氨基酸對胰島素纖維形成及細胞毒性的影響

氨基酸對胰島素纖維形成及細胞毒性的影響【摘要】目的:研究氨基酸對牛胰島素淀粉樣纖維的生成、形態(tài)和細胞毒性的影響.方法:采用硫黃素熒光檢測牛胰島素形成淀粉樣纖維的動力學曲線，透射電鏡觀察纖維形態(tài)；以淀粉樣纖維誘導人紅細胞的聚集和溶血為指標評估纖維對細胞膜的損害作用.結果:牛胰島素在pH，57℃的條件下，可在h開始形成淀粉樣纖維，5種氨基酸即組氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺和精氨酸具有延遲胰島素纖維化的作用，同時改變了淀粉樣纖維的形態(tài).胰島素在形成淀粉樣纖維后可在較低的濃度范圍內(nèi)誘導人紅細胞溶血和聚集，該作用隨著纖維的生長逐漸增強.雖然在氨基酸作用下延遲生長的纖維具有不同的纖維形態(tài)，但并不能改變纖維對細胞膜的損害作用.結論:牛胰島素在形成淀粉樣纖維后具有破壞細胞膜結構的作用.氨基酸可以抑制胰島素的纖維化作用.胰島素纖維對紅細胞膜的損害作用與其形態(tài)和生長動力學無關.

【關鍵詞】淀粉樣纖維；牛胰島素；氨基酸；紅細胞；淀粉樣變性

0引言

許多蛋白質在一定條件下由于錯誤折疊而形成淀粉樣纖維沉積，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少20多種人類疾病與因蛋白的錯誤折疊而導致淀粉樣纖維沉積有關［1-4］.胰島素蛋白在特定條件下容易形成淀粉樣纖維從而可能導致對患者的免疫原性［5］.研究［6-8］表明，精氨酸(Arg)能夠促進錯誤折疊的蛋白質重新折疊而恢復天然活性,并且發(fā)現(xiàn)其有穩(wěn)定蛋白構象的作用.根據(jù)我們近期的實驗結果，所有20種常見氨基酸對蛋白質構象均具有一定的穩(wěn)定作用.我們選取包括Arg在內(nèi)的5種氨基酸，研究其對牛胰島素纖維生長的抑制作用，并以人紅細胞聚集和溶血為指標，探索不同條件下生成的胰島素纖維對細胞膜的損害作用.

1材料和方法

材料新鮮全血來自志愿者捐獻，用枸醛酸抗凝；牛胰島素、硫黃素；其他均為國產(chǎn)分析純試劑.H600型透射電鏡，VarianCaryEclipse型熒光光度計，3k30型冷凍離心機；1240型紫外可見分光光度計(日本島津公司).

方法

胰島素淀粉樣纖維在含有100mmol/LNaCl的鹽酸中配制1g/L牛胰島素水溶液，加入50mmol/L氨基酸，于57℃水浴中孵育，按一定的時間間隔取樣，加入到20mmol/LTrisHCl中，加10μmol/LThT，混勻后檢測ThT熒光強度，激發(fā)波長440nm，發(fā)射波長482nm.制作纖維生長曲線.并同時檢測胰島素纖維生長過程中各級聚集體對紅細胞的損害作用.所有的氨基酸都是相同條件.

纖維形態(tài)觀察取成熟胰島素纖維5μL，用二次蒸餾水5倍稀釋，點樣10μL于鍍膜的銅網(wǎng)上，10min后用濾紙吸干，再滴加10μL雙氧鈾溶液染色，3min后吸干，在透射電子顯微鏡下觀察并拍照.

溶血檢測取新鮮全血于4℃，750g離心10min，吸去上層血漿和白細胞，用等滲PBS洗滌3次.分離的紅細胞用等滲PBS稀釋，加入胰島素纖維，使紅細胞濃度為20mL/L，纖維濃度為g/L.細胞懸液于37℃水浴30min后，4℃，750g離心10min，取上清液于540nm處測A值.

紅細胞聚集取新鮮配制的40mL/L紅細胞加入胰島素纖維，紅細胞終濃度為20mL/L，37℃孵育30min，取15μL滴片觀察并照相.

統(tǒng)計學處理:采用SPSS版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析.

