藥物分析 第05章 體內(nèi)藥物分析

第五章

體內(nèi)藥物分析1.取樣2.鑒別3.檢查4.含量測(cè)定5.檢驗(yàn)報(bào)告工作程序

藥品檢驗(yàn)工作的基本內(nèi)容完整的生物樣品分析過程樣品分析過程時(shí)間分配示意圖樣品采集樣品前處理分析測(cè)定數(shù)據(jù)處理報(bào)告結(jié)果常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏

1體內(nèi)樣品分析的前處理

2體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證

3體內(nèi)藥物分析定義體內(nèi)藥物分析是指體內(nèi)樣品（生物體液、器官或組織）中藥物及其代謝或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的定量分析。體內(nèi)藥物分析的定義體內(nèi)樣品（生物體液、器官或組織）中藥物及其代謝產(chǎn)物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的定性、定量分析。體內(nèi)樣品——確定分析對(duì)象藥物、代謝產(chǎn)物、內(nèi)源性生物活性物質(zhì)——確定待分析物定性、定量分析——如何選擇分析手段、建立方法并驗(yàn)證體內(nèi)·藥物·分析原料藥純度高

干擾少容量分析為主制劑主藥一或多

輔料干擾多儀器分析為主體內(nèi)藥物成分復(fù)雜

干擾眾多

濃度很低高靈敏度

高選擇性的方法分析意義與體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究和臨床治療藥物監(jiān)測(cè)密切相關(guān)，直接關(guān)系到藥物的體內(nèi)作用機(jī)制探討與質(zhì)量評(píng)價(jià)和藥物臨床使用的安全、有效與合理。分析樣品種類血液尿液唾液頭發(fā)臟器組織其它特殊樣品?

體內(nèi)樣品的種類體液組織排泄物血液;唾液;腦脊液;胃液;膽汁;乳汁;精液;淚液尿液糞便;汗液胃;腸;肝;腎;肺,腦;肌肉;頭發(fā)分析目標(biāo)藥物在體內(nèi)的某些代謝產(chǎn)物常具有一定的生理活性,它們?cè)隗w內(nèi)的變化規(guī)律對(duì)母體藥物的藥理學(xué)與毒理學(xué)評(píng)價(jià)特別重要.機(jī)體內(nèi)源性生物活性物質(zhì)往往參與機(jī)體重要的生理過程,其變化規(guī)律的異常改變也與某些疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)母藥藥物特有代謝產(chǎn)物體內(nèi)內(nèi)源性生物活性物質(zhì)第五章體內(nèi)藥物分析分析對(duì)象人動(dòng)物鼠兔犬大鼠小鼠男女等等猴猩猩都是一些志愿者也有一些不知情的人須動(dòng)物管理與使用委員會(huì)同意分析對(duì)象藥物在體內(nèi)的形態(tài)游離型代謝產(chǎn)物游離型原藥結(jié)合型原藥結(jié)合型代謝產(chǎn)物情形極為復(fù)雜綴合物分子間力結(jié)合化學(xué)共價(jià)結(jié)合稱為兩類體內(nèi)藥物分析對(duì)象和待測(cè)物特點(diǎn)★成分復(fù)雜、干擾眾多生物基質(zhì)的干擾——蛋白質(zhì)、糖、脂肪、離子……其他藥物的干擾——卡馬西平治療癲癇的有效血藥濃度為3~8μg/ml，潛在中毒濃度為12μg/ml。病人可能之前用過其他抗癲癇藥物如丙戊酸鈉、乙琥胺等。代謝產(chǎn)物與原型藥物互相干擾——抗抑郁藥米氮平方法選擇性要高體內(nèi)藥物分析對(duì)象和待測(cè)物特點(diǎn)★采樣量小，濃度很低常見的生物樣品采樣量少，特定條件采集，不易重新獲得

