藏藥甘青烏頭化學(xué)成分的研究-大學(xué)論文

藏藥甘青烏頭化學(xué)成分的研究摘要：本文研究目的:研究甘青烏頭（Aconitumtanguticum(Maxim.)Stapf）的化學(xué)成分。方法：全株甘青烏頭粉末在乙醇中超聲提取，回收提取液，得到浸膏。對浸膏采取萃取，旋轉(zhuǎn)蒸餾等一系列操作，采用硅膠，SephadexLH-20凝膠，半制備高效液相等多種分離純化技術(shù)進(jìn)行化合物的洗脫分離純化。通過MS，核磁共振等波譜技術(shù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。結(jié)果從甘青烏頭中分離鑒定得到2個(gè)化合物。分別為化合物1：咖啡酸(Coffeeacid)和化合物2：3,4-二羥基苯乙醇(3,4-dihydroxyphenethylalcohol)。關(guān)鍵詞：甘青烏頭；烏頭屬植物；化學(xué)成分；結(jié)構(gòu)鑒定Abstract:Inthispaper,weisolatedtwocompounds1:Coffeeacidand2:3,4-dihydroxyphenethylalcoholfromthewholeplantofAconitumtanguticum.

Chemicalconstituentswereisolatedandpurifiedthetitleplantbuusingacombinationofvariouschromatographictechniquesincludingcolumnchromatographyoversilicagel,SephadexLH-20gel,PreparativeHPLC.TheirstructureweredeterminedbyNMR,MSspectrogram.Keywords:Aconitumtanguticum;thegenusAconitum;Chemicalcomposition;Structureidentification1.前言1.1烏頭屬簡介烏頭屬（Aconitum）植物屬于毛茛科（Ranunculaceae）,全世界約有350種，廣泛分布于北半球溫帶地區(qū)。我國烏頭屬植物約有200種，分布廣泛，除海南外，臺(tái)灣和大陸各省區(qū)都有分布大多數(shù)分布于西南橫斷山區(qū)，如云南北部、四川西部、西藏東部的高山地帶，其次分布于東北各省[1]。其中，青藏高原及其臨近地區(qū)，包括四川、云南、西藏、青海、甘肅和寧夏是烏頭屬植物最豐富的地區(qū)，共有該屬植物的全部3亞屬約170個(gè)種[2]。在豐富的藥用植物資源中，烏頭屬植物是被子植物中較大的藥用屬，有豐富的藥用品種。烏頭屬植物是傳統(tǒng)的藥用植物，在我國烏頭屬植物有著悠久的藥用歷史，是我國各民族傳統(tǒng)醫(yī)藥中常用的有毒植物藥物。在豐富的藥用植物資源中，烏頭屬植物是被子植物中較大的藥用屬，有豐富的藥用品種。烏頭屬植物多具有祛風(fēng)除濕和溫經(jīng)止痛之功效，主治跌打損傷、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性疼痛、中風(fēng)癱瘓、胃冷痛、胃腸炎、月經(jīng)不調(diào)和癰疽瘡毒等癥，但是，烏頭屬植物多具有顯著的毒性，毒副作用成為限制烏頭屬植物藥用的主要因素。我國各民族在長期的生產(chǎn)生活實(shí)踐中，積累了豐富的烏頭屬藥用植物“制毒”、用藥經(jīng)驗(yàn)，藏、苗、維、土家等我國少數(shù)民族在烏頭屬植物藥用方面更因環(huán)境、文化、醫(yī)學(xué)理論的各異而形成了不同用藥習(xí)慣與方法[3]。烏頭屬植物是傳統(tǒng)的藥用植物，在我國約有76種可供藥用，常用藥材主要有烏頭(川烏)、附子、北烏頭(革烏)、黃花烏頭（關(guān)白附)、短柄烏頭（雪上一枝蒿）和甘青烏頭等[4]。頭屬植物具有較高的藥用價(jià)值和開發(fā)前景。但同時(shí)烏頭屬的植物又具有極大毒性，臨床用之得當(dāng)，每能起頑疾;用之不適，則有嚴(yán)重的毒副作用。地方和民間可用的藥用種主要有鐵棒錘、黃草烏、瓜葉烏頭和聚葉花草烏頭（活血蓮）等。