儀器分析課件05分子發(fā)光分析法

第五章分子發(fā)光分析

MolecularLuminescenceAnalysis分子發(fā)光分析（1）分子吸收一定能量后外層電子將由基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，若從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時伴隨光輻射現(xiàn)象，即稱為分子發(fā)光，基于該現(xiàn)象的分析方法為分子發(fā)光分析法（UV-Vis區(qū)）分子發(fā)光的類型光致發(fā)光化學發(fā)光生物發(fā)光按激發(fā)模式熒光磷光按激發(fā)態(tài)類型分子發(fā)光分析（2）分子發(fā)光與UV-Vis應(yīng)用范圍相似，但具有以下特點：靈敏度高；檢出限較UV-Vis法低24個數(shù)量級 原因：黑背景檢測；熒光強度與光源強度呈正比選擇性好；線性范圍寬；發(fā)光參數(shù)多且對所研究體系局部環(huán)境因素敏感；在光學分子傳感器及生物醫(yī)學、藥學和環(huán)境科學方面具有優(yōu)勢適用體系不如UV-Vis廣泛。5-1-1分子熒光/磷光分析原理（1）分子熒光/磷光產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子基態(tài)分子單色器檢測器光源激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，當其返回基態(tài)時，多余的能量將以何種途徑釋放？單重態(tài)與三重態(tài)基態(tài)激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)基態(tài)單重態(tài)至激發(fā)三重態(tài)為禁阻躍遷（難發(fā)生）；5-1-1分子熒光和磷光分析原理（2）去活化：激發(fā)態(tài)分子基態(tài)分子去活化方式發(fā)射光子非輻射躍遷化學反應(yīng)熒光磷光振動馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間跨越速度快、激發(fā)態(tài)壽命短的途徑先發(fā)生熒光的產(chǎn)生吸收激發(fā)單重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動馳豫熒光內(nèi)轉(zhuǎn)換：10-1110-13s振動馳豫：10-1210-14s熒光發(fā)射：10-910-7s無輻射躍遷吸收/激發(fā)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動馳豫熒光振動馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換熒光光譜為帶狀光譜；熒光光譜較吸收光譜紅移；熒光光譜與吸收光譜對稱。磷光的產(chǎn)生吸收激發(fā)單重態(tài)熒光無輻射躍遷激發(fā)三重態(tài)系間跨越磷光系間跨越磷光振動馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換振動馳豫磷光也是帶狀光譜磷光較熒光光譜紅移磷光較熒光壽命長熒光發(fā)射：10-910-7s磷光發(fā)射：10-410s熒光與磷光可能共存內(nèi)轉(zhuǎn)換振動馳豫振動馳豫實驗教學安排與要求學時：44（共11個實驗，具體內(nèi)容及安排見實驗安排表）要求：實驗前自學或溫習相關(guān)理論知識，完成實驗報告預(yù)習部分（注意規(guī)范性）；實驗時必須攜帶預(yù)習報告準時出席；實驗過程中應(yīng)遵守課堂紀律及教師要求成績評定：每次實驗均計入總分，請假無法補做時當次實驗成績?yōu)?，無故缺席一次則總成績?yōu)?注意理論課與實驗課之間的聯(lián)系作業(yè)1第3題編號123移取試樣溶液的體積/mL0.005.005.00加入5.00mgL-1Cu2+標準溶液的體積/mL0.000.002.50用0.1molL-1的HNO3定容至25.00mL所測的儀器信號S0.0100.1650.385用某儀器方法測定試樣中微量Cu含量：稱取試樣0.750g，溶解后定容到100mL容量瓶中作為試樣溶液，測定時溶液的配制及對應(yīng)儀器信號S如下表所示，計算試樣中Cu的質(zhì)量分數(shù)（%）作業(yè)1第5題采用原子吸收光譜法測定水樣中的Mg含量：在5個50mL的容量瓶中分別加入10.00mL水樣、1mL1:1HCl和2.5mL10%SrCl2，再加入不同體積5.00gmL-1

