病毒學(xué)及檢驗課件

病毒學(xué)及檢驗

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概念：病毒(Virus，V)是一類結(jié)構(gòu)簡單、體積微小、只含一種核酸、嚴格細胞內(nèi)寄生、只能在活的易感細胞內(nèi)以復(fù)制的方式增殖和抵抗力特殊的非細胞型微生物。病毒在醫(yī)學(xué)上的重要意義：1.分布廣泛。在人、動物、植物和細胞體內(nèi)均有寄生；2.可致人類多種(80%)傳染病，且傳染性強，尚可引起世界性大流行。概述23.與某些腫瘤性疾病有關(guān)。HBV—原發(fā)性肝癌；HSV-Ⅱ—宮頸癌；EBV—鼻咽癌。4.與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)。5.與先天性感染有關(guān)，可導(dǎo)致流產(chǎn)、畸形或死胎。HIV、HSV-Ⅱ、HMCV、風(fēng)疹V。6.從分子水平研究病毒學(xué)及檢驗，將對病毒性疾病的診斷和防治產(chǎn)生重大意義。目前病毒學(xué)已成為多學(xué)科關(guān)注的熱點。3一、病毒的基本性狀（一）大小與形態(tài)完整的具有感染性的病毒叫病毒體(viron)，病毒的大小就是指病毒體的大小。

1.病毒大小在20～300nm之間。大型病毒直徑在200～300nm之間，在普通光鏡下勉強可見；中型病毒直徑在100nm左右，為大多數(shù)病毒；小型病毒直徑在20～30nm之間。病毒體積微小，絕大多數(shù)須用電鏡放大成千上萬倍才能清楚可見。42.病毒的形態(tài)⑴球形：絕大多數(shù)動物病毒；⑵桿形：植物病毒，如煙草花葉病毒；⑶磚形：痘類病毒—牛痘天花病毒；⑷彈形：狂犬病毒；⑸蝌蚪形：噬菌體。（二）結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成

1.基本結(jié)構(gòu)——核心、衣殼。⑴核心(core)：位于病毒中心，為核酸—RNAorDNA。尚有少量功能蛋白—核酸多聚酶、轉(zhuǎn)錄酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。5

病毒核酸的功能：決定病毒的遺傳變異、復(fù)制和感染性，也可作為研究遺傳工程的工具。⑵衣殼(capsid):包圍在病毒核心外面的一層蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，由許多蛋白質(zhì)亞單位(殼微粒)組成。在電鏡下殼微粒有三種排列形式—螺旋對稱(流感病毒)、20面體立體對稱(乙腦病毒)和復(fù)合對稱(噬菌體頭部為20面體立體對稱，尾部為螺旋對稱)。病毒衣殼的功能：保護病毒核酸，參與病毒感染過程，具有抗原性。

62.輔助結(jié)構(gòu)——包膜、刺/纖突。⑴包膜(envelope):包圍在病毒核衣殼外面的雙層膜，由蛋白、多糖和類脂組成。以“出芽”方式釋放時，病毒從宿主細胞膜、核膜或空泡中獲得的。包膜的功能：保護核衣殼，維護病毒結(jié)構(gòu)的完整性；具有與宿主細胞親和及融合的性能，與病毒感染有關(guān)；與病毒的種型特異性(抗原性)有關(guān)。⑵刺/纖突(spike):病毒的包膜表面常有不同形狀的觸須樣突出。功能：與病毒的血凝性和吸附有關(guān)。7（三）病毒的增殖