2結果

2．1纖維生長曲線隨著纖維的生長，ThT的熒光強度在經(jīng)過一個快速上升階段后達到平臺期，表明纖維已達到成熟階段，氨基酸的加入延遲了胰島素纖維的生長.其中，Arg的作用最強，在監(jiān)測的12h內(nèi)，熒光值無升高.連續(xù)監(jiān)測至第3日熒光值未見升高.

His：組氨酸；Pro：脯氨酸；Thr：蘇氨酸；Gln：谷氨酰胺；Arg：精氨酸.

圖1胰島素纖維的生長曲線

2．2胰島素的纖維形態(tài)加入His的纖維為長絲狀，纖維的半徑較?。患尤敫彼?，蘇氨酸和谷氨酰胺處理的纖維形態(tài)相似，均聚集呈網(wǎng)束狀，其中Pro處理的纖維比其他纖維更短，半徑也較大.加入Arg的體系在后孵育12h后，蛋白僅以無定形聚集體的形式存在，直至孵育60h后才能觀察到有極少量的纖維.

A:胰島素對照;B:組氨酸;C:脯氨酸;D:蘇氨酸;E:谷氨酰胺;F:精氨酸.

圖2不同生長條件下胰島素纖維20g/L雙氧鈾溶液染色×50000

2．3胰島素纖維的溶血活性和誘導紅細胞聚集的作用溶血作用隨纖維的生長而增強，但在纖維進入成熟階段時其作用有所減弱.對不同條件下生長的纖維的細胞毒性作用進行比較，結果表明胰島素纖維和加入氨基酸后生長的胰島素纖維都具有溶血作用，但差異無統(tǒng)計學意義.加入Arg處理的胰島素在12h時無纖維生長，也不具有溶血活性，72h時仍無明顯溶血作用.較低濃度的胰島素纖維無溶血活性，但有聚集紅細胞的作用，此聚集作用與纖維生長的進程呈正相關.除His以外，這種作用的大小與纖維的形態(tài)無關.加入Arg處理的胰島素在72h內(nèi)無誘導細胞聚集的作用.

3討論

蛋白質由于錯誤折疊而形成淀粉樣纖維沉積，是很多人類疾病的誘因之一.蛋白質聚集后會失去部分A:胰島素蛋白;B:胰島素纖維;C:組氨酸;D:脯氨酸;E:蘇氨酸;F:谷氨酰胺;G:精氨酸.

圖3氨基酸處理后牛胰島素纖維誘導的紅細胞聚集×40

或全部活性，溶解性降低，免疫原性也會發(fā)生改變［4-5，7］.ThT可特異地與淀粉樣纖維結合，在特定的波長下熒光強度的大小與淀粉樣纖維形成的含量成正比［9］.我們的結果表明，加入氨基酸能有效地延遲了纖維的生長.不同氨基酸的延遲作用各有不同，在所選取的5種氨基酸中，Arg作用最強.所以，Arg可以作為一種有效的抑制劑，防止蛋白質制劑的變性和纖維化.在加入氨基酸的體系中，纖維的形態(tài)也有一定程度的改變，加His后形成的纖維為長絲狀，與不加任何氨基酸處理的胰島素纖維形態(tài)部分相似，都是中空結構，只不過后者的纖維較短并聚集成束狀.加Pro，Thr和Gln后形成的纖維無中空結構，呈不同程度的束狀聚集.在Arg存在下，胰島素很難形成淀粉樣纖維.紅細胞溶血和聚集實驗表明，不同纖維的細胞毒性僅有很小的差別.即淀粉樣纖維形態(tài)上的差別并沒有改變其生物毒性，這與目前普遍認為的淀粉樣纖維的細胞毒性主要取決于其中的β折疊結構是一致的.我們的結果表明，小分子氨基酸可以在較小的濃度范圍內(nèi)抑制胰島素的纖維化.因此由一些較強作用的氨基酸組成的寡肽可能會成為蛋白質變性的強力抑制劑.這類抑制劑與合成有機物相比，將具有更好的生物相容性.此外，我們報道了非病原性蛋白胰島素在形成淀粉樣纖維后，與β淀粉樣肽一樣［10］具有誘導細胞內(nèi)容物大量滲透的作用.這種作用與淀粉樣纖維在細胞膜聚集，通過插膜作用破壞細胞膜結構并形成非專一性離子通道密切相關.

【參考文獻】

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