血漿：人1~3ml；犬1~5ml；大鼠0.3~0.5ml濃度為ng/ml~μg/ml數(shù)量級(jí)血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、膽汁、乳汁、腦脊液等均勻生物樣品心、肝、脾、肺、腎、腦等非均勻生物樣品方法靈敏度要高體內(nèi)藥物分析方法的特點(diǎn)★對(duì)分析方法的要求高：滿足靈敏度及專屬性的要求樣品需要經(jīng)過前處理，才能分析分析工作量大，方法驗(yàn)證要求嚴(yán)格，測(cè)試數(shù)據(jù)處理和結(jié)果闡明較為復(fù)雜1.概述體內(nèi)樣品分析方法色譜及其聯(lián)用方法免疫學(xué)方法生物學(xué)微生物學(xué)方法HPLC,GC,HPLC-MS,HPLC-MS/MS,GC-MS,GC-MS/MS放射（RIA）熒光（FIA）酶（EIA）適合小分子及代謝物，蛋白質(zhì)大分子藥物等生物大分子藥物分析抗生素分析體內(nèi)藥物分析的任務(wù)定性分析——藥物代謝產(chǎn)物、內(nèi)源性物質(zhì)是什么定量分析——血漿、組織、尿液藥物及代謝物濃度藥物代謝與動(dòng)力學(xué)（drugmetabolismandpharmacokinetics，DMPK）研究——新藥研發(fā)治療藥物監(jiān)測(cè)（TherapeuticDrugMonitoring，TDM）——臨床應(yīng)用內(nèi)源性物質(zhì)檢測(cè)——疾病標(biāo)志物社會(huì)事件中的分析——食品安全、法醫(yī)毒物分析等1.概述體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：DMPK藥代動(dòng)力學(xué)研究涉及藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄等動(dòng)態(tài)過程，需要研究血藥/組織濃度－時(shí)間曲線的變化，探討藥物分布與藥理作用的關(guān)系。藥物代謝與動(dòng)力學(xué)血藥濃度-時(shí)間曲線尿藥累積排泄曲線生物等效性評(píng)價(jià)絕對(duì)生物利用度相對(duì)生物利用度代謝途徑代謝酶……體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：TDMTDM即測(cè)定血液中或其它體液中藥物濃度，觀察臨床藥物反應(yīng)，考察藥物治療效果，必要時(shí)根據(jù)藥動(dòng)學(xué)原理調(diào)整給藥方案。方向是實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥，目的為臨床合理用藥服務(wù)，達(dá)到最佳的藥物治療效果。治療范圍中毒范圍無效范圍C最大耐受濃度最小有效濃度治療藥物監(jiān)測(cè)血藥濃度μg/ml10~2020~3030~40>40藥理及

毒性反應(yīng)有效血藥濃度眼球震顫運(yùn)動(dòng)失調(diào)精神異常抗癲癇藥苯妥英鈉血藥濃度與藥理作用及毒性反應(yīng)患者女性，25歲，因癲癇強(qiáng)直陣攣性發(fā)作入院，遂靜脈注射負(fù)荷劑量苯妥英鈉800mg并開始口服維持劑量250mg/d。測(cè)得苯妥英鈉的濃度為3.6μg/ml，醫(yī)生考慮到尚未達(dá)到治療濃度范圍，故增加劑量到400mg/d?；颊叱霈F(xiàn)痙攣等類似癲癇發(fā)作癥狀。測(cè)得血藥濃度為10.9μg/ml，醫(yī)生擬打算再次增加劑量?；颊甙椎鞍诪?0g/L(正常范圍是34~48g/L)，于是建議檢查患者游離苯妥英鈉濃度。結(jié)果顯示游離苯妥英鈉濃度為4.9μg/ml（游離藥物治療濃度范圍1~2μg/ml），判定患者苯妥英鈉中毒，建議降低劑量為250mg/d。體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：內(nèi)源性物質(zhì)檢測(cè)體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)如氨基酸、激素、兒茶酚胺、肌酐、草酸、尿酸等。機(jī)體正常生理?xiàng)l件或機(jī)體發(fā)生病變：測(cè)定體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)或疾病標(biāo)志物的含量，疾病的輔助診斷或及早預(yù)防。藥物（中藥）代謝組學(xué)研究體內(nèi)藥物分析的中心任務(wù)體內(nèi)藥物分析方法學(xué)研究生物樣品預(yù)處理方法分離分析實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化選擇考察體內(nèi)分析方法的靈敏度、專屬性、準(zhǔn)確度、線性范圍等為臨床藥理學(xué)、臨床藥學(xué)等相關(guān)學(xué)科提供專一、靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的體內(nèi)藥物分析方法。第一節(jié)常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏常用樣品的種類:(一)血樣:藥物在體內(nèi)主要依靠血液運(yùn)輸,血藥濃度可作為藥物在作用部位濃度的指標(biāo).

①血漿(plasma)

②血清(serum)③全血(二)唾液:很少采用(三)尿液:用于藥物劑量回收、尿清除率、生物利用度，藥物代謝物及其代謝途徑、類型、速率等的研究；臨床上用于判斷患者是否違反醫(yī)囑用藥。其它：頭發(fā)、組織、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便。常用樣品的種類采集方法1、血液（blood）——血漿、血清和全血——體現(xiàn)藥物濃度和治療作用之間的關(guān)系。

——最常用的生物樣本。

（1）血樣的采集：注射器、毛細(xì)管眼眶采血、靜脈插管手術(shù)、滯留針股靜脈取血

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，采血量不宜超過動(dòng)物總血量的十分之一。（2）血樣的制備：

測(cè)定血中藥物的濃度，通常是指測(cè)定血漿或血清中的藥物濃度，尤其是血漿，并非指全血。①

血漿（plasma）的制備靜脈血2500~3000r/min離心5~10min血漿置含抗凝劑試管中抗凝劑：

肝素（最常用）、EDTA、椐櫞酸鹽、草酸鈣、氟化鈉。②

血清（serum）的制備靜脈血2500~3000r/min離心5~10min置無抗凝劑試管中37oCor室溫放置30~60min撥去血餅血清

血漿比血清的分離快，而且制取的量約為全血的50%~60%，血清只為全血的20%~40%，多數(shù)研究者用血漿進(jìn)行分析測(cè)定。③全血（wholeblood）的制備靜脈血置含抗凝劑試管中保持血漿和血細(xì)胞的勻相狀態(tài)全血

