污點在玻片上，不動的不在玻片上。不在目鏡、玻片上則在物鏡上物鏡和玻片的距離與放大倍數(shù)的關系放大倍數(shù)小放大倍數(shù)大第五十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三日常維護保養(yǎng)（１）防潮

光學鏡片就容易生霉、生霧。機械零件受潮后，容易生銹。顯微鏡箱內(nèi)應放置１～２袋硅膠作干燥劑。（２）防塵

光學元件表面落入灰塵，不僅影響光線通過，而且經(jīng)光學系統(tǒng)放大后，會生成很大的污斑，影響觀察?；覊m、砂粒落入機械部分，還會增加磨損，引起運動受阻，危害同樣很大。注意保持顯微鏡的清潔。（３）防腐蝕顯微鏡不能和具有腐蝕性的化學試劑放在一起。如硫酸、鹽酸、強堿等。（４）防熱避免熱脹冷縮引起鏡片的開膠與脫落。因此，生物顯微鏡要放置在干燥陰涼、無塵、無腐蝕的地方。使用后，要立即擦拭干凈，用防塵透氣罩罩好或放在箱子內(nèi)。當顯微鏡閑置時，用塑料罩蓋好，并儲放在干燥的地方防塵防霉。將物鏡和目鏡保存在干燥器之類的容器中，并防些干燥劑。第五十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三機械系統(tǒng)的維護保養(yǎng)滑動部位：定期涂些中性潤滑脂油漆和塑料表面的清潔：頑固的污跡可以使用軟性的清潔劑來清洗，建議使用硅布。塑料部分：用軟布蘸水就可以清洗了。注意：不要使用有機溶劑（如酒精，乙醚，稀釋劑等）。因為會腐蝕機械和油漆，造成損壞。第五十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三光學系統(tǒng)的維護保養(yǎng)透鏡的清潔使用后用干凈柔軟的綢布輕輕擦拭目鏡和物鏡鏡片。聚光鏡和反光鏡只要擦干凈就可以了。有較頑固的污跡，可用長纖維脫脂棉或干凈的細棉布蘸少些二甲笨或鏡頭清洗液（３份酒精∶１份乙醚）擦拭，然后用干凈細軟的綢布擦干或用吹風球吹干。注意：清洗液千萬不能滲入到物鏡鏡片內(nèi)部，否則會損壞物鏡鏡片。純酒精和二甲苯容易燃燒，在將電源開關打開或關閉時要特別當心不要引燃這些液體。第五十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三定期檢查

為了保持性能的穩(wěn)定，建議做定期的檢查，保養(yǎng)。綜上所述，對于生物顯微鏡的維護保養(yǎng)，主要做到防塵、防潮、防熱、防腐蝕。用后及時清洗擦拭干凈，并定期在有關部位加注中性潤滑油脂。對于一些結構復雜，裝配精密的零部件，如果沒有一定的專業(yè)知識，一定的技能和專用工具，就不能擅自拆裝，以免損壞零部件。第六十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三清潔工具清潔工具第六十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三第六十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三清潔液配方：1份無水乙醇＋3份乙醚第六十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三擦拭方法第六十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三注意事項:塑料表面勿用乙醇乙醚混合液擦洗。嚴禁用干擦鏡紙擦拭鏡頭。物鏡嚴禁拆卸并防止振動。第六十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三二、園藝植物組織制片方法

植物制片是進行園藝植物科學研究所需用的一種基本方法，比如進行植物各個器官的解剖構造觀察、花芽分化研究、授粉受精觀察、貯藏營養(yǎng)觀測以及染色體觀察等都需要進行制片。通過對切片結果的分析，可以比較不同試驗處理的效果以及了解不同樹種和品種相應的生物學特性等。

第六十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三徒手制片

1、徒手制片（切片）及特點

徒手制片一般指徒手用刀片把新鮮的植物材料切成薄片的制片方法。用徒手切片的材料不宜過大，一般以表面不超過5-8mm2為宜。主要優(yōu)點是：（1）能及時觀察研究植物生活組織結構和天然色彩；（2）方法及用具簡單，不需切片機等機械設備，短時間即可完成。主要缺點是（1）對于微小、柔軟、水分過多以及堅硬的材料，難以用徒手切成薄片；（2）對于操作不熟練者，往往切成厚薄不勻或不完整的切片。第六十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三2、徒手制片的方法及注意事項

徒手制片最主要的工具就是刀片，?？捎脝蚊娴镀Ｒ@得良好的切片，首先要保持刀口的鋒利。切片方法及步驟為：（1）準備工作（盛好清水的培養(yǎng)皿、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、刀片等用具）。（2）拿取材料進行切片，材料可以是新鮮的材料，也可以是經(jīng)過固定的材料（切片時，將欲切材料斷面和刀片上滴上清水以保持材料濕潤）。第六十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三