近年來其他許多品種也有大量生產(chǎn)和應(yīng)用，如甘肅產(chǎn)的高烏頭，其根含拉馬巴烏頭堿，有良好的鎮(zhèn)痛作用，可用于治療胃癌、肝癌和肺癌等，且無成癮性，現(xiàn)已提取生產(chǎn)，而且引種栽培已成功[5]。伏毛鐵棒錘是寧夏回族民間用藥，經(jīng)化學(xué)成析和藥理研究，發(fā)現(xiàn)所含總生物堿有較強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛和局麻作用，現(xiàn)已成為當(dāng)?shù)卮笞谏唐匪幉腫6]。1.2烏頭屬藥用植物的毒性研究據(jù)《中國有毒植物》記載，我國有毒植物約有1300種，分布于140科，如毛茛科、百合科、豆科和杜鵑花科等。毛茛科是含有毒植物種類最多的科之一，約20屬的植物有毒。其中烏頭屬是我國最早記載的有毒植物。在我國本草著作誕生以前，烏頭是以“堇”的名稱出現(xiàn)的，左丘明《國語》記載有“堇于肉”用以毒人，堇就是烏頭。前漢劉安編著的《淮南子》一書中則更明確地指出“天下之兇藥，莫兇于雞毒”，雞毒就是烏頭。據(jù)考證，作為狩獵毒物的烏頭，可能是東鎢各國的主要箭毒原料。由此可見，烏頭屬植物不僅具有藥理活性，而且也具有較強(qiáng)的毒性。據(jù)《中國植物志》(27卷)記載，烏頭屬大多數(shù)植物的根或者草均具有較強(qiáng)的毒性，有報(bào)道生川烏的塊根2-4g即可使人致死。近年來，烏頭屬植物及其制劑的中毒在我國頗為多見，死亡率較高。從化學(xué)成分看，烏頭類的雙酯型生物堿既是該類植物的生理活性物質(zhì)，同時(shí)也是引起中毒的主要毒性物質(zhì)。如烏頭堿口服0.2mg即可中毒，3-5mg可使人致死;肌肉注射0.2-0.3mg可引起死亡。從毒性角度來看，烏頭類中藥中的主要毒性成分為雙脂型生物堿、單脂型生物堿和氨基醇型生物堿。其中雙脂型生物堿的毒性最大，主要有烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿3種，屬于難溶于水的脂溶性成分；單脂型生物堿是雙脂型生物堿C8位上的乙?；馐ヒ环肿右宜岷蟮漠a(chǎn)物。屬于親水性成分，毒性較小，為雙脂型生物堿的1/2000；胺基醇型生物堿是脂型生物堿C14位上苯甲脂酰基水解失去一分子苯甲酸后的產(chǎn)物，屬強(qiáng)親水性成分，毒性甚微，僅是雙脂型生物堿的1/200-1/4000。通常認(rèn)為這3類生物堿既是烏頭類中藥的有效成分，也是其毒性成分[7]。烏頭經(jīng)過傳統(tǒng)的炮制方法如鹽溶液浸泡、水煮、硫磺熏等，雙酯型烏頭堿轉(zhuǎn)化成烏頭次堿和烏頭原堿，毒性降低，但其藥物效應(yīng)并未明顯降低。烏頭類生物堿中毒癥狀出現(xiàn)很快，主要表現(xiàn)為流誕、惡心、嘔吐、腹瀉、頭昏、口舌四肢及全身發(fā)麻、呼吸困難、手足抽搐、神志不清、血壓及體溫下降和心律紊亂等，最后因呼吸及心臟衰竭而死亡。烏頭堿毒性主要是對神經(jīng)和心血管系統(tǒng)造成嚴(yán)重傷害。烏頭堿先興奮后麻痹感覺神經(jīng)和中樞神經(jīng)，其次是興奮膽堿能使神經(jīng)和呼吸中樞而出現(xiàn)一系列M樣和N樣癥狀，最后則由于呼吸麻痹和中樞抑制而導(dǎo)致機(jī)體死亡；心臟的毒性是其對鈉通道的激動(dòng)作用。心律失常、室顫以及猝死是烏頭堿導(dǎo)致心肌興奮性增高、促進(jìn)膜去極化而產(chǎn)生異位節(jié)律的結(jié)果。研究證明，奎尼丁和裸翠雀亭等可抑制心肌細(xì)胞鈉離子內(nèi)流，而能對抗烏頭堿引起的心律失常；高濃度的鎂離子可抑制烏頭堿引起的室顫與碎死[8]。烏頭堿對乳鼠心肌細(xì)胞有明顯的氧化損傷作用，同時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性[9]。烏頭堿中毒后用阿托品解毒最有效，也可用普魯卡因。由于烏頭屬藥用植物大多毒性較強(qiáng)，因此這類藥物一般要經(jīng)過炮制后才能用于臨床。常用的炮制方法有鹽溶液浸泡、水煮、硫磺熏等多種方法，臨床應(yīng)用烏頭屬藥用植物時(shí)，除經(jīng)炮制降低其毒性外，還應(yīng)嚴(yán)格控制其用量、注意配伍禁忌、延長煎煮時(shí)間來預(yù)防這類藥物中毒事件的發(fā)生。