血樣主要用于藥物動(dòng)力學(xué)、生物利用度等研究及臨床治療藥物濃度監(jiān)測(cè)。——最常用的生物樣本。體內(nèi)樣品種類與采集血液自然凝結(jié)加抗凝劑離心離心全血上層：血清serum（比血漿少纖維蛋白原）（40%）下層：血細(xì)胞（凝塊）上層：血漿

plasma（50%）下層：血細(xì)胞血樣Blood一般在給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)采集血樣血清比血漿只是少一種纖維蛋白原

C血漿=C血清血漿比血清的分離快，而且制取量約為全血的50%~60%（血清為全血的20%~40%），多數(shù)用血漿進(jìn)行分析。若血漿中含有的抗凝劑對(duì)藥物濃度測(cè)定有影響時(shí)，則應(yīng)使用血清樣品

血漿與血清的區(qū)別總結(jié)血液=血漿+血細(xì)胞血漿=血清+纖維蛋白原+凝血因子血細(xì)胞=白細(xì)胞+紅細(xì)胞+血小板

血液：流動(dòng)在心臟和血管內(nèi)的不透明紅色液體。主要成分為血漿、血細(xì)胞血漿：血漿是血液的重要組成部分，呈淡黃色液體血清：血清，指血液凝固后，在血漿中除去“纖維蛋白”而得到的淡黃色透明液體2、唾液（saliva）--腮下腺-舌下腺--頜下腺

一些藥物的唾液藥濃(S）與血漿游離藥濃（P）密切相關(guān)，因此：——TDM中利用對(duì)S的測(cè)定代替對(duì)P的監(jiān)測(cè)——藥代動(dòng)力學(xué)的研究采集方法苯妥英鈉的Cs/Cp比值恒定（1）唾樣的采集：

在潄口后15min，安靜狀態(tài)下采集口腔內(nèi)自然流出的唾液；也可在刺激下快速采樣(需注意干擾)。物理法(口嚼石臘片、聚四氟乙烯塊或紗布球等)化學(xué)法(將檸檬酸或維生素C等置于舌尖)棄去初始部分后采集刺激法的優(yōu)點(diǎn)——縮短采樣時(shí)間——減小唾液pH波動(dòng)（pH≈7.0）——S/P的個(gè)體差異小（2）唾樣的制備——唾樣采集后，立即測(cè)量其除去泡沫部分的體積，以3000rpm離心10min，取上清液直接測(cè)定或冷凍保存。采集方法1:尿液特點(diǎn)量大；非創(chuàng)傷性；尿液中藥濃度較高。2:尿液缺點(diǎn)食物飲；水影響；排汗。3:尿液性質(zhì)淡黃色；成人日量1-5L；pH4.8-8.0；加防腐劑貯存。4:采集方法采集24h尿液：8時(shí)排尿棄去，立即服藥，尿液收集容器中，次日8時(shí)最后一次收集；分段收集5:腎功影響藥物的排泄

尿藥濃度與血藥濃度相關(guān)性差；有些難收集（如小孩）。尿液動(dòng)物試驗(yàn)中用代謝籠收集尿、糞，只能以時(shí)間段采集，有時(shí)會(huì)有收集不到的情況。尿藥濃度變化大，應(yīng)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)排入尿中藥物的總量。尿樣測(cè)定多用于藥物排泄、生物轉(zhuǎn)化研究。2023/6/1441優(yōu)點(diǎn)容易獲得，屬非損傷性取樣，且樣品量大；尿中藥物濃度高，含有綴合物或代謝物，是研究代謝物結(jié)構(gòu)的首選樣品；蛋白含量極低，不需去蛋白處理。

缺點(diǎn)與血藥濃度不相關(guān)，難以反映藥物作用過程；受腎功能、pH影響；難以定時(shí)定量取樣，易污染；所含成分復(fù)雜，已知其中有紫外吸收的化合物就達(dá)數(shù)十種。2023/6/1442組織采集：先取各種組織，應(yīng)用勻漿器均勻化制成水性基質(zhì)勻漿液，再以適當(dāng)方法萃取。組織樣品要經(jīng)過蛋白沉淀：甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸沉淀。酸、堿水解：將組織水解掉酶水解：應(yīng)用酶將組織水解掉其它：頭發(fā)等組織樣品藥物在組織中的分布提供重要的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)過程組織常用提取方法：（1）勻漿化法（簡(jiǎn)單，回收率低）（2）沉淀蛋白法（簡(jiǎn)單，回收率低）（3）酸水解或堿水解（適合于酸堿條件下穩(wěn)定的藥物或毒物）（4）酶水解法（避免高溫降解，不適合堿性條件下水解的藥物或毒物）2023/6/1444實(shí)例：以下可采取哪種樣品提取方法：1）利多卡因在肝臟中的組織分布？2）阿司匹林在心臟中的組織分布體內(nèi)樣品貯存與處理冷藏與冷凍去活性-20℃到-80℃,低溫終止酶的活性其它方式去除酶的活性，防止樣品進(jìn)一步代謝分解樣本量大，分析時(shí)間長(zhǎng)，要保證藥物不變質(zhì)，須貯存與處理1．血樣（血漿、血清）及時(shí)分離→冷藏，-70℃加入穩(wěn)定劑NaF2．尿樣