（3）以左手拇指、食指、中指捏住材料，拇指應低于食指，以免切傷手指；材料高出指尖。（4）右手執(zhí)刀，將刀平放在食指上，刀口朝內(nèi)，刀面與材料斷面平行，然后以均勻快捷的動作自左前方向右后方以臂力帶動刀片水平切割移動，不要用腕力。同時還要注意，切時動作要迅速，材料一次切下，切忌停頓或拉鋸式切割。

第六十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三（5）連續(xù)切數(shù)片后，將切下的薄片輕輕移入盛水的培養(yǎng)皿中備用。然后挑選薄而透明的切片，放在載玻片上的水滴中，加上蓋玻片制成臨時制片進行觀察。在試驗中，有時因各種情況所取材料無法馬上進行制片。可以將其保存在固定液中，常用的固定液為F.A.A固定液，它不但是優(yōu)良的固定液也是優(yōu)良的保存液

。第七十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三

夾持物：對于過于柔軟或微小的材料（如葉片、細小的根尖等）需要借助一些夾持物

(如蘿卜、胡蘿卜、馬鈴薯塊莖或通心草等)中進行切片。使用夾持物時要先將夾持物切成3～5cm長、0．5cm寬的立方形小塊，將其中部縱切一縫、然后將修整好的材料夾入其中與支持物一起切片。第七十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三切取的標本材料和夾持物第七十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三滴水放置標本加蓋蓋玻片葉的橫切第七十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三。石蠟制片

石蠟切片是光學顯微鏡的制片技術中最常用的一種方法，屬于永久制片。一般的植物材料都可以用此法制片。但有制作時間較長，操作過程復雜以及材料易發(fā)硬或發(fā)脆等缺點。第七十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三

操作程序如下：

1.材料的采集與分割：根據(jù)制片的目的和要求采集材料，材料要有代表性。材料采后應盡快進行分割固定。為使固定液能迅速的滲透材料，要進行材料分割。分割塊宜小不宜大，一般不超過1cm3，分割后立即殺死固定。

2.殺死與固定：利用藥劑迅速把細胞殺死，以保持材料本來的狀態(tài)和結構。常用的固定液有F.A.A固定液、卡諾固定液等，前者還可作保存液。

第七十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三常用的固定液1.福爾馬林-醋酸-酒精固定液(FAA)50%或70%酒精90ml+冰醋酸5ml+福爾馬林(37%~40%甲醛)5ml

是植物制片技術中較為良好的固定液和保存液。除單細胞和絲狀藻類外，均可用此液固定．2.福爾馬林-丙酸-酒精固定液（FPA）

福爾馬林5ml+丙酸5ml+50%酒精90ml

固定一般的植物組織，通常固定24h，可長久保存第七十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三3.酒精-醋酸-氯仿固定液（卡諾固定液，Carnoyfixative）

配方Ⅰ：純酒精3份+冰醋酸1份

配方Ⅱ：純酒精6份+冰醋酸1份+氯仿3份

適用于植物組織和細胞學材料，為研究細胞分裂和染色體的優(yōu)良固定液。固定時間不宜過久。4.酒精-福爾馬林固定液

福爾馬林2~6（6~10）ml+70%酒精100ml

固定植物一般組織，尤其適用于萌發(fā)的花粉管的固定。通常固定24h，亦可長久保存第七十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三固定的注意事項

(1)固定的材料越新鮮越好。因此，采集或割取后須立即投入預先準備好的固定液中進行固定，切勿耽誤。

(2)材料大小以不超過1cm3為宜，材料與固定液的比例為1:20。

(3)根據(jù)材料的性質和制片的目的選擇固定液。

(4)含有氣泡的材料投入團定液后，材料不會下沉，故須將氣泡抽出使材料下沉。最簡易的抽氣方法是將材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽動幾次。也小用抽氣裝置進行抽氣。

(5)固定時，要防止材料變形。

(6)外有被膜，而內(nèi)部站構又極易松散的組織，應將整個組織投入固定液2—2h后，再將其修成小塊材料繼續(xù)固定

(7)材料投入固定液后．須經(jīng)常搖晃。

(8)容器外需貼標簽。第七十八頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三3、脫水

除去組織中的水分，便于透明、浸蠟、包埋等步驟的進行。常用的脫水劑為酒精。脫水采用等級脫水（系列脫水），即從較低濃度酒精開始，逐漸替換到高濃度酒精。脫水的過程：一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100%→100%

