激光拉曼光譜介紹課件

激光拉曼光譜&共聚焦顯微拉曼光譜儀激光拉曼光譜&共聚焦顯微拉曼光譜儀武漢大學(xué)測試中心2012.12—2013.01激光拉曼光譜（RS）@儀器分析實驗光散射現(xiàn)象為什么晴朗的天空呈現(xiàn)藍色？朝霞和晚霞呢？拉曼光譜的發(fā)現(xiàn)印度拉曼研究院

C.V.Raman是印度一位偉大的物理學(xué)家，他因為在光散射工作和發(fā)現(xiàn)拉曼效應(yīng)而獲得諾貝爾獎，當(dāng)時他是亞洲第一位獲此殊榮的科學(xué)家，他同時也作了有關(guān)聲學(xué)、光學(xué)、結(jié)晶動態(tài)學(xué)、顏色和它們在感知上的研究。拉曼光譜的發(fā)現(xiàn)研究太陽光對苯的散射現(xiàn)象時的“意外”發(fā)現(xiàn)第一臺拉曼光譜儀的簡易光路構(gòu)型拉曼光譜的基本原理高頻低頻斯托克斯線和反斯托克斯線對稱地分布于瑞利線的兩側(cè)，這是由于在上述兩種情況下分別相應(yīng)于得到或失去了一個振動量子的能量。反斯托克斯線的強度遠小于斯托克斯線的強度，這是由于Boltzmann分布，處于振動基態(tài)上的粒子數(shù)遠大于處于振動激發(fā)態(tài)上的粒子數(shù)。拉曼光譜的基本原理RamanspectrumofCCl4拉曼光譜的基本原理拉曼光譜的基本原理拉曼光譜的基本原理

Avoidanceoffluorescence:background-freeRamanspectra紅外拉曼分子振動譜吸收，發(fā)展較早平衡位置附近偶極矩變化不為零與拉曼光譜互補實驗儀器是以干涉儀為色散元件測試在中遠紅外進行，不受熒光干擾低波數(shù)（遠紅外）困難微區(qū)測試較難，光斑尺寸約10微米，空間分辨率差紅外探測器須噪聲高，液氮冷卻，且靈敏度較低多數(shù)須制備樣品水對紅外光的吸收分子振動譜散射，自激光后才發(fā)展平衡位置附近極化率變化不為零與紅外光譜互補實驗儀器是以光柵為色散元件測試在可見波段進行，有時受樣品熒光干擾，可采用近紅外激發(fā)低波數(shù)沒有問題共焦顯微微區(qū)測試，光斑尺寸可小到1微米，空間分辨率好CCD探測器噪聲低，熱電冷卻，靈敏度高無須制備樣品，且可遠距離測試沒有水對紅外光吸收的干擾散射信號量的總計算公式拉曼～10-30cm2/分子紅外～10-20cm2/分子熒光～10-16cm2/分子拉曼光譜的基本原理靈敏度低I入射=(103-105)I瑞利I瑞利=(103-106)I拉曼分子與光子作用截面（Cross-Section)

