生化實驗技術(shù)與方法

生化實驗技術(shù)與方法第一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三實驗操作硅膠薄板的制備：注意膠要均勻。1.2g硅膠H加4.0ml0.5%CMC溶液，研磨數(shù)分鐘后，倒在預(yù)先準備好的玻璃板上，鋪開，使?jié){液分部均勻，放在水平臺上，自然晾干。第二頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三2.板的處理：薄板的活化：105℃，0.5h

薄板的刮分：徑向?qū)游龅膬?yōu)點是：樣品展層后圖譜呈弧形帶狀，使Rf值相近的化合物也能清楚地分開。3.點樣：樣品為鼠李糖、木糖和葡萄糖。點樣量8-10μl。注意：點樣點的直徑小于5mm，點樣要少量多次，吹風(fēng)機風(fēng)力不能過大。4.展層：展層溶劑為：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（體積比），新鮮配制。5.顯色：顯色劑：苯胺-二苯胺-磷酸試劑。第三頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三20mm10mm30mm8mm第四頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三第五頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三苯丙氨酸解氨酶的提取純化

實驗原理苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonialyase，簡稱PAL；EC4.3.1.5）是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切有關(guān)，在植物正常生長發(fā)育和抵御病菌侵害過程中起重要作用。本次實驗是以銀杏葉為原料采用分步鹽析、透析脫鹽、離子交換等方法得到苯丙氨酸解氨酶。第六頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三儀器高速冷凍離心機；恒溫水浴；電子天平；柱層析系統(tǒng)試劑酶提取液：0.1mol/L硼酸-硼砂緩沖液（含1mmol/LEDTA、20mmol/Lβ-巰基乙醇）固體硫酸銨0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH8.0，含0.5mmol/LEDTA，2.5%甘油，20mmol/Lβ-巰基乙醇）；DEAE纖維素52第七頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三操作步驟酶液提?。?）植物材料2g，剪成小段，加入5倍體積的酶提取液，于冰浴上用研缽研磨。（2）將已勻漿的酶液轉(zhuǎn)入離心管，4000r冷凍離心30min。（3）取離心后的上清液（酶粗提液），量出其體積，留樣0.5ml

。硫酸銨分級沉淀酶蛋白（1）根據(jù)實際體積、溫度和硫酸銨飽和度用量表，算出達到38%飽和度應(yīng)加入酶粗提液中的硫酸銨量，并稱硫酸銨。（240g/L)（2）將酶液倒入燒杯內(nèi)，邊緩慢攪拌邊緩慢加入稱好的固體硫酸銨，待全部加完后，再緩慢攪拌10min；然后于9000r離心15min，保留上清液于燒杯內(nèi)。（3）根據(jù)硫酸銨飽和度用量表，算出從38%到75%飽和度所需硫酸銨用量。（222g/L)（4）按上述（2）步同法處理，離心后，棄去上清液，保留沉淀。（5）將沉淀溶于2ml酶抽提液中,留樣0.5ml

。透析脫鹽酶液裝入透析袋，放入低鹽溶液中透析過夜,留樣0.5ml。第八頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三銀杏葉2g+10ml酶提取液研磨4000rpm、30min取上清液加硫酸銨至飽和度38%

9000rpm、15min取上清液加硫酸銨至飽和度75%

9000rpm、15min取沉淀溶于2ml酶抽提液透析第九頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三純化離子交換層析DEAE纖維素（1）稱取DEAE纖維素52干粉1~1.5g，加20ml的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH8.0）浸泡4h以上（或浸泡過夜）。（2）裝柱：把預(yù)處理的DEAE纖維素52裝柱。裝柱完成后，用2~3個床體積的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH8.0）洗脫平衡該柱。（3）上樣：把所得的酶洗脫液小心地注入柱床面中央，上樣結(jié)束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸鹽緩沖液2~3cm厚液層。注意上樣開始就收集流出液。（4）洗柱：約用2倍床體積的A液（0.02mol/L磷酸鹽緩沖液）及B液（含1mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液）洗柱，按洗脫管編號，取A280值高的管中洗脫液測其PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脫液，并量出其體積（ml）。第十頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三苯丙氨酸解氨酶的活力測定