1.3甘青烏頭簡介甘青烏頭Aconitumtanguticum為毛茛科烏頭屬植物甘青烏頭的干燥全草，是多年生草本植物，塊根小，紡錘形或倒圓錐形，長約2厘米，莖高8-50厘米，不分枝或分枝?；~7-9枚，葉片圓形或圓腎形，頂生總狀花序有3-5花；苞片線形，萼片藍(lán)紫色，偶爾淡綠色，上萼片船形，下萼片寬橢圓形或橢圓狀卵形；花瓣稍彎，瓣片極小，種子倒卵形，具三縱稜，只沿稜生狹翅，7-8月開花[10]。生長于海拔3200-4800m的高山草甸及碎石帶，主要分布于青海東部、西藏南部、甘肅南部、四川西部和云南西北部，陜西秦嶺也有分布，為藏醫(yī)常用藥物榜嘎的藥材來源之一。榜嘎始載于藏醫(yī)的醫(yī)藥古籍《月王藥診》(公元710年)中，其后《四部醫(yī)典》、《四部醫(yī)典注釋本》、《晶珠本草》等歷代藏醫(yī)藥書籍中均有記述。榜嘎性涼、味苦，有小毒，具清熱解毒功效，多入丸散用于治療傳染病發(fā)熱，流行性感冒和食物中毒等?，F(xiàn)代藥理研究表明甘青烏頭具有抗炎，抗病毒，抗癌等多種藥理活性[11]。甘青烏頭內(nèi)的生物堿類化合物具有心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎、抗病毒、保肝、抗癌等多方面的藥理活性。二萜類化合物是其中一類，這類化合物的多數(shù)都具有α、β-不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)片斷目前發(fā)現(xiàn)的二萜類生物堿大部分在藥理方面表現(xiàn)為既是有效成分又是毒性成分，它們的結(jié)構(gòu)和活性之間有著密切的關(guān)系。烏頭堿類化合物的各種單體對急性炎癥模型均具有抑制作用，僅在強(qiáng)度上稍有差異；而對慢性炎癥的作用,不同的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果有差異。二萜生物堿是該屬植物的主要及特征性化學(xué)成分。實(shí)驗(yàn)研究表明它們中間很多具有較強(qiáng)的生物活性，具有很好的研究前景和應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。目前國內(nèi)外對于甘青烏頭的生物活性研究還未見報(bào)道[12]。2.實(shí)驗(yàn)部分2.1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑所用試劑：純凈水、蒸餾水、甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚。顯色劑：5%的稀硫酸溶液，固體碘。所用儀器：產(chǎn)品指標(biāo)：粒度：100-200，200-300，300-400mm的柱層層析硅膠，加熱減量<2.0%,氯化物<0.02%,鐵<0.02%，pH（10%水懸浮液）6.0-7.0；廠地：青島海洋化工廠分廠。MCI-gelCHP-20P(75-150μm)規(guī)格的填充材料：MCI。Merck公司生產(chǎn)的SephadexLH-20凝膠。硅膠板高效板，GF254，規(guī)格：200×200mm,厚度：0.20-0.25mm，產(chǎn)地：青島海洋化工廠分廠。不銹鋼電熱板，SG-1501A，廠地：上海碩光電子科技有限公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，規(guī)格：N-1100D-WD（18ml/min），廠地：云南科儀化玻有限公司。SHZ-D循環(huán)水式真空泵，產(chǎn)地：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。一次性使用無菌注射器，棉花，廠地：南寧雙健醫(yī)療器械有限責(zé)任公司。數(shù)控超聲波清洗器，規(guī)格：AS20500A，廠地：云南科儀化玻有限公司。DF-4型壓片機(jī)，廠地：天津市港東科技發(fā)展有限公司。高效液相色譜儀規(guī)格：1260，編號：S20120834，廠地：云南科儀化玻有限公司。400M（Bruker）核磁共振儀，廠地：美國。2.2甘青烏頭浸膏的提取與洗脫分離方法2.2.1化合物1的提取與洗脫分離5.4Kg全株甘青烏頭粉末在95%的乙醇中超聲提取11次，每次3小時(shí)，把每一個(gè)乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸出溶劑，回收利用。