拉曼光譜的優(yōu)點和特點對樣品無接觸，無損傷；樣品無需制備；快速分析，鑒別各種材料的特性與結(jié)構(gòu)；顯微拉曼所須樣品量少，且適用樣品微區(qū)（1微米以下光斑）高空間分辨率(對包裹體,金剛石壓砧中的樣品等尤其有用)，能適合黑色和含水樣品；高、低溫及高壓條件下測量；光譜成像快速、簡便，分辨率高；儀器穩(wěn)固，體積適中，維護成本低，使用簡單。拉曼光譜的優(yōu)缺點優(yōu)點:可以得到高光譜分辨的譜圖不受溶劑水的影響可以方便的改變激發(fā)光的波長缺點:靈敏度低(表面吸附物種)1incidentphoton,10-6~-10共振拉曼光譜RRS激光共振拉曼光譜（RRS）產(chǎn)生激光頻率與待測分子的某個電子吸收峰接近或重合時，這一分子的某個或幾個特征拉曼譜帶強度可達到正常拉曼譜帶的102～106倍，并觀察到正常拉曼效應(yīng)中難以出現(xiàn)的，其強度可與基頻相比擬的泛音及組合振動光譜。與正常拉曼光譜相比，共振拉曼光譜靈敏提高，可用于低濃度和微量樣品檢測，特別適用于生物大分子樣品檢測。表面增強拉曼光譜SERS當(dāng)一些分子被吸附到某粗糙金屬，如金、銀、銅的表面時，它們的拉曼光譜強度會增加104～106倍，這種不尋常的現(xiàn)象被稱為表面增強拉曼散射效應(yīng)，簡稱表面增強拉曼光譜（SERS）。由于SERS有很高的靈敏度，能檢測吸附在金屬表面的單分子層和亞單分子層的分子，又能給出表面分子的結(jié)構(gòu)信息，因此它是一種表面研究的有效技術(shù)。SERS效應(yīng)只在少數(shù)基體表面能觀察到，其中銀、金、銅被廣泛做為SERS的金屬基體，它們能顯示出很大的增強效應(yīng)。鎳、鋁等少數(shù)金屬也能顯示出一定的增強作用，但增強因子小。金屬表面必須被粗糙化一定程度才能顯示出SERS效應(yīng)。實驗還表明，SERS強度與激發(fā)光頻率、入射角、吸附分子在金屬基體表面的覆蓋度、分子離基體表面的距離等有關(guān)。SERS的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用LabelimagingLabel-freeimagingHomogeneousassaysHighlyselective(multiplex)HighlysensitiveSimpledetectionprocessLimitedselectivityPooruniversalityLimitedsensitivityUnsatisfactorybiocompatibilityPoorspectral/physicalstabilityDifficultmodificationHighspatialresolutionAbundantchemicalinformationLackingstandarddatabasePoorspectralstabilityFromsingletonano-aggregateDevelopingadvancedshellmaterialsMulti-targetedimaging共焦顯微拉曼譜儀原理光源針孔的作用是將所形成的點光源成像到焦平面樣品上，實現(xiàn)了微小的照明區(qū)域。由于只有被照明的部分樣品散射或反射的光信號才會被接受，所以保證了顯微鏡的橫向空間分辨率。在光源照明區(qū)域內(nèi)，但不在焦平面上的樣品也會散射或反射光信號，背景上的雜散光因為處于樣品上離焦區(qū)域，所以被與光源針孔共焦的探測針孔所形成的空間濾波器強烈地衰減。這樣對信號的主要貢獻是處于焦平面上的樣品被顯微鏡所觀察的那一薄層的信號，保證了顯微鏡的縱向空間分辨率。共焦顯微拉曼譜儀原理共焦拉曼顯微鏡的工作原理如圖所示，即將激光束經(jīng)入射針孔（Ｈ1）聚焦于樣品表面，樣品表面的被照射點在探測針孔（Ｈ2）處成像，其信號由在Ｈ2之后的檢測器收集（光路如實線所示）；而當(dāng)激光在樣品表面是散焦時，樣品處的大部分信號被Ｈ2擋?。ü饴啡缣摼€所示），無法通過針孔到達檢測器。當(dāng)我們將樣品沿著激光入射方向上下移動，可以將激光聚焦于樣品的不同層，這樣所采集的信號也將來自于樣品的不同層，實現(xiàn)樣品的剖層分析。激光共聚焦顯微拉曼光譜系統(tǒng)英國RENISHAW公司拉曼光譜儀系統(tǒng)組成部分

激光共聚焦顯微拉曼光譜系統(tǒng)法國JY公司拉曼光譜儀系統(tǒng)組成部分不同焦長光譜儀的分辨率傅里葉變換拉曼光譜儀ConfocalRamanFT-Raman1.采用1064nm的Nd:YAG激光代替了通常的可見激光。2.采用Michelson干涉儀代替通常的光柵單色器；瑞利散射光的降低采用一組濾光片來實現(xiàn)（也稱光學(xué)過濾），它一般放在干涉儀前。3.檢測器采用對近紅外有靈敏效應(yīng)的Ge二極管和InGaAs檢測器。D.BruceChase，F(xiàn)ourierTransformRamanSpectroscopyJ.Am.Chem.SOC.1986,108,7485-7488傅里葉變換拉曼光譜儀的特點由于采用近紅外激光激發(fā)，可避免熒光干擾，擴大拉曼光譜的應(yīng)用范圍，有很高的信噪比；用近紅外光激發(fā)，能量低，可避免樣品的光解和熱解；傅立葉變換拉曼有分辨率高，波數(shù)精確和重現(xiàn)性好的優(yōu)點。測量精度可達到10~3cm-1，并且重現(xiàn)性好；傅立葉變換拉曼光譜儀的測量速度快，一次掃描可完成全波段掃描范圍測定；傅里葉變換拉曼光譜儀操作方便。不足之處：如單次掃描信噪比不高；低波數(shù)區(qū)掃描方面不如色散型拉曼光譜儀；水對近紅外有吸收，會影響測試靈敏度等等。傅里葉變換拉曼光譜的應(yīng)用聚（對苯撐）對苯二甲酰亞胺（左圖）和雞腿骨組織（右圖）的可見光拉曼和傅里葉變換拉曼光譜圖激光功率密度問題在共聚焦顯微拉曼儀器中，激光經(jīng)顯微鏡鏡頭聚焦于采樣點，即使使用的激光功率很低，到達樣品采樣點處的激光功率密度仍然很大?？紤]樣品的承受能力，激光功率密度不能太高，否則可能由于光熱或光解作用而使樣品發(fā)生變化。方法有:采用能量低的激發(fā)光降低激光功率:使用衰減片降低激光功率；小倍數(shù)的收集透鏡離焦:讓樣品脫離激光聚焦焦點，功率密度即成指數(shù)下降顯微:1mW/1m21108mW

