抑制消減雜交

抑制消減雜交及其在魚類基因克隆中的應(yīng)用摘要：抑制消減雜交在研究差異基因表達(dá)上表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢，其運用在人類及高等脊椎動物中已很成熟，在對魚類的研究中還有待進(jìn)一步的發(fā)展。關(guān)鍵詞：魚類；抑制消減雜交；生殖與發(fā)育基因；免疫調(diào)控相關(guān)基因1引言隨著人類基因組計劃的完成及后基因組計劃的啟動，差異基因表達(dá)就成了一項熱門的技術(shù)。由于分子生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)的迅猛發(fā)展，在轉(zhuǎn)錄水平研究差異基因表達(dá)的方法也層出不窮。目前，研究較多的主要有mRNA差異顯示技術(shù)(DDRT-PCR)、代表性差異分析技術(shù)(RDA)、基因表達(dá)系列分析技術(shù)(SAGE)、cDNA微陣列技術(shù)(cDNAmicroarray)和抑制消減雜交技術(shù)(SSH)。其中抑制消減雜交(suppressionsubtractivehybridizationSSH)是一種將抑制PCR與消減雜交技術(shù)相結(jié)合的一種快速分離差異表達(dá)基因的方法，它將傳統(tǒng)的消減雜交方法與抑制PCR相結(jié)合，比較2個細(xì)胞群的mRNA以獲得差異表達(dá)的基因克隆，具有檢測的特殊性，在動物、植物、微生物的生殖和發(fā)育等相關(guān)領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。魚類中，抑制消減雜交的應(yīng)用僅限于生殖和發(fā)育相關(guān)基因和免疫調(diào)控相關(guān)基因的研究上。2SSH的原理和步驟示意圖2.1SSH的原理抑制消減雜交技術(shù)是由Diatchenko等［1于1996年以mRNA差別顯示技術(shù)為基礎(chǔ)建立起來的篩選未知差異表達(dá)基因的新技術(shù)。它主要基于最近出現(xiàn)的抑制PCR，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)(normalization或equalization)和消減雜交(subtractivehybridization)。抑制PCR通過利用含引物序列的雙鏈接頭(adaptor)充當(dāng)引物模板，使兩端接上同一接頭的非目的雙鏈片段具有反向末端重復(fù)序列，PCR中不能擴(kuò)增，從而達(dá)到抑制非目的片段而選擇性擴(kuò)增目的片段的目的。標(biāo)準(zhǔn)化步驟平衡了目的基因群中cDNA的豐度，即低豐度差異表達(dá)的基因不會丟失，而高豐度差異表達(dá)的基因又不會被過量分離。消減雜交則扣除了目的基因群(tester)與驅(qū)趕基因群(driver)間的同源序列。

2?2SSH的步驟示意圖（如圖1）SSH技術(shù)包括cDNA合成、RsaI酶切、接頭連接、兩輪雜交和兩輪PCR五個緊密關(guān)聯(lián)的步驟，最后獲得各差異基因的表達(dá)混合產(chǎn)物，可用于文庫構(gòu)建等后續(xù)研究。檢測r-cJM&n接頭刀tiK-;t(jr(DNAwithadaptor2檢測了呷(Ijrfg檢測r-cJM&n接頭刀tiK-;t(jr(DNAwithadaptor2檢測了呷(Ijrfg頭1)testercDKAwithfichptm'1笫廓朵空:混件拝本「ijoft的查比的驗辦穴退火secondhybridiationzmxsanp]c?s,血fresh(icrkt1uroddiiver?andanneal饒l輪雜交門rsthyhHHiza-litx'過駅的騎川JfcDNAdriverdJNA(ineACtis^；)H,b,G,也亠e補平末端fi11inthe：i>ndsa,d沒有擴(kuò)增noan＜）l辻icationW沒有擴(kuò)増noiwlilicationc線性擴(kuò)増linearanplifiratione描數(shù)擴(kuò)■牆expfflientialsnplificatiDn圖1抑制消減雜交示意圖（參考文獻(xiàn)⑴）3SSH的優(yōu)點和缺點SSH技術(shù)，綜合了mRNA差異顯示和代表性差異顯示兩種技術(shù)的特點，因此具備了兩項技術(shù)各自的優(yōu)點且相應(yīng)地改進(jìn)了各自的缺點。