得到浸膏794.0g，用適量的40℃熱水?dāng)嚢枞芙饨?，等到冷卻后倒入適量的石油醚進(jìn)行萃取，分離石油醚相作旋蒸得到石油醚萃取部分的浸膏為：101.0g；再用氯仿萃取水相，蒸出提取液后得到浸膏：71.0g；最后用乙酸乙酯萃取，蒸出提取液后得到浸膏：61.0g。水相部分浸膏：523.0g。61g乙酸乙酯部分的浸膏和50.0g硅膠拌樣，約800mL，387.0g硅膠填柱。用乙酸乙酯：甲醇=2：1的混合溶劑洗脫得組分A，再過二次凝膠（純甲醇作為洗脫劑），通過TLC合并后得樣品B1、B2。樣品B2過液相，以甲醇：水=3：7的洗脫劑沖洗，得化合物1?；衔?淡綠色固體，熒光弱顯，碘顯呈黃色，烤板呈淡褐色，m=7.20mg，用石油醚：乙酸乙酯=4：3的體系作為展開劑，Rf=0.33。2.2.2化合物2的提取與洗脫分離71.0g浸膏來自氯仿部分加入甲醇和乙酸乙酯的混合溶劑溶解后和60.0g硅膠拌樣，用495.0g（200-300目）的硅膠填柱。當(dāng)洗脫劑為乙酸乙酯時(shí)洗脫下來的樣品量（17.0g）。標(biāo)志為：D。樣品D再過MCI，以甲醇和水作為混合洗脫體系，甲醇百分含量為：60%時(shí)洗脫下來的樣品D1的量（8.0g）。樣品D1過凝膠用純甲醇為洗脫劑，經(jīng)TLC顯色合并后過半制備高效液相，得到化合物2。2.3化合物的洗脫和分析鑒定2.3.1樣品洗脫分離技術(shù)原理柱層析硅膠：是具有固體特性的膠態(tài)體系，由形成凝集結(jié)構(gòu)的膠體粒子構(gòu)成。膠體粒子的集合體的間隙形成試劑柱層析硅膠顆粒內(nèi)部的微孔隙結(jié)構(gòu)。因此，它是一種具有豐富微孔結(jié)構(gòu)，高比表面積、高純度、高活性的優(yōu)質(zhì)吸附材料。柱層析硅膠精選透明度高的優(yōu)質(zhì)硅膠制成，優(yōu)良的吸附性能，對性質(zhì)、結(jié)構(gòu)相似乃至同分異構(gòu)體都有理想的分離功能。柱層析硅膠具有良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性能，從多組分溶液中有選擇地吸附提純同分異構(gòu)體組分。柱層析硅膠純度高達(dá)99%以上，與有機(jī)柱填料相比，硅膠為固體以SiO2為基質(zhì)的膠體，結(jié)構(gòu)致密。高效液相色譜儀（HPLC）：高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附解吸的分配過程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。2.3.2化合物結(jié)構(gòu)分析鑒定方法技術(shù)原理核磁共振儀（NMR）：是一種生物磁自旋成像技術(shù)，它是利用原子核自旋運(yùn)動(dòng)的特點(diǎn)，在外加磁場內(nèi)，經(jīng)射頻脈沖后產(chǎn)生信號，用探測器檢測并輸入計(jì)算機(jī)，經(jīng)過處理轉(zhuǎn)換在屏幕上顯示圖像。在利用核磁共振的原理分別對化合物進(jìn)行檢測，利用核磁技術(shù)能更快更準(zhǔn)確的分析出實(shí)驗(yàn)所得化合物的成分，并能寫出它的化學(xué)式，對實(shí)驗(yàn)的鑒別起到了最重要的作用。是本實(shí)驗(yàn)最重要的一個(gè)部分。通過對比該化合物文獻(xiàn)的核磁譜圖就能充分的肯定實(shí)驗(yàn)所提取化合物。質(zhì)譜（MS）：是一種與光譜并列的譜學(xué)方法，通常意義上是指廣泛應(yīng)用于各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域中通過制備、分離、檢測氣相離子來鑒定化合物的一種專門技術(shù)。質(zhì)譜法在一次分析中可提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，將分離技術(shù)與質(zhì)譜法相結(jié)合是分離科學(xué)方法中的一項(xiàng)突破性進(jìn)展。質(zhì)譜儀器一般由樣品導(dǎo)入系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。