1.方式——復(fù)制周期病毒本身缺乏新陳代謝完整的酶系統(tǒng)，不能獨立進行物質(zhì)代謝，須由宿主細胞提供病毒合成代謝所需的原材料、能量和場所才能進行增殖。病毒的一個復(fù)制周期包括：吸附→穿入→脫殼→生物合成→裝配與釋放(①破胞釋放：為無包膜病毒；②芽生方式：為有包膜病毒；③其他方式：巨細胞病毒通過細胞間橋或細胞融合，致癌病毒通過基因整合方式隨細胞分裂而傳代)。感染病毒的細胞的結(jié)局：①形成完整的傳染性顆粒；②部分基因整合入染色體，不產(chǎn)生子代；③形成缺陷病毒。82.病毒的異常增殖缺陷病毒(defectivevirus):指病毒基因組不完整或某一基因位點改變而不能進行正常增殖的病毒；但能干擾同種成熟病毒體進入細胞，故又稱缺陷干擾顆粒(defectiveinterferingparticles，DIP)。缺陷病毒+輔助病毒→能正常增殖。頓挫感染(abortiveinfection):病毒進入細胞但不能合成其本身成分，或能合成其本身成分但不能裝配與釋放病毒體。被感染的細胞稱非容納細胞(non-permissivecell)，因為其不能為病毒增殖提供所需的酶、能量及必要成分。93.病毒的干擾現(xiàn)象（1）概念：兩種病毒同時感染同一細胞，可出現(xiàn)一種病毒抑制另一種病毒的現(xiàn)象?？砂l(fā)生在異種病毒之間，也可可發(fā)生在同種同型不同株病毒之間(流感病毒的自身干擾)。（2）產(chǎn)生干擾現(xiàn)象的原因①與病毒誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生干擾素(interferon，IFN)有關(guān)，IFN能干擾病毒的mRNA的復(fù)制；②干擾病毒的吸附或改變宿主細胞的代謝途徑；③缺陷病毒所引起的干擾。（3）干擾現(xiàn)象的臨床意義①可阻止宿主細胞發(fā)病，也可中止感染，使疾病痊愈；②應(yīng)用病毒性疫苗時，應(yīng)防止干擾現(xiàn)象產(chǎn)生。10（四）病毒的抵抗力與變異病毒對各種理化因素的敏感性強弱因病毒的種類而異。了解理化因素對病毒的影響，對阻止病毒感染，分離病毒及疫苗制備等均有十分重要的意義。

1.抵抗力（1）物理因素：①耐冷不耐熱，一般病毒60℃×30min滅活(HBV100℃×10min)；-70℃以下或液氮(-196℃)中長期存活(數(shù)月—數(shù)年)。②對射線(x、)和紫外線均敏感，但不能用紫外線殺毒法(可光復(fù)活)來制備滅菌疫苗。③對酸堿度的敏感性因病毒種類而異：腸道病毒耐酸(在pH3.0—5.0時穩(wěn)定)，而呼吸道病毒對酸敏感(鼻病毒在pH3.0—5.0時迅速滅活)。故可用耐酸試驗來鑒別這兩種病毒。11

（2）化學(xué)因素：病毒對化學(xué)因素的抵抗力一般較細菌強。①耐甘油：可用50%中性甘油緩沖液鹽水保存送檢標本。②脂溶劑：有包膜的對脂溶劑(乙醚、氯仿和去氧膽酸鹽等)敏感，使病毒滅活失去吸附能力，但對無包膜的病毒無作用。故可用耐乙醚試驗鑒別病毒有無包膜。③化學(xué)消毒劑：病毒對各種氧化劑、鹵素和醇類均敏感，如H2O2、漂白粉、甲醛、過氧乙酸、次氯酸鹽、碘酒、酒精和甲醇等。④抗生素不敏感。⑤中草藥(板藍根、大青葉、大黃和七葉一枝化)對某些病毒有一定的抑制作用。122.變異大多數(shù)病毒有遺傳穩(wěn)定性，但也有一定的變異性。病毒的體積微小，表面積大，易受周圍環(huán)境因素的影響而發(fā)生變異。由于抗原性的改變，人群普遍缺乏免疫力?？梢鸫罅餍?，如SARS和禽流感等。另外，通過人工方法使病毒株毒力減弱，而抗原性不變，可制備各種疫苗，如脊髓灰質(zhì)炎疫苗、麻疹疫苗、牛痘苗、乙型腦炎疫苗和狂犬疫苗等。13（五）病毒的分類和常見病毒病毒分類的主要依據(jù)：基因特征、形態(tài)大小、結(jié)構(gòu)和對脂溶劑的敏感性等。（1）1995年國際病毒分類委員會將病毒分為三類：DNA病毒、RNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。（2）根據(jù)感染宿主不同，分為動物病毒、植物病毒和細菌病毒(噬菌體)。

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（3）根據(jù)感染途徑和臨床特點分類：①呼吸道病毒——流感V、副粘V、鼻V、冠狀V、腺V、風(fēng)疹V和呼腸V。②腸道病毒——polioV、CoxV、ECHOV、rotaV和新腸道型。③肝炎病毒——HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HGV和TTV。④蟲媒病毒——流行性乙型腦炎V。⑤皰疹病毒——EBV、CMV、HSV和VZV。⑥狂犬V、漢坦V、新疆出血熱V、登革V和HIV。15二、病毒的傳染與免疫(一)病毒感染的類型

