傳染病-實(shí)習(xí)報(bào)告

PAGEPAGE１實(shí)習(xí)報(bào)告學(xué)院:動(dòng)物醫(yī)學(xué)院課程:獸醫(yī)傳染病學(xué)實(shí)習(xí)班級(jí):動(dòng)醫(yī)10*班學(xué)號(hào):171102**姓名:**導(dǎo)教師:王先煒職稱:副教授實(shí)習(xí)時(shí)間2013年5月26日至2013年5月31日實(shí)習(xí)地點(diǎn)逸夫樓40172013年6月南京農(nóng)業(yè)大學(xué)教務(wù)處制病毒細(xì)胞接種1顯微鏡觀察母細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)：在顯微鏡下觀察母細(xì)胞的生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)狀況。細(xì)胞接種：在細(xì)胞板中加入過(guò)濾后的組織上清液，使其鋪滿細(xì)胞表面，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育1h；棄去組織濾液，在細(xì)胞中加入細(xì)胞維持液，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和有無(wú)病變。RNA的提取取100ul分離病毒液，加入1mlTrizol試劑，勻漿，室溫靜置2-3min；加入200ul氯仿，劇烈震蕩，室溫靜置2-3min；4℃12000rpm離心15min；取上清，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10min；4℃12000rpm離心10min；棄上清，加入1.0ml75%乙醇，振搖，4℃12000rpm離心5min；棄上清，干燥沉淀物（室溫約5min）；加入20ulDEPC水溶解沉淀。（四）RT-PCR（鑒別高致病性和非高致病性毒株）上游引物：5'-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3'下游引物：5'-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3'PCR反應(yīng)體系（總體系為25ul)模板4ul（上述RNA提取備用液）10*Mg2+freebutter2.5ul2.5mmol?L-1Mg2+2.0ul25mmol?L-1Mg2+1.0ul20pmol?L-1Dnsp11610.5ul20pmol?L-1Dnsp19280.5ulTaqDNA聚合物0.3ul滅菌雙蒸水14.2ul反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94℃3min，48℃45s，72℃75s，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；然后94℃1min，54℃45s，72℃75s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。取8.0ul的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。日期：2014.5.28星期：星期四晚上6:00——9:30（一）細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料：生化反應(yīng)管：商品化的葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖、麥芽糖、尿素、乙酰胺、硫化氫、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶生化反應(yīng)管。商品化試劑：藥敏試紙、PCR試劑、引物、瓊脂糖細(xì)菌：商品化金黃色葡萄球菌2.細(xì)菌的生化試驗(yàn)用接種針（無(wú)菌）取分離的細(xì)菌24h純培養(yǎng)物分別接種到含葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D-核糖、麥芽糖、尿素、乙酰胺、硫化氫、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的生化反應(yīng)管中，開(kāi)口向下，放到滅菌培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果并記錄。同時(shí)進(jìn)行脲酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)和接觸酶試驗(yàn)。（1）糖類分解試驗(yàn)原理：接種細(xì)菌若發(fā)酵某種糖或醇，可產(chǎn)酸，使培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色；如發(fā)酵的同時(shí)又產(chǎn)生氣體，培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色的同時(shí)，在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。 結(jié)果判定：接種后24h觀察結(jié)果。產(chǎn)酸，培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色；產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色，并在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。（2）脲酶試驗(yàn)原理：細(xì)菌分解尿素產(chǎn)生兩分子氨，培養(yǎng)基pH升高，指示劑酚紅顯示出紅色，即證明細(xì)菌有脲酶。 接種方法及結(jié)果判定：用接種環(huán)將細(xì)菌培養(yǎng)物接種與尿素瓊脂斜面，不要穿刺到底，下部留作對(duì)照。1～6h觀察，有時(shí)需要24h到6d。陽(yáng)性反應(yīng)，則瓊脂斜面有粉紅到紫紅色。陰性反應(yīng)，不變色。