的Mg標準溶液后定容。用空白溶液調(diào)零后依次測定各容量瓶中溶液的吸光度，相關(guān)數(shù)據(jù)見下表，（1）求水樣中Mg的含量（以gmL-1表示）；（2）空白溶液應(yīng)如何配制？容量瓶編號V水樣/mLV標準溶液/mL吸光度A110.0000.082210.001.000.160310.002.000.238410.003.000.318510.004.000.394解：（1）依題可知加入Mg標濃度及對應(yīng)吸光度值如下表：cMg/gmL-100.100.200.300.40A0.0820.1600.2380.3180.394作業(yè)1中存在的問題（1）不寫單位作業(yè)1中存在的問題（2）數(shù)字見用“?”代替“”作業(yè)1中存在的問題（3）等號前后根本不相等作業(yè)1中存在的問題（4）不要用“”代替“=”不要隨便使用符號作業(yè)1中存在的問題（5）科學計數(shù)法要規(guī)范有效數(shù)字不要隨意亂寫作業(yè)1中存在的問題（6）必須用數(shù)據(jù)代入過程！不能使用題目中沒提供的數(shù)據(jù)！作業(yè)1中存在的問題（7）表圖要對應(yīng)！5-1-1分子熒光和磷光分析原理（3）任何熒光（磷光）化合物都具有激發(fā)和發(fā)射兩個特征光譜，這是對其進行定或量定性的基礎(chǔ)。激發(fā)光譜：即激發(fā)效率隨波長變化的曲線。激發(fā)的本質(zhì)就是物質(zhì)吸收光的過程，因此激發(fā)光譜與吸收光譜相似。發(fā)射光譜：又稱熒光（磷光）光譜，指激發(fā)波長固定時，發(fā)光強度對波長變化的曲線。鎂-Oxine的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的繪制激發(fā)光譜：改變激發(fā)波長，測量最強熒/磷光發(fā)射波長em處的強度變化，以激發(fā)波長對熒/磷光強度作圖可得到激發(fā)光譜。發(fā)射光譜：固定激發(fā)波長在最大激發(fā)波長ex處，測定不同發(fā)射波長處的熒/磷/光強度，以發(fā)射波長對熒/磷光強度即可得的熒/磷光的發(fā)射光譜。激發(fā)光譜發(fā)射光譜如何確定ex和em？來源于資料或文獻（需進行驗證）先以該分子的max作為ex掃描發(fā)射光譜，可得em；再固定em掃描激發(fā)光譜，可得ex；若ex=max，終止掃描，若ex=max，應(yīng)反復(fù)掃描直至ex、em不再發(fā)生變化。發(fā)射光譜形狀通常與激發(fā)波長無關(guān)，因此只需少數(shù)幾次掃描，ex、em即可固定。若儀器可測定三維熒光圖，可通過等高線圖確定蒽的三維熒光譜圖（1）固定激發(fā)波長、掃描發(fā)射波長蒽的三維熒光譜圖（2）固定發(fā)射波長、掃描激發(fā)波長蒽的三維等熒光強度光譜5-1-1分子熒光和磷光分析原理（4）熒光光譜的特點Stokes位移熒光發(fā)射光譜形狀與激發(fā)波長無關(guān)鏡像規(guī)則Stokes位移吸收光譜熒光光譜蒽的乙醇溶液吸收光譜熒光光譜熒光發(fā)射光譜形狀與激發(fā)波長無關(guān)蒽-乙醇溶液熒光光譜激發(fā)光譜鏡像規(guī)則電子能級處于基態(tài)和激發(fā)態(tài)的分子振動能級間隔相等。5-1-1分子熒光和磷光分析原理（5）熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件：具有與照射頻率相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)；具有一定的熒光量子產(chǎn)率（f:0.11）Kf:熒光輻射速率Ki:其它過程速率f的大小主要決定與分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，但與分子所處的環(huán)境因素對其也有很大的影響。熒光量子產(chǎn)率f的測定測定待測熒光物質(zhì)與f已知的參比熒光物質(zhì)兩者稀溶液在相同激發(fā)條件下所測得的積分熒光強度（即發(fā)射光譜所包含的面積）和對應(yīng)激發(fā)波長的吸光度，然后按以下公式計算可得：If：積分熒光強度A：吸光度s：參比熒光物質(zhì)x：待測熒光物質(zhì)熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系躍遷類型（*n*）共軛效應(yīng)剛性平面結(jié)構(gòu)取代基效應(yīng)共軛效應(yīng)分子中必須具有大的共軛鍵結(jié)構(gòu)。共軛度越大，發(fā)射波長紅移，發(fā)光強度增加。一般具有高度共軛穩(wěn)定性的芳香族化合物有熒光；單個雜環(huán)芳烴無熒光，而其與苯環(huán)共軛就有熒光；脂肪族和脂環(huán)族化合物通常無熒光。CO-OOCOO-熒光黃苯并芘剛性平面結(jié)構(gòu)COCOO--OCOCOO--OONO-NOMgNOCH2酚酞（無熒光）8-羥基喹啉（弱熒光）聯(lián)二苯＝0.2熒光黃紅色熒光芴＝1.0剛性平面結(jié)構(gòu)可減小分子振動，使分子與溶劑和其他溶劑分子碰撞失活可能性降低取代基的影響給電子基增強熒光：－OH、OR、-NH2、－NHR、－NR2、－C≡N等吸電子基減弱熒光：－COOH、－C=O、－NO2、－N＝N－等重原子效應(yīng)（例：苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，但磷光會增強）分子內(nèi)氫鍵作用—會增加分子平面性和剛性O(shè)HCOOHOHCOOHOHOHCO水楊酸無機熒光材料目前，常見的無機熒光材料是以堿土金屬的硫化物（如ZnS、CaS）、鋁酸鹽（SrAl2O4、CaAl2O4、BaAl2O4）等作為發(fā)光基質(zhì)，以稀土鑭系元素（銪Eu、釤Sm、鉺Er、釹Nd等）作為激活劑和助激活劑。