1.隱性感染(inapparentinfection)或亞臨床感染(subclinicalinfection)：V→機體→無臨床癥狀，可獲得免疫，也可成為重要的傳染源。

2.顯性感染(apparentinfection)：V→機體→組織損傷→臨床癥狀。按病程長短和發(fā)病快慢，分急性感染和持續(xù)感染。

(1)急性感染(acuteinfection):起病急，病程短，痊愈后病毒在體內(nèi)消失。如流感V、麻疹V、水痘V和乙腦V等?！?6(2)持續(xù)感染：病毒在體內(nèi)長期存在。①慢性感染(chronicinfection):急性感染后，機體內(nèi)病毒未完全清除，并不斷排除體外，病毒易分離培養(yǎng)和檢測，如慢乙肝。②潛伏感染(latentinfection)：急性或隱性感染后，病毒存于一定組織或細胞中，與機體保持平衡，無臨床癥狀，也檢測不到病毒；當(dāng)機體某些條件改變(免疫力↓或理化因子刺激)時，潛伏的病毒又活躍起來，有臨床癥狀，病毒又能檢測，如水痘。③慢發(fā)病毒感染(slowvirusinfection)：潛伏期更長(數(shù)年—數(shù)十年)，無臨床癥狀，也檢測不到病毒；但病毒在由少到多的緩慢增殖，逐漸增多導(dǎo)致死亡，如麻疹。17(二)病毒感染的途徑和傳播方式1.病毒感染的途徑水平傳播：個體間的傳播V→機體垂直傳播：母嬰間的傳播常見感染途徑：呼吸道、消化道、媒介昆蟲叮咬、動物咬傷、接觸和經(jīng)胎盤。

HBV和HIV可經(jīng)多種途徑感染！182.病毒感染的傳播方式

(1)局部播散：流感V、鼻V。

(2)經(jīng)淋巴和血液擴散：V→局部增殖→淋巴管→血(第一次V血癥)→單核-巨噬系統(tǒng)(肝、脾和淋巴結(jié))增殖→血(第二次V血癥)→靶器官→病變和臨床癥狀。

(3)經(jīng)神經(jīng)通道播散：狂犬V神經(jīng)系統(tǒng)→腦海馬溝回病變。神經(jīng)纖維19(三)病毒的致病機制

殺細胞效應(yīng)

細胞膜改變1.病毒對宿主細胞的直接損傷作用細胞融合，出現(xiàn)新抗原細胞轉(zhuǎn)化形成包涵體與染色體畸形

包涵體(inclusionbody):某些病毒感染宿主細胞后在胞漿和胞核中形成圓形或卵圓形的普通光鏡下可見的斑塊狀物質(zhì)。不同病毒形成的包涵體的形狀、大小、數(shù)量、所處的位置和染色性(H-E)均不同。有助于病毒感染的早期快速診斷。2.免疫反應(yīng)引起的病理損傷可通過體液免疫、細胞免疫和直接破壞/損傷免疫細胞的反應(yīng)(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型變態(tài)反應(yīng))引起免疫病理損傷。20(四)病毒感染與腫瘤通過動物實驗已證實某些腫瘤的發(fā)生與病毒有關(guān)，但對人類的作用尚處于研究階段。逆轉(zhuǎn)錄病毒C型T細胞白血病(淋巴瘤)。逆轉(zhuǎn)錄病毒B型乳腺癌。EB病毒(皰疹V-4型)Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金病、白血病、淋巴瘤。HSV-Ⅱ、人乳頭瘤病毒(HPV)宮頸癌。HBV原發(fā)性肝癌。HPV傳染性軟疣、尖銳濕疣。21(五)病毒的免疫1.非特異性免疫：IFN、M、NK。干擾素(interferon，IFN)：是一種由病毒或其它誘生劑使人或動物細胞產(chǎn)生的具有抗病毒活性的糖蛋白。

Ⅰ型：IFN(白細胞產(chǎn)生)、IFN(成纖維細胞產(chǎn)生)；

Ⅱ型：IFN(PHA等各種抗原誘導(dǎo)Th產(chǎn)生)。分類性質(zhì)56℃×30’pH2.0抗病毒抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)Ⅰ型穩(wěn)定穩(wěn)定強弱弱Ⅱ型不穩(wěn)定不穩(wěn)定弱強強22IFN的特性：①無特異性，有廣譜抗病毒的作用；有種屬特異性；②通過誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白來抑制病毒的復(fù)制，它不是抗體，對人體無害；③有抑制細胞分裂、成熟和分化的作用，有治療腫瘤的作用；④對熱(37℃)、酸堿(pH2～11)較穩(wěn)定，對紫外線、蛋白酶和胰酶敏感，對脂酶和核酸酶不敏感。