氧化酶試驗(yàn)原理：氧化酶或稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶。作氧化酶試驗(yàn)時(shí)，此酶首先使細(xì)胞色素C氧化，然后氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。接種方法及結(jié)果判定：取白色潔凈濾紙沾取菌落。加鹽酸二甲基對(duì)苯二胺溶液一滴，陽(yáng)性者呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深，再加α-萘酚溶液一滴，陽(yáng)性者于半分鐘內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍(lán)色。陰性于兩分鐘內(nèi)不變色。（4）接觸酶試驗(yàn)（也叫做觸媒實(shí)驗(yàn)或者過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)） 原理：具有過(guò)氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過(guò)氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。接種方法及結(jié)果判定：取槽置于潔凈的試管內(nèi)或玻片上，然后加3％過(guò)氧化氫數(shù)滴；或直接滴加3％過(guò)氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。有大量氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性。不產(chǎn)生氣泡者為陰性。（5）硫化氫試驗(yàn)原理：細(xì)菌分解含硫氨基酸，產(chǎn)生硫化氫，與培養(yǎng)基中的醋酸鉛或硫酸亞鐵發(fā)生反應(yīng)，形成黑色的硫化氫或硫化亞鐵。結(jié)果判定：接種后24h觀察結(jié)果，培養(yǎng)液變黑為陽(yáng)性，不變色為陰性3.藥敏試驗(yàn)藥敏試紙種類：頭孢喹肟、頭孢曲松、阿米卡星、青霉素G、氨芐西林、頭孢唑林、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、阿奇霉素、慶大霉素、新霉素、氯霉素、紅霉素、林可霉素、復(fù)方新諾明。用涂布棒將分離細(xì)菌涂布與TSA或鮮血平板上，將各種抗菌藥物圓紙片（任選7種）分別貼于培養(yǎng)基表面，各片距離要相等，37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)24h檢查。結(jié)果判定：根據(jù)藥物紙片周?chē)袩o(wú)抑菌圈及其直徑大小，來(lái)判斷對(duì)藥物的敏感程度。無(wú)抑菌圈，細(xì)菌對(duì)該抗生素不敏感；抑菌圈小于10mm，對(duì)該抗生素低度敏感。細(xì)菌在血平板上的初步鑒定將副豬嗜血桿菌水平劃線接種鮮血瓊脂平板上，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37℃培養(yǎng)24-48h，呈現(xiàn)出典型的“衛(wèi)星生長(zhǎng)”現(xiàn)象，并且不出現(xiàn)溶血。DNA提取取適量菌液（1/3EP管），12000rpm、5-6min，棄上清；加400ulTE溶液重懸細(xì)菌，離心12000rpm、5-6min；棄上清，加400ulTris（0.1mTris、8.5PH）重懸；加6ul蛋白酶K，56℃水浴30-45min；100℃煮沸20min，-20℃保存?zhèn)溆?；DNA的PCR檢測(cè)引物HSP1：GTGATGAGGAAGGGTGGTGTHSP2：GGCTTCGTCACCCTCTGTPCR反應(yīng)體系（總體系為25ul)模板3ul（上述DNA提取備用液）10*Mg2+freebutter2.5ul2.5mmol?L-1Mg2+2.0ul25mmol?L-1Mg2+1.0ul20pmol?L-1Dnsp11610.5ul20pmol?L-1Dnsp19280.5ulTaqDNA聚合物0.3ul滅菌雙蒸水15.2ul反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94℃3min，48℃45s，72℃75s，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；然后94℃1min，54℃45s，72℃75s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。觀察病毒液接種的細(xì)胞，是否有細(xì)胞病變?nèi)掌冢?014.5.30星期：星期五晚上注：因?yàn)檗r(nóng)場(chǎng)主母親去世，不能按照原先計(jì)劃參觀江浦農(nóng)場(chǎng)，故先將周六晚上的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃提前到周五晚上。DNA的PCR瓊脂糖凝膠電泳和RNA的RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳取8.0ul的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，二者操作相同。老師小結(jié)關(guān)于本次實(shí)習(xí)的總結(jié)。包括操作中的注意事項(xiàng)及需要糾正的操作方法，如何分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不同實(shí)驗(yàn)的失敗原因分析思路及實(shí)習(xí)報(bào)告的寫(xiě)法等。四、實(shí)習(xí)結(jié)果及分析觸片檢查肺部組織觸片和支氣管觸片觀察到少量?jī)蓸O革蘭氏陰性染色短小桿，還觀察到一些長(zhǎng)桿菌和小球菌。增殖和鏡檢TBS管均渾濁，有菌生長(zhǎng)。鏡檢有兩極革蘭氏陰性染色短小桿菌。衛(wèi)星試驗(yàn)待檢和陽(yáng)性對(duì)照兩塊血平板均無(wú)明顯的衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象。