第一，提高了特異性，降低了假陽性率。這是SSH的最大優(yōu)點；第二SSH方法具有高度敏感性的特點，保證了低豐度mRNA也有被檢測的可能；第三，提咼了基因克隆的效率，大大地提高了信息量，更具代表性；第四，速度快,效率高；第五，程序相對簡單，操作簡便，僅需兩輪雜交，不需移出雜交復(fù)合體，接頭設(shè)計簡化，不需反復(fù)交換接頭，不必移出（或降解）接頭。但是，SSH技術(shù)也有自身的局限性。第一，該方法要幾微克量的mRNA,若是mRNA量不夠，那么低豐度的差異表達(dá)基因的cDNA很可能會檢測不到。第二，消減庫中的cDNA因為已被限制酶消化，不再是全長cDNA。第三，對材料要求較高,材料的背景差異不能太大。4SSH在水產(chǎn)中的應(yīng)用魚類生殖和發(fā)育相關(guān)基因的克隆胚胎的不同發(fā)育階段，分化產(chǎn)生不同的組織和器官，顯然這其中有不同的基因表達(dá)，因此發(fā)育過程中調(diào)控基因的分離與鑒定是發(fā)育分子生物學(xué)的重要研究內(nèi)容。SSH克隆到的發(fā)育相關(guān)基因，目前都是以雌核發(fā)育銀鯽和兩性生殖彩鯽為材料獲得的。銀鯽是一種雌核發(fā)育生殖魚類，它通過抑制第一次減數(shù)分裂（不排出第一極體）而保持染色體的完整。這種卵母細(xì)胞成熟期間的紡錘體行為與雌雄異體的魚類是顯著不同的。由于其遺傳背景和繁殖模式獨特，從而是了解卵母細(xì)胞成熟分裂調(diào)控機(jī)制的理想的模式系統(tǒng)。運用SSH技術(shù)，在雌核發(fā)育銀鯽和兩性生殖彩鯽中，F(xiàn)an等⑵發(fā)現(xiàn)了ZP3,Xie等⑶發(fā)現(xiàn)了CyclinA2、CB102、YA2[4],Wen等⑸發(fā)現(xiàn)了FSTRAP等一些與魚類生殖和發(fā)育相關(guān)基因。魚類免疫調(diào)控相關(guān)基因的克隆每個健全的個體都在通過多種防衛(wèi)機(jī)制抵御外來病原體的侵犯以保護(hù)自己。這些機(jī)制主要有物理屏障，細(xì)胞吞噬和殺傷、補體系統(tǒng)，以及血液內(nèi)多種因子的作用。對免疫系統(tǒng)的研究表明，作為低等脊椎動物的魚類，具有先天性和獲得性的免疫原性，同源于哺乳動物的免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)在魚類抵抗疾病，適應(yīng)外界環(huán)境等方面有重要的作用。因此克隆編碼免疫系統(tǒng)的基因，是研究魚類基因工程疫苗,提高魚類適應(yīng)能力，抵抗疾病，從而增高存活率的一個重要步驟。王傳娟等⑹總結(jié)出用SSH技術(shù)已經(jīng)鑒定出了魚的許多免疫相關(guān)基因，如白細(xì)胞介素、趨化因子、腫瘤壞死因子、溶菌酶、NKEF、補體、干擾素及急性期蛋白基因等，對它們的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了較為深入的研究。張義兵等⑺以紫外線滅活的GCHV（草魚出血病病毒）誘導(dǎo)過的細(xì)胞為檢測子（Tester）,以未經(jīng)病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞為驅(qū)動子（Driver），構(gòu)建魚類細(xì)胞抗病毒基因差減cDNA文庫，并從文庫中分離鑒定出Statl、Jakl、Mx、Viperin、IRF和TLR3等抗病毒或免疫相關(guān)基因在內(nèi)的69個基因，其中46個為已知基因同源物，28個基因在魚類中為首次報道［8］，對認(rèn)識魚類細(xì)胞抗病毒免疫的分子機(jī)制有重要意義。