IFN的實際意義：有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能。

232.特異性免疫體液免疫：中和抗體、IgG介導(dǎo)促進作用、補體結(jié)合抗體能促進吞噬細胞對病毒的吞噬作用。細胞免疫：NK、CTL(特異性細胞毒性T細胞)、淋巴因子等作用。尚有自身免疫反應(yīng)等作用。病毒為細胞內(nèi)寄生的微生物，抗體免疫作用不大，因此主要靠細胞免疫。除了引起正常免疫保護外，尚可導(dǎo)致一定的免疫病理作用。特點：型別單一，抗原性穩(wěn)定。有病毒血癥的感染，病后免疫力持久或終身免疫，如麻疹、脊灰和乙腦等；反之，則免疫短暫，如鼻V、流感V。病毒以細胞免疫為主，體液免疫和細胞免疫協(xié)同作戰(zhàn)。24三、病毒感染的實驗室診斷(一)標本采集與運送1.盡早(疾病初期或急性期)采集適當(dāng)部位的標本；2.立即接種或冷藏送檢，或加50%入甘油或10%二甲亞砜-70℃保存；3.采雙份血清：急性期和恢復(fù)期各一份，同時測抗體，效價呈4倍以上增高有診斷價值；4.嚴防病毒擴散：盛標本的容器不易破損或泄露，專人送檢；5.應(yīng)填寫病人姓名、年齡、性別、臨床癥狀、取樣部位和免疫接種等詳細情況，易于當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)調(diào)查。

25(二)病毒的檢驗方法1.病毒的分離培養(yǎng)：人工提供活的易感組織細胞。(1)組織培養(yǎng)：把離體的活組織或分散的活細胞，在體外人工控制的條件下讓其生長繁殖的一種技術(shù)。包括細胞培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和器官培養(yǎng)，其中單層細胞培養(yǎng)最為常用。原代細胞：HEK、MK細胞培養(yǎng)傳代細胞：Hela、Hep-2、KB、Vero

二倍體細胞：WI-38

(2)

雞胚接種

(3)動物接種262.病毒的鑒定

(1)初步鑒定：

①根據(jù)病毒感染組織細胞的細胞病變效應(yīng)(cytopathiceffectCPE)對雞胚的敏感性、對動物的感染范圍或潛伏期與癥狀可初步判斷病毒的存在與否、是哪類病毒；②紅細胞吸附試驗；③干擾作用：一種病毒感染細胞后，可干擾另一種病毒進入同一細胞增殖。這種干擾現(xiàn)象可被相應(yīng)病毒的特異抗體所抑制，稱之為干擾抑制現(xiàn)象；④理化性狀測定：電鏡觀察大小和形態(tài)；乙醚敏感試驗?zāi)退嵩囼灐?7(2)最后鑒定：血清學(xué)鑒定采急性期和恢復(fù)期雙份血清，同時測抗體的效價，觀察抗體的動態(tài)變化，協(xié)助病毒性疾病的診斷。若IgM↑，表示近期感染或疾病處于活動狀態(tài)；若IgG效價呈4倍以上升高，可作為一種輔助診斷指標。常用的血清學(xué)方法：中和試驗；補體結(jié)合試驗；血凝抑制試驗；免疫熒光試驗；ELISA；乳膠凝集試驗；間接血凝試驗。28①中和試驗

是將病毒與特異性抗體進行免疫反應(yīng)，使病毒失去感染性，在細胞培養(yǎng)和活的機體內(nèi)不出現(xiàn)病變的試驗。

Ⅰ、固定病毒(100TCID50)，稀釋血清，測Ab效價。兩次效價相差4倍以上有診斷意義。TCID50：50%組織細胞感染的病毒劑量(50%TissuecellinfectivedoseTCID50)。

Ⅱ、固定血清(1:20或1:40)，稀釋病毒，求中和指數(shù)。中和抗體為IgG

，出現(xiàn)晚，維持時間長，多用于V的鑒定和流行病學(xué)調(diào)查。29②補體結(jié)合試驗

五種成分，兩個系統(tǒng)。結(jié)果：溶血為陰性，不溶血為陽性。補體結(jié)合抗體為IgM，出現(xiàn)早，消失快，可用于病毒感染的早期診斷。③血凝抑制試驗V+RBC