生化試驗(yàn)試驗(yàn)項(xiàng)目待檢組標(biāo)準(zhǔn)組結(jié)果分析糖類分解葡萄糖+++可能待檢樣品和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品還是被污染了，所得結(jié)果有一定相似性卻并不完全一致，也有可能是在接種過(guò)程中接種針溫度過(guò)高使樣品菌受損所致。蔗糖+-eq\o\ac(○,+)果糖-++半乳糖-++D-核糖+-+麥芽糖--+硫化氫乙胺酰胺鳥(niǎo)氨酸脲酶試驗(yàn)注：“＋”表示產(chǎn)酸；“○”表示產(chǎn)氣；“eq\o\ac(○,+)”表示既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣；“－”表示不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣。藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌共做3塊板，16種藥物，僅兩塊板有針尖大小透明菌落生長(zhǎng)；待檢菌共做兩塊板，12種藥物，均無(wú)菌落生長(zhǎng)。記錄為標(biāo)準(zhǔn)菌組中有效抑菌圈，其中紅霉素和復(fù)方新諾明的為平均值。藥物抑菌圈半徑結(jié)果結(jié)果分析阿米卡星12mm敏感所做待檢樣品菌對(duì)七種抗生素均敏感程度與副豬嗜血桿菌基本相同。紅霉素8mm不敏感氯霉素19mm敏感新霉素12mm敏感頭孢唑啉21mm敏感林可霉素7mm不敏感復(fù)方新諾明10mm敏感阿奇霉素15mm敏感排序：頭孢唑啉>氯霉素>阿奇霉素>新霉素=阿米卡星>復(fù)方新諾明>紅霉素>林可霉素RT-PCR（RNA病毒）和PCR（DNA病毒）RT-PCR和PCR產(chǎn)物的電泳圖像中均無(wú)HPS陽(yáng)性條帶，可判斷沒(méi)有病毒。RT-PCR和PCR電泳結(jié)果圖（7）細(xì)胞病變情況①正常細(xì)胞，細(xì)胞大小基本相等，均勻平鋪生長(zhǎng)（圖一）；②接毒24h后有出現(xiàn)細(xì)胞病變，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)塊狀（圖二）；③接毒48h后細(xì)胞聚集成團(tuán)塊狀，相較于第二天聚集更明顯，因?yàn)橐话阋魅趴沙霈F(xiàn)明顯的CPE，此次實(shí)驗(yàn)一代在顯微鏡下已有病變，因此可確認(rèn)有病毒增殖（圖三）。圖一圖二圖三五、討論實(shí)驗(yàn)無(wú)菌意識(shí)不足：應(yīng)在酒精燈15cm范圍內(nèi)操作，不可將平板蓋子完全打開(kāi)接種，要注意規(guī)范操作，取用無(wú)菌實(shí)驗(yàn)物品，勿碰觸槍頭尖頭部或是容器瓶口等。觸片：制作觸片時(shí),沾一下即可，不要涂布，在開(kāi)放環(huán)境下即可進(jìn)行操作。涂片：涂片操作時(shí)，先滴加生理鹽水，生理鹽水要適量，涂布均勻后在酒精燈上間斷過(guò)幾下，不可太燙，以不燙手背為原則。染色：HE染色時(shí)需注意每一步的染色時(shí)間，用蒸餾水沖洗時(shí)要將載玻片傾斜，從一頭緩緩沖洗，以防將樣品洗脫，每次加試劑時(shí)要完全覆蓋樣品表面，使其充分染色。倒平板：需注意要灼燒瓶口，倒15-20ml瓊脂，在酒精燈無(wú)菌范圍內(nèi)操作，平板開(kāi)口不要太大，以免細(xì)菌污染。本次實(shí)習(xí)過(guò)程中很多制作好的平板第二天就長(zhǎng)了雜菌，證明大家的無(wú)菌操作還是不夠規(guī)范。油鏡：使用前后都要用二甲苯涂抹擦鏡紙將油鏡擦干凈，以免影響下次使用。細(xì)菌劃線接種：要先將平板周?chē)诰凭珶敉庋嫦聼蝗?，然后左手抓緊TSA平板，用手掌將平皿的底固定，用拇指和食指將平皿的蓋略抬起一些，然后右手持接種環(huán)，接種環(huán)也要先燒一下，然后接觸病料，再與平板平面呈30°輕輕劃線，一定要利用腕力，避免將平板劃破，劃線時(shí)盡量靠近酒精燈；接種環(huán)灼燒消毒后要冷卻后再接種。藍(lán)耳病毒的細(xì)胞病變是形成空斑，但不是所有的病毒病變都一樣，也有形成合胞體胞漿顆?；虍a(chǎn)生輕微病變等等，在臨床試驗(yàn)中注意區(qū)別，真正判定病毒種類還是得做PCR檢測(cè)。細(xì)胞脫落原因：孵育的時(shí)間太長(zhǎng)；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中過(guò)度搖動(dòng)；細(xì)胞老化；沒(méi)有在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；有細(xì)菌污染。判定細(xì)胞污染：細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液渾濁（對(duì)光有顆粒非污染）支原體污染：營(yíng)養(yǎng)液變黃營(yíng)養(yǎng)液沒(méi)有超過(guò)1/10提取RNA后要立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，如果不立即實(shí)驗(yàn)，需-70℃保存材料。做DNA的PCR加樣時(shí)，需在正常環(huán)境下進(jìn)行，不可有風(fēng)，否則影響結(jié)果（在本次試驗(yàn)中因?yàn)橹攸c(diǎn)在于熟悉操作，同學(xué)太多加上天氣炎熱故沒(méi)有關(guān)閉風(fēng)扇）。原定于周五參觀江浦農(nóng)場(chǎng)的計(jì)劃最終改為下周二（6月10日）參觀。自我鑒定：經(jīng)過(guò)本次實(shí)習(xí)，我不但了解了整個(gè)傳染病的診斷流程，也對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手法有了一定的認(rèn)識(shí)，基本掌握了一些常用實(shí)驗(yàn)室診斷試驗(yàn)的操作方法及注意事項(xiàng)。綜合近幾年學(xué)習(xí)的相關(guān)試驗(yàn)方法，對(duì)傳染病的診斷有了系統(tǒng)的認(rèn)知和理論的融合。同時(shí)在此過(guò)程