①尿中水、無機(jī)鹽、尿素等細(xì)菌的生長(zhǎng)，4℃保存

②加入防腐劑a．1%甲苯b．飽和氯仿c．pH改變3．唾液：同血樣冷凍與冷藏去活性去活性：為防止酶進(jìn)一步分解體內(nèi)待測(cè)組分，采樣后必須終止酶的活性。常用方法有“液氮快速冷凍法、微波照射法、勻漿及溶淀，加酶活性阻斷劑、抗氧化劑、樣品煮沸等。第二節(jié)、體內(nèi)樣品的前處理體內(nèi)樣品的前處理是體內(nèi)藥物分析中極為重要的環(huán)節(jié),也是分析中最困難、最繁復(fù)的工作。請(qǐng)先看如下處理步驟與方法全血/血漿，組織(1)蛋白沉淀(2)調(diào)節(jié)pH選擇性溶劑提取RIA殘?jiān)瘜W(xué)衍生化(提取烴基化)堿回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS處理步驟與方法預(yù)處理的目的使待測(cè)藥物游離滿足測(cè)定方法要求改善分析環(huán)境藥物進(jìn)入體內(nèi)后有多種存在形式，進(jìn)行預(yù)處理使之游離出來，便于測(cè)定藥物或代謝藥物的總濃度體內(nèi)樣品介質(zhì)組成復(fù)雜，干擾很多，而待測(cè)藥物組分濃度很低，進(jìn)行預(yù)處理可以分離濃集樣品。防止儀器的污染、劣化，提高測(cè)定的靈敏度和選擇性。不同的儀器及分析方法對(duì)樣品有不同的要求，須處理。常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法去除蛋白質(zhì)方法分離與富集方法微透析技術(shù)綴合物水解化學(xué)衍生化萃取如何進(jìn)行？蛋白質(zhì)的去除加入與水混融的有機(jī)溶劑(乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃)加入中性鹽(飽和硫酸銨、硫酸鈉、枸櫞酸鹽)加入強(qiáng)酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金屬沉淀劑(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)綴合物的水解酸水解(鹽酸)酶水解(葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素)有機(jī)破壞

(硝酸-高氯酸消化)分離、純化與濃集液-液萃取法

(Liquid-LiquidExtraction,LLE)液-固萃取法

(Liquid-SolidExtraction,LSE)溶解劑法(硝酸-高氯酸消化)常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法去除蛋白質(zhì)方法加入與水混融（親水性）的有機(jī)溶劑（乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃）。溶液的介電常數(shù)下降，蛋白質(zhì)分子間靜電力增加而聚集；親水性溶劑使蛋白質(zhì)水化膜脫落而析出沉降，并使與蛋白質(zhì)以氫鍵及其它分子間作用力結(jié)合的藥物析釋放出來。

溶劑沉淀法混比1：2~3，

冷凍離心蛋白沉淀過程示意圖A B C DA血漿樣品200μlB加入甲醇600μlC渦旋混合3min后D10000rpm離心10min后56沉淀劑每1容積血漿加入沉淀劑容積0.21.02.03.04.0甲醇17.673.498.798.999.2乙腈13.497.299.799.899.810%三氯醋酸99.799.599.899.899.8鎢酸鹽-硫酸3.399.799.899.9100.0(飽和)硫酸銨21.353.498.3**CuSO4-Na2WO436.597.599.9100.0100.0ZnSO4-NaOH41.194.299.398.899.6常用蛋白沉淀劑的用量及沉淀蛋白的百分率*：樣品渾濁，妨礙準(zhǔn)確測(cè)定去除蛋白質(zhì)方法混比1：2，

冷凍離心加入中性鹽(飽和硫酸銨、硫酸鈉、枸櫞酸鹽)，使溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生變化，部分蛋白質(zhì)的電性被中和，蛋白質(zhì)的分子間排斥力減弱而凝聚；同時(shí)中性鹽使蛋白質(zhì)水化膜脫落而析出沉降。中性鹽析法去除蛋白質(zhì)方法混比1：0.6，