脫水應逐步而不應跨越太大進行，否則將引起組織強烈的收縮或變形，在經(jīng)無水乙醇處理時，應保證試劑的純度。第七十九頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三4、透明

將脫水劑從材料中除去，使材料透明，增加折光系數(shù)；便于下步的浸蠟和包埋等程序。透明劑是一種既能與脫水劑混合，又能與包埋劑混合的藥劑。常用的透明劑為二甲苯和氯仿，適用原則也是逐級進行，可減少材料收縮。其過程為：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，它具有滲透力強，溶解石蠟量大，又易揮發(fā)的優(yōu)點，其缺點是易使組織收縮，變硬，變脆，因此透明時間應根據(jù)組織塊大小及質地酌情而定。第八十頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三5、滲蠟

逐漸除去透明劑,并為包埋劑所代替。常用的包埋劑是石蠟。浸蠟過程是使石蠟慢慢溶于浸有材料的透明劑中，溶解在透明劑中的石蠟漸漸深入到材料的細胞中去，最后使透明劑完全被石蠟取代，以便切片。50％石蠟(50％二甲苯)

40～42℃

0.5～3h

70％石蠟

48～50℃0.5～3h

A杯純蠟56～58℃

20min～lh

B杯純蠟

56～58℃

20min～lh

C杯純蠟

56～58℃

20min～lh第八十一頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三6、包埋

將浸蠟后的材料包埋在石蠟中。此步驟要迅速，且不要使石蠟塊中有氣泡。注意將樣品編號封于蠟塊上，以免樣品混淆，以備切片。包埋可用相同的器具，也可折疊一牛皮紙盒。將液態(tài)石蠟緩緩倒入紙盒中，再用鑷子輕輕將浸好蠟的組織塊夾入紙盒，擺好位置，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢。

第八十二頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三我們可以看到：①水和酒精可以相溶。②酒精和二甲苯相溶。③二甲苯和石蠟可以相溶。因為以上相鄰步驟所使用的液體均可以互溶，所以保證每一步驟液體能置換完全。水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蠟不能相溶，所以如果有一個步驟的處理不徹底，殘留的液體帶到下一個步驟將不能互溶，最終帶到滲蠟步驟中，成為細小的空洞，以至不能成為質地致密的石蠟塊，也就切不成良好的切片。第八十三頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三7、切片修塊：切片前需修整蠟塊，即將包埋好的一大塊蠟塊切開，使每一小塊都含有一塊組織，從切面看組織周圍的石蠟相等。固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺上，以便于固定在切片機上。切片：一手持毛筆，一手轉動切片機，切片的蠟片連成一長條蠟帶。切下的蠟帶放在一干凈黑紙上。貼片：將切下來的切片粘在潔凈的載玻片上。粘片時先在載玻片上滴上一小滴粘片劑，加幾滴蒸餾水，然后用鑷子小心把切片放在水上，在35-40℃下，用撥針將切片伸直、展平，傾斜載片，使水流去并烘干第八十四頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三

8、染色

染料、染色液染料必須具備兩個條件：

(1)要具有顏色

(2)和被染物體之間具有親和力。根據(jù)用途分

(l)細胞核染色劑用于細胞核的染色劑有天然染色劑的蘇木精、洋紅以及合成染色劑中的番紅、結品紫、硫堇、甲苯胺藍、甲基綠、美藍、孔雀綠和焦油紫等。

(2)細胞質染色劑用于細胞質的染色劑有合成染色劑中的曙紅、亮綠、橘黃G、酸性品紅、苦味酸和水溶性苯胺藍等。（3）脂質染色劑用于顯示脂質的染色劑有合成染色劑中的蘇丹III、蘇丹Iv、硫酸尼羅藍及油紅等。

第八十五頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三操作方法：脫蠟1．將兩個裝有二甲苯的染色缸，貼上脫蠟和透明；2．將待脫蠟的載玻片有蠟面的一面，朝向標簽方向，載玻片小心插入脫蠟缸的齒槽中，待30min，當蠟片中材料的周圍蠟熔去后，再轉移至透明缸中5～10min，然后再轉入染色等步驟。第八十六頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三染色方法：

二甲苯→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→30%乙醇→1%番紅水溶液1～12h→水洗（去多余染液）→35%酒精1～5min→50%酒精1～5min→70%酒精→1-5min→85%酒精1～5min→0.1%固綠（溶于95%酒精）10～40秒→純酒精（Ⅰ）30秒→純酒精（Ⅱ）30秒→1/2純酒精+1/2二甲苯5min→二甲苯5min→封藏第八十七頁，共九十六頁，編輯于2023年，星期三常用染色液的配制