5展望SSH技術(shù)在魚類基因克隆中的應(yīng)用，取得了很多的成果，克隆了一系列的新基因，為深入研究魚類發(fā)育的時空表達(dá)特征和免疫調(diào)節(jié)機(jī)理打下良好的基礎(chǔ)，但成果有限。因為在世界范圍內(nèi)，僅有幾個研究小組對為數(shù)不多的材料進(jìn)行研究，研究的領(lǐng)域也僅局限于發(fā)育和免疫，這對于全面揭示魚類的生理過程和生命特征是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。隨著越來越多的研究者參與，有關(guān)代謝過程的調(diào)控基因、有關(guān)疾病相關(guān)基因、以及有關(guān)病原微生物的毒性基因的研究也會得到開展。抑制消減雜交（SSH）高靈敏、易操作、高效富集低表達(dá)豐度基因和均一化目的基因片斷，廣泛用于差異表達(dá)基因的分離和cDNA文庫構(gòu)建?？茖W(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，使得SSH與一些新技術(shù)結(jié)合并進(jìn)行大規(guī)模差異基因篩選成為可能,如基因芯片技術(shù)。目前已有人將SSH與Microarray結(jié)合用于差異基因的大規(guī)模篩選⑼。綜上所述，SSH方法是一種高效便捷的鑒別差異表達(dá)基因的新方法。該方法的出現(xiàn)和應(yīng)用已日益受到人們的重視并將會在解碼生命，造福人類的探索中發(fā)揮積極的作用。參考文獻(xiàn)DiatchenkoL,LauYFC,CampbellAP,etal.Suppressionsubtractivehybridization:Amethodforgeneratingdifferentiallyregulatedortissue-specificcDNAprobesandlibraries[J].ProcNatlAcadSciUSA,1996,93:6025-6030.FanLC,YangST,GUIJF.DifferentialscreeningandcharacterizationanalysisoftheeggenvelopeglycoproteinZP3cDNAsbetweengynogeneticandgonochoristiccruciancarp[J].CellResearch,2001,11(1):17-27.XieJ,WenJJ,YangZA,etal.CyclinA2Isdifferentiallyexpressedduringoocytematurationbetweengynogeneticsilvercruciancarpandgonochoristiccolorcruciancarp[J].JExpZool,2003,295A(1):1-16.XieJ,WenJJ,ChenB,etal.DifferentialgeneexpressioninFully-grownoocytesbetweengynogeneticandgonochoristiccruciancarps[J].Gene,2001,271:109-116.WenJJ,XieJ,LiuSG,etal.DifferentialexpressionandcharacterizationanalysisofanewgenewithWDdomainsinfishoogenesis[J].ScienceinChina,2001,44:541-553.王傳娟,張曉華,賈愛榮.抑制性消減雜交技術(shù)在養(yǎng)殖魚類免疫基因克隆中的應(yīng)用[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2007,14(3):504-512.張義兵，石耀華，桂建芳.魚類培養(yǎng)細(xì)胞抗病毒基因差減cDNA文庫的構(gòu)建[J].水生生物學(xué)報,2003,27(2):113-118.張義兵，張奇亞，徐德全，等.從滅活病毒誘導(dǎo)的培養(yǎng)細(xì)胞中鑒定魚類抗病毒相關(guān)基因[J].科學(xué)通報，2003，48(5):457-