冷凍離心加入強(qiáng)酸(10%三氯醋酸、6%高氯酸等)，影響蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及開成不溶性鹽而沉降。強(qiáng)酸沉降法去除蛋白質(zhì)方法熱變性蛋白質(zhì)離心煮雞蛋？熱凝固法（1）優(yōu)點(diǎn)：①與雜質(zhì)分離②簡(jiǎn)便③濃集④提取率高（2）提取率：在有機(jī)相與水相中的溶解度的比值分配系數(shù)，一般少量多次，對(duì)生物樣品一般一次萃取，>70%重現(xiàn)性分離與濃集液液萃取LLE利用藥物在有機(jī)溶劑中的溶解度大于在水中的溶解度而提?。?）影響提取率的因素①pH：堿性藥物在堿性pH，酸性在酸性pH②提取溶劑相似相溶原理沸點(diǎn)低，不影響檢測(cè),性質(zhì)穩(wěn)定，不起化學(xué)反應(yīng)(化學(xué)惰性）③離子強(qiáng)度加入中性鹽增加離子強(qiáng)度，與水結(jié)合強(qiáng)，便于有機(jī)溶劑提取分離與濃集對(duì)于離子性特強(qiáng)，水溶性極大的藥物，可采用離子對(duì)提?、僭恚涸隗w液(水溶液)中呈離解狀態(tài)的酸性或堿性有機(jī)藥物(Q)，與呈相反電荷離子(X)作用形成具有一定脂溶性的離子對(duì)(QX)，再用有機(jī)溶劑提?、趹?yīng)用測(cè)定堿性藥物——用烷基磺酸鹽

（RSO3-）作為反離子

如戊~辛烷磺酸鈉、月桂磺酸鈉等測(cè)定酸性藥物——用烷基季銨類化合物

（R4N+·X-）作為反離子

如氫氧化四乙基銨、四丁基銨、四辛基銨等分離與濃集液液萃取示意圖取1ml血漿

置具塞玻璃離心管中精密加入5ml

乙酸乙酯

提取溶劑充分渦旋混合3min液液萃取示意圖4000rpm

離心10min后準(zhǔn)確取出上層有機(jī)溶劑置另一干凈具塞玻璃離心管置N2下水浴揮干溶劑殘留物用流動(dòng)相溶解離心后進(jìn)樣HPLC分析便于純化與富集示例：尿液中甲基苯丙胺與苯丙胺的檢測(cè)（液液萃取）取尿液2ml，置于5ml離心管中，加入5ml乙醚，渦旋，離心，取乙醚層置另一5ml離心管中，60度水浴氮?dú)饬飨聯(lián)]干取尿液2ml，置于5ml離心管中，加入100μl0.1mol/lNaOH，混勻后加入5ml乙醚，渦旋，離心，取乙醚層置另一5ml離心管中，60度水浴氮?dú)饬飨聯(lián)]干甲基苯丙胺（冰毒）苯丙胺

體液中呈陰離子狀態(tài)的藥物主要有磺酸類、羧酸類及代謝物葡萄醛酸苷等。

體液中能離解成陽離子的藥物主要是有機(jī)胺類，尤其是季銨類藥物離子對(duì)提取應(yīng)用的藥物固相萃取SPE是目前使用相當(dāng)廣泛的一種萃取方法，惜乎價(jià)格較貴將不同填料作為固定相裝入小柱，藥物溶液通過小柱時(shí)，藥物被吸附、分配、離子交換，或其它親和力作用，使藥物及內(nèi)源性物質(zhì)同時(shí)被保留在固定相上，再選用適當(dāng)溶劑洗脫藥物的方法這方面，美國(guó)是老大分離與濃集用有機(jī)溶劑(甲醇)沖洗——洗凈用水沖洗——活化上樣用水或緩沖液沖洗，洗去內(nèi)源性物質(zhì)有機(jī)溶劑洗脫藥物收集洗脫液······分離與濃集方法好價(jià)格貴固相萃取基本操作固定相C18先甲醇潤(rùn)濕小柱

再用水除去多余甲醇1)活化固相萃取基本操作1)活化2)上樣液體樣品內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗選擇不同極性溶劑

依次為：水，由低到高比例的甲醇內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗淋洗的目的：除去生物樣品的干擾，待測(cè)藥物仍然保留在SPE柱上內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗4)洗脫100%甲醇為洗脫劑內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑洗脫溶劑固相萃取基本操作收集洗脫液，其中含有待測(cè)藥物直接進(jìn)樣分析

濃縮后進(jìn)樣分析待測(cè)藥物洗脫溶劑1)活化2)上樣3)淋洗4)洗脫固相萃取基本操作內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑洗脫溶劑活化上樣淋洗洗脫①固相選擇樣品1ml1ml規(guī)格固相1~25ml3ml規(guī)格固相②固相處理反相C18

固定相的6~10倍體積甲醇洗柱，使溶劑化

6~10倍水緩沖服液沖洗達(dá)分離狀態(tài)③上樣④分離用適當(dāng)?shù)娜跞軇┫礈煜慈ルs質(zhì)，通N2干燥固相⑤洗脫待測(cè)物改變pH或極性固相萃取具體步驟（1）流速流速快，按觸不充分，樣品流失回收率低柱處理5~10ml·min-1