/cm2常規(guī):100mW/1mm21104mW

/cm2距離(m)直徑(m)功率密度拉曼強度01100100106.90.25502516.80.04313rdx離焦方法原理離焦防止光解的例子鏡頭的選擇共聚焦拉曼譜儀通常備有幾個不同放大倍數(shù)或數(shù)值孔徑的鏡頭。要結(jié)合不同的實驗要求，綜合收集效率，空間分辨率及工作距離等幾個因素使用相應(yīng)的鏡頭：

如果需要高的空間分辨率則應(yīng)選擇高放大倍數(shù)的鏡頭；如50×、100×的鏡頭

對于易揮發(fā)，腐蝕性樣品的測試則應(yīng)選擇長工作距離的鏡頭，并且一般還要用PVC或PE薄膜包裹來保護鏡頭，或者可以在樣品上方加窗片來隔離，一可以有效的防止暴露在空氣而受到污染,二也可以有效的保護鏡頭如果要高的光收集效率，則選擇數(shù)字孔徑大（通常倍數(shù)是高的放大倍數(shù)）的鏡頭；具體考慮如下：是顯微鏡物鏡收集光和分辨物體細節(jié)的能力NA=n·sinn:鏡頭前空間中介質(zhì)的折射率，

：鏡頭孔徑張角的一半增大NA的方法：a.油?。蟮膎值b.高倍鏡頭－大的值c.蓋玻片校正－調(diào)整光行差fDNA大NA小數(shù)值孔徑檢測器的優(yōu)化強度與靈敏度的選擇,信號的binning處理，pinhole，slit的設(shè)置，CCD區(qū)域的設(shè)定-----強度與靈敏度是矛盾的統(tǒng)一當(dāng)檢測弱信號時軟件提供一種binning的方法，即犧牲譜圖的分辨率合并幾個象素信號的方法來提高信號強度。因此這就要考慮我們的實驗?zāi)康模P(guān)注的是強度還是光譜的分辨率，從而選取合適的binning；還有一種提高強度的方法即加大pinhole和slit，這就減弱了共焦性能，損失了空間分辨能力。而且pinhole和slit也有一個最佳值，超過這個數(shù)字的加大毫無意義；CCD區(qū)域的設(shè)定要根據(jù)拉曼光在CCD上的成像位置來確定，選定的CCD區(qū)域必須包括成像區(qū)域，太窄會丟失所需的信號，太寬則使噪音增加。入射收集方式和樣品處理樣品狀態(tài)處理，固體，液體的樣品濃度拉曼散射截面極小，要提高譜圖質(zhì)量，不僅在儀器上要提高各個元件的性能，優(yōu)化采譜參數(shù)，還應(yīng)盡量提高采譜體積內(nèi)的樣品量，如對于粉末樣品，壓片平整的表面就更利于拉曼信號的測試，液體樣品濃度高則信號強，盡量拉長光程。信號收集方式，垂直入射，側(cè)向入射為方便樣品的放置，有效收集拉曼信號，有垂直入射和用轉(zhuǎn)角鏡的側(cè)向入射兩種方式。對不便密封的溶液樣品可以將其放在樣品平臺的一側(cè)，利用轉(zhuǎn)角鏡側(cè)向入