PAL催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm處有最大吸收值。若酶的加入量適當(dāng)，A290升高的速率可在幾小時內(nèi)保持不變，因此通過測定A290升高的速率以測定PAL活力。規(guī)定1h內(nèi)A290增加0.01為PAL的一個活力單位。第十一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三取試管2支，按表中所述（0號為調(diào)零管，1號為測定管。注意按表格從上到下的順序加入試劑）。（單位：ml）

試劑類型調(diào)零管（0號）待測管（1號）pH8.7的0.1mol/L硼酸緩沖液320.1mol/LL-苯丙氨酸溶液0

1樣品（酶）溶液0.1

0.1將各管混勻，放入40℃恒溫水浴保溫1h（準確計時），到時各加0.2ml2mol/LHCl終止反應(yīng)。紫外分光光度于波長290nm處測定1號管的A290。第十二頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三蛋白質(zhì)測定（考馬斯亮藍染色法）取酶液0.1ml，用蒸餾水稀釋至5ml取試管8支，按下表加入各溶液：將上述各試管混勻，靜置2min，測定各管的A595。

試管編號01234567標(biāo)準蛋白質(zhì)溶液（ml）50ug/ml00.20.40.60.81.0//稀釋酶液（ml）//////1.01.0蒸餾水（ml）2.01.81.61.41.21.01.01.0考馬斯亮藍（ml）2.02.02.02.02.02.02.02.0第十三頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三PAL總活力、比活力、蛋白質(zhì)含量的計算步驟體積（ml）蛋白質(zhì)含量（mg）總活力（m）比活力（m/mgprotein）粗提硫酸銨沉淀透析離子交換層析第十四頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

（SDS－PAGE）測定蛋白質(zhì)分子量

原理：SDS－PAGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量。電泳遷移率與顆粒的電荷、形狀、大?。ǚ肿恿浚┯嘘P(guān)，如電荷、形狀都一樣，則電泳遷移率只與分子量有關(guān)。第十五頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三SDS是在PAG系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基磺酸鈉）。

SDS的作用：1.能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑（巰基乙醇）能使二硫鍵斷裂，使蛋白質(zhì)完全變性。2.能與變性的蛋白質(zhì)按比例結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的特點：1.由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異。2.復(fù)合物都是橢圓棒狀，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的形狀差異。因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。第十六頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三測定各條帶的相對遷移率，根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對遷移率，以相對遷移率為橫坐標(biāo)，lgMr為縱坐標(biāo)作標(biāo)準曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對遷移率從標(biāo)準曲線上查出它們的lgMr，再換算成蛋白質(zhì)分子量．第十七頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三

在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)。若將已知分子量的標(biāo)準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準曲線上求得分子量。第十八頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三操作如同PAGE。樣品：蛋白質(zhì)要完全變性。蛋白質(zhì)+SDS+巰基乙醇100℃2-5分鐘標(biāo)準蛋白市場有售，被測蛋白質(zhì)的分子量應(yīng)在標(biāo)準蛋白分子量以內(nèi)。染色：考馬氏亮藍、銀染色該法測定蛋白質(zhì)分子量的局限性：1.蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。2.電荷異常的蛋白質(zhì)（如組蛋白，帶大量正電荷）3.結(jié)構(gòu)異常，不于分子量呈線性關(guān)系（如膠原蛋白）4.帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如糖蛋白）第十九頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三實驗操作編號溶液名稱12%分離膠4%濃縮膠130%Acr–0.8%Bis2.0ml0.2ml2pH8.8Tris-HCI1.25ml-3pH6.8Tris-HCI-0.375ml410%SDS50ul15ul5TEMED5ul5ul610%AP50ul15ul7H2O1.65mlo.9ml總體積約5mL約1.5mL

膠的制備第二十頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三標(biāo)準蛋白質(zhì)分子量兔磷酸化酶B97400牛血清白蛋白66200兔肌動蛋白43000牛碳酸酐酶31000胰蛋白酶抑制劑20100雞蛋清溶菌酶14400第二十一頁，共二十三頁，編輯于2023年，星期三樣品的處理：按0.5mg蛋白質(zhì)/1mL溶液的比例向標(biāo)準蛋白質(zhì)或待測樣品中加入樣品溶解液（小試管），充分溶解后，置沸水浴3min，取出冷至室溫。加樣量：20μl，標(biāo)準蛋白（M）全加。電泳：點樣端負極，恒壓：開始80V，待樣品進入分離膠后120V。電極緩