洗脫0.2~1ml·min-1（〈300mg〉

2~5ml·min-1（>300mg）（2）裝樣過載突破性試驗(yàn)已知濃度樣品液

①小體積上柱→洗脫回收百分率

②加大體積→洗脫回收百分率

③繪圖當(dāng)回收率下降時(shí)為過載固相萃取具體步驟超濾分離法是以多孔半透膜（超濾膜）作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)，選用不同的孔徑的不對(duì)稱膜，即可按照分子量大小進(jìn)行分離適合TDM血樣分析Therapeuticdrugmonitoring綴合物的水解酶水解法酸水解法溶劑解法化學(xué)衍生法why?某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大，揮發(fā)性低，或者對(duì)檢測(cè)器不夠靈敏，難以滿足常規(guī)HPLC及GC檢測(cè)的需要，因此進(jìn)行衍生HowforGC?硅烷化?；榛粚?duì)稱化常用的烷基化試劑：碘庚烷、疊氮甲烷、氫氧化三甲基苯胺（TMAH）等；

常用的?；噭阂宜狒?、丙酸酐等；

硅烷化試劑：三甲基氯硅烷（TMCS）、雙-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、雙-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅咪唑（TMSI）等。why?某些藥物或者代謝產(chǎn)物極性大，揮發(fā)性低，或者對(duì)檢測(cè)器不夠靈敏，難以滿足常規(guī)HPLC及GC檢測(cè)的需要，因此進(jìn)行衍生HowforLC?UVFL非對(duì)映衍生化?化學(xué)衍生法非對(duì)映衍生化?對(duì)映體：一個(gè)化合物的兩個(gè)光學(xué)異構(gòu)體，其分子在整體上互為不能重疊的鏡像。分子量、分子式完全相同。應(yīng)用普通色譜方法難以分離。通過衍生可以使之非對(duì)映化。根據(jù)構(gòu)象等理化性質(zhì)差異進(jìn)行分離?；瘜W(xué)衍生法分析方法的建立方法的選擇色譜分析法免疫分析法生物學(xué)方法第三節(jié)體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證分析方法的建立選用何種方法進(jìn)行體內(nèi)藥物分析為好呢？一般要根據(jù)藥物的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)持征、藥物濃度大小、干擾成分的多少、預(yù)處理方法、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊约皩?shí)驗(yàn)室條件等因素綜合起來進(jìn)行考慮。分析方法的設(shè)定依據(jù)

(一)做好文獻(xiàn)總結(jié)、整理工作對(duì)已有報(bào)道的藥物進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)系統(tǒng)總結(jié)前人的文獻(xiàn)，從中找出哪些問題已解決，還存在哪些問題等。對(duì)尚無文獻(xiàn)報(bào)道的，也可根據(jù)藥物的性質(zhì)情況，參考相似類型藥物的文獻(xiàn)資料。(二)充分了解待測(cè)藥物的特性與體內(nèi)狀況藥物的理化性質(zhì)和體內(nèi)過程是建立方法的主要依據(jù)。藥物的理化性質(zhì)包括酸堿性(pKa)、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、穩(wěn)定性等，這些性質(zhì)與分析方法的選擇、實(shí)驗(yàn)條件的改善密切相關(guān)。與常規(guī)分析方法不同，體內(nèi)藥物分析的對(duì)象是來自生物體內(nèi)的樣品，因此對(duì)藥物在體內(nèi)的狀況必須了解，如藥動(dòng)學(xué)參數(shù)、體內(nèi)代謝情況等。這涉及樣品取樣頻率與間隔，分析方法的選擇等。(三)明確測(cè)定的目的、要求應(yīng)了解擬建立的方法是用于測(cè)定藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，還是用于臨床藥濃監(jiān)測(cè)。前者要求具有一定的靈敏度和準(zhǔn)確度，不強(qiáng)調(diào)簡(jiǎn)便、快速，設(shè)計(jì)方法時(shí)應(yīng)考慮到不同時(shí)間獲得的樣品中藥物濃度變化較大這一因素。而用于臨床藥濃監(jiān)測(cè)，則要求方法簡(jiǎn)便、快速。另外，是否要求同時(shí)測(cè)定母體藥物和代謝物，若需同時(shí)測(cè)定兩者，則應(yīng)選擇具有分離能力或?qū)俚臏y(cè)定方法。

（四）結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的和可能獲得的設(shè)備條件加以考慮，選擇可行的方法。