2.3.3化合物1的分析鑒定咖啡酸(Coffeeacid)。ESI-MSm/z:179[M－H]－,203[M＋Na]+;1H-NMR(400MHz,CO3OD)δ:6.23(1H,d,J=16.0Hz,H-7),6.77(1H,d,J=8.4Hz,H-5),6.92(1H,dd,J=8.4,1.6Hz,H-6),7.03(1H,d,J=1.6Hz,H-2),7.49(1H,d,J=16.0Hz,H-8);13C-NMR(100MHz,CO3OD)δ:115.0(C-2),116.5(C-5),116.7(C-8),122.7(C-6),128.0(C-1),146.2(C-7),146.7(C-3),149.2(C-4),170.3(C-9)。與參考文獻(xiàn)[13]基本一致。2.3.4化合物2的分析鑒定3,4-二羥基苯乙醇(3,4-dihydroxyphenethylalcohol)。ESI-MSm/z:153[M－H]－,177[M＋Na]+;1H-NMR(400MHz,CO3OD)δ:2.66(2H,t,J=7.2,7.2Hz,H-7),3.67(2H,t,J=7.2,7.2Hz,H-8),6.53(1H,d,J=8.0Hz,H-6),6.66(1H,s,H-2),6.68(1H,d,J=8.0Hz,H-5);13C-NMR(100MHz,CO3OD)δ:39.6(C-7),64.6(C-8),116.2(C-5),117.0(C-2),121.2(C-6),131.7(C-1),144.5(C-4),146.0(C-3)。與參考文獻(xiàn)[14]基本一致。3.參考文獻(xiàn)[1].傅立國，陳潭清，郎楷永等.中國高等植物(第三卷)[M].青島：青島出版社，2000:404.[2].肖小河，陳士林，陳善墉.中國烏頭屬分布式樣的數(shù)值分析[J].植物學(xué)通報(bào)，1942,9(1):46-49.[3].李志勇，李彥文，圖雅，黃秀蘭，張嫚，崔箭.烏頭屬植物在少數(shù)民族醫(yī)藥中的應(yīng)用[J].中央民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），第19卷第2期，2010.5.[4].饒冉.烏頭屬藥用植物研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012,40(29):14227-14230.[5].張繼，王一峰.高烏頭資源的開發(fā)利用研究[J].中國野生植物資源，1998,17(1):10-12.[6].陳永康，劉茂坤.家種與野生雪上一枝篙總生物堿毒性及藥理的比較研究[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，1997(1):38.[7].周玲.烏頭類中藥化學(xué)成分及其生物堿含量測定方法的研究概況[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2011,9(2):223-224.[8].周遠(yuǎn)鵬等.附子及其主要成分的藥理作用和毒性[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1983,18(5):394-400.[9].王衍堂，李宏霞.烏頭堿對乳鼠心肌細(xì)胞的毒性作用[J].華西藥學(xué)雜志，2007,22(1);4-6.[10].徐璐，李艷茸，李春，林麗美等.藏藥甘青烏頭化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，第38卷第17期，2013.9.[11].羅明，林麗美，李春，王智民，郭五保.藏藥甘青烏頭化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志，第37卷9期，2012.5.[12].瞿燕.藏藥榜嘎總生物堿的抗炎實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009.20(10):2412.[13].TakahiraM,KusanoA,ShibanoM,etal.PiscidicacidandfukiicacidestersfromCimicifu