方法建立的一般實(shí)驗(yàn)步驟

方法初步擬定后，還需進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)工作，以選擇最佳實(shí)驗(yàn)條件及驗(yàn)證所擬定的方法是否適合實(shí)樣檢測(cè)。通常包括下列步驟：（一）以純品進(jìn)行測(cè)定取藥物或其代謝物純品適量，按擬定方法測(cè)定，求得濃度與測(cè)定響應(yīng)值之間的關(guān)系，進(jìn)行線性范圍、最適測(cè)定濃度、檢測(cè)靈敏度、測(cè)定最適條件(如pH值、溫度、反應(yīng)時(shí)間等）等的選擇。(二)空白樣品測(cè)定取空白生物樣品，按擬定的方法進(jìn)行處理，測(cè)定空白值(或色譜圖)。空白值高低或色譜圖狀況將影響到方法的靈敏度和專屬性，應(yīng)力求將空白值降低。在色譜分析中應(yīng)力求減少體內(nèi)樣品中內(nèi)源性雜質(zhì)峰，對(duì)無法消除的內(nèi)源性雜質(zhì)峰應(yīng)設(shè)法使其從待測(cè)物的色譜區(qū)域內(nèi)移開。能否取得良好的樣品空白實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是決定測(cè)定方法實(shí)際可行性的重要環(huán)節(jié)，必須設(shè)法解決。

(三)以水代替空白樣品，添加標(biāo)準(zhǔn)后測(cè)定以水代替空白生物樣品，添加標(biāo)準(zhǔn)后按擬定的方法進(jìn)行測(cè)定，以了解提取回收率及最低檢測(cè)濃度的大致情況，從而對(duì)萃取溶劑、pH值、揮發(fā)濃縮等條件進(jìn)行選擇。(四)空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)后測(cè)定于空白生物樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)品后按擬定方法進(jìn)行測(cè)定，求得樣品回收率數(shù)據(jù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。若采用色譜法測(cè)定，多數(shù)情況下需要用內(nèi)標(biāo)法定量，則應(yīng)首先選擇合適的內(nèi)標(biāo)，然后進(jìn)行回收率的測(cè)定。

(五)體內(nèi)實(shí)際樣品測(cè)定經(jīng)過上述(一)至(四)步驟后進(jìn)行實(shí)際樣品的測(cè)定。但要指出的是，以上步驟只是生物樣品實(shí)樣檢測(cè)前的準(zhǔn)備工作，不能完全確定是否適用于實(shí)樣測(cè)定。因藥物在體內(nèi)變化是復(fù)雜的，如不注意藥物代謝和蛋白結(jié)合情況，則應(yīng)用體外建立的方法，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)樣測(cè)定時(shí)往往會(huì)失敗，甚至導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論，所以在設(shè)計(jì)方法時(shí)強(qiáng)調(diào)對(duì)藥物體內(nèi)過程要有一定程度的了解，從而選擇避免干擾和適合樣品實(shí)際情況的方法。有時(shí)也可采用專屬性強(qiáng)，已證明用于體內(nèi)實(shí)樣測(cè)定的步驟和方法作為對(duì)照測(cè)定，以此來檢驗(yàn)所建立的方法的實(shí)際可行性。

分析方法的建立方法

的驗(yàn)證特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍定量下限準(zhǔn)確度與精密度穩(wěn)定性回收率分析過程的質(zhì)量控制未知樣品濃度超出范圍的處理相關(guān)物質(zhì)測(cè)定其它方法驗(yàn)證驗(yàn)證的效能指標(biāo)與基本要求

1．特異性——內(nèi)源性物質(zhì)不得干擾原藥、代謝物 2．標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍——r≥0.9900，至少5個(gè)濃度，不許外延 3．準(zhǔn)確度——與實(shí)際狀況相符 4．精密度——結(jié)果可重現(xiàn) 5．定量限——達(dá)到峰濃度的1/10～1/20,3~5倍t1/2， 6．穩(wěn)定性——確保所有樣品準(zhǔn)確測(cè)定 7．提取回收率——一般低于100％，須穩(wěn)定(一)特異性

比較標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與6個(gè)不同個(gè)體的空白生物介質(zhì)和QC樣品軟電離質(zhì)譜(LC-MS)介質(zhì)效應(yīng)比較QC樣品和至少6個(gè)不同個(gè)體用藥后的實(shí)際樣品必要時(shí)LC-DAD/MS確證峰的單一/同一

比較待測(cè)藥物,同服藥物,待測(cè)藥物的QC樣品和添加有同服藥物的干擾樣品特異性(specificity),又稱專屬性或?qū)Ｒ恍?通常與選擇性(selectivity)互用1.內(nèi)源性物質(zhì)2.未知代謝物

3.伍用藥物4.參比方法參比方法橫坐標(biāo)(x),擬定方法縱坐標(biāo)(y),最小二乘y=a+bx

a恒定干擾b比例干擾(如,標(biāo)記抗原不純,交叉免疫)(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立(二)少數(shù)方法(如,IA)外,通常為線性模式

線性回歸:最小二乘法或加權(quán)最小二乘法自變量(x)為藥物濃度,因變量(y)為響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度(1)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液:

n≥6(不包括0點(diǎn));等比系列(2~3); 通常為100~1000倍(2)內(nèi)標(biāo)溶液:

濃度相當(dāng)于系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的幾何平均濃度

(3)系列標(biāo)準(zhǔn)樣品:空白生物介質(zhì),加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:藥物濃度,以單位體積(如血漿)或質(zhì)量(如肝臟)的生物介質(zhì)中加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量表示(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍2.限度要求通常用至少6個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線非線性相關(guān)(如IA)可能需要更多濃度點(diǎn)定量范圍覆蓋全部待測(cè)樣品濃度范圍定量上限(ULOQ)高于用藥后的峰濃度(Cmax)定量下限(LLOQ)低于Cmax的10%~5%(1/10~1/20)標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的回歸計(jì)算值(x’)與標(biāo)示值(x)之間的偏差〔bias=[(x’-x)/x]×100%〕在可接受的范圍之內(nèi)最低濃度點(diǎn)的偏差在±20%以內(nèi)其余濃度點(diǎn)的偏差在±15%以內(nèi)(三)定量下限1.測(cè)定法取同一生物介質(zhì),制備至少5個(gè)獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)樣品,其濃度應(yīng)使信噪比(S/N)大于5,依法進(jìn)行精密度與準(zhǔn)確度驗(yàn)證定量下限(LLOQ):標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)符合準(zhǔn)確度和精密度要求2.限度要求準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示濃度的80%~120%范圍內(nèi),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)應(yīng)小于20%(四)精密度與準(zhǔn)確度1.測(cè)定法高中低3個(gè)濃度的QC樣品,制備至少5個(gè)獨(dú)立的樣品低:LLOQ的2~3倍;高:ULOQ的80%;中:幾何平均濃度同法獨(dú)立測(cè)定3天

方法精密度除評(píng)價(jià)批內(nèi)(日內(nèi))RSD外,同時(shí)還應(yīng)評(píng)價(jià)批間(日間)RSD2.限度要求準(zhǔn)確度:低,80%~120%; 中高,85%~115%RSD:低,20%; 中高,15%(五)穩(wěn)定性1.測(cè)定法(高低濃度)室溫考察1個(gè)工作日(如1,2,4,8或24h)

冷藏(4℃)數(shù)個(gè)工作日(標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至整個(gè)分析完成)冷凍(-20℃/-80℃)至整個(gè)分析完成凍-融至少經(jīng)歷3個(gè)循環(huán)

短期穩(wěn)定性:在1個(gè)分析批內(nèi),樣品室溫等待處理;處理后溶液在特定(HPLC進(jìn)室)溫度等待進(jìn)樣期間穩(wěn)定性長(zhǎng)期穩(wěn)定性:在整個(gè)樣品分析期間,體內(nèi)樣品的長(zhǎng)期儲(chǔ)藏,凍融;以及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性2.期限要求短期:通常1工作日,不超過3工作日;長(zhǎng)期:整個(gè)分析完成期限(六)提取回收率1.測(cè)定法高中低3個(gè)濃度的QC樣品,制備至少5個(gè)獨(dú)立的樣品另取空白生物介質(zhì),照QC樣品同法處理,加入等量的標(biāo)準(zhǔn)溶液(必要時(shí)除去溶劑)同法處理高中低3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品(不含生物介質(zhì))樣品處理方法的評(píng)價(jià)重點(diǎn)在于結(jié)果的精密與重現(xiàn);而非待測(cè)物提取的完全與否2.限度要求RSD:低,20%; 中高,15%(七)分析過程的質(zhì)量控制每個(gè)未知樣品測(cè)定一次,必要時(shí)進(jìn)行復(fù)測(cè)來自同一個(gè)體的體內(nèi)樣品在同一分析批中測(cè)定每個(gè)分析批,建立批標(biāo)準(zhǔn)曲線;并隨行3濃度QC樣品

QC樣品每個(gè)濃度至少雙樣本,并均勻分布在未知樣品順序(低→高/高→低順序均勻穿插整個(gè)分析批)中一個(gè)分析批內(nèi)未知樣品數(shù)目較多時(shí),應(yīng)同時(shí)增加各濃度QC樣品數(shù),使QC樣品數(shù)大于未知樣品總數(shù)的5%QC樣品測(cè)定結(jié)果的偏差不大于±15%,低濃度點(diǎn)偏差不大于±20%;允許1/3非同濃度QC樣品結(jié)果超限不符合上述要求,則該分析批樣品測(cè)試結(jié)果作廢(八)未知樣品濃度超限的處理標(biāo)準(zhǔn)曲線不能外延,濃度超限的樣品處理后再測(cè)定濃度高于ULOQ部分樣品用空白生物介質(zhì)稀釋至規(guī)定體積再測(cè)定同時(shí)制備濃度高于ULOQ的QC樣品,同法稀釋(濃度不低于LLOQ)后測(cè)定濃度低于LLOQ增加樣品體積(制備樣品濃度高于LLOQ);同法進(jìn)行QC樣品和空白介質(zhì)試驗(yàn)特異性不降低,準(zhǔn)確