5-1-1分子熒光和磷光分析原理（6）溶液的熒光（磷光）強度熒光強度與溶液濃度的關(guān)系影響熒光強度的因素溶液熒光的淬滅熒光強度與溶液濃度的關(guān)系熒光強度IF正比于吸收的光強Ia和熒光量子產(chǎn)率f根據(jù)L-B定律，可求出吸收光強Ia的表達式Fclc0.05光源的強度與穩(wěn)定對熒光信號的強度和穩(wěn)定影響極大影響熒光強度的因素溶劑效應(yīng)（一般和特殊：發(fā)生相互作用）溫度和黏度（TF；黏度，F(xiàn)）pH有序介質(zhì)的影響（表面活性劑或環(huán)糊精有增敏效果）內(nèi)濾光與自吸散射光的影響pH值對熒光光譜的影響具酸或堿性基團的有機物質(zhì)，在不同pH值時，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強度將發(fā)生改變；對無機熒光物質(zhì)，因pH值會影響其穩(wěn)定性，也可使其熒光強度發(fā)生改變。OHpH1，有熒光O-pH13，無熒光OH無熒光O-有熒光內(nèi)濾光和自吸體系內(nèi)存在可以吸收激發(fā)光或熒光的物質(zhì)造成熒光強度降低的現(xiàn)象稱為“內(nèi)濾光現(xiàn)象”；若熒光物質(zhì)的熒光短波長與激發(fā)光長波長有重疊，在其濃度較大情況下可吸收自身的熒光而造成熒光強度降低的現(xiàn)象稱為“自吸收”。K2Cr2O7的吸收峰與A，F(xiàn)有重疊共振光散射瑞利散射拉曼光二級共振光散射三級共振光散射散射光的影響熒光分析中常出現(xiàn)Retleigh散射光、容器表面的散射光、Tyndall及拉曼散射等，波長選擇適當，可以消除其影響固定ex=270nm硫酸喹啉及其溶劑（硫酸溶液）在不同激發(fā)波長下的光譜瑞利散射與激發(fā)光波長相等拉曼散射與激發(fā)光波長有關(guān)熒光與激發(fā)波長無關(guān)且紅移溶液熒光的淬滅能引起熒光物質(zhì)熒光強度降低的物質(zhì)稱為淬滅劑，常見淬滅類型有一下幾種：碰撞猝滅（碰撞后無輻射失活）靜態(tài)猝滅（形成非熒光配合物）轉(zhuǎn)入三重態(tài)猝滅（發(fā)生系間跨越，若重原子、溶解氧等）電子轉(zhuǎn)移猝滅基于熒光淬滅現(xiàn)象可實現(xiàn)淬滅劑的分析自猝滅250350450nmF1234丁二酮inCCl410.015mol/L2

0.045mol/L30.150mol/L40.450mol/L5-1-2熒光/磷光光譜儀（1）光源激發(fā)光單色器樣品池檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射光單色器與UV-Vis儀器相比：有兩個獨立的單色器，分別位于光源與樣品池之間（激發(fā)光單色器）和樣品池與檢測器之間（發(fā)射光單色器）光源與檢測器不在同一光路上，以避免透射光的影響（吸收池四面透光）5-1-2熒光/磷光光譜儀（2）光源：通常采用氙燈。激發(fā)器最為理想，高壓汞燈也被采用。單色器：位于樣品池前后獨立兩個，用于選擇激發(fā)/發(fā)射波長樣品池：熔融石英制成，四面透光（固體可直接測定）檢測器：通常采用光電倍增管（PMT），其他光電檢測器也被采用。Perkin-ElmerLS50FluorimeterPerkin-ElmerLS50樣品腔5-1-3熒光/磷光分析法應(yīng)用（1）定量分析方法（標準曲線法）確定測定波長ex/em設(shè)定ex/em及適當狹縫寬度測定標準系列的If，繪制If-c曲線測定未知樣品的If，根據(jù)標準曲線求其濃度需配制適當?shù)目瞻兹芤盒Ｕ瞻仔盘枡z出限低于UV-Vis，但重現(xiàn)性不如UV-Vis狹縫寬度的設(shè)定激發(fā)光單色器發(fā)射光單色器檢測器放大器記錄儀狹縫樣品池激發(fā)光出射狹縫（帶寬）和發(fā)射光出射狹縫（帶寬）直接決定所測熒光的強度，因此實驗中需要合理設(shè)置，通常有2、5、10、20nm幾檔選擇，選擇原則如下：帶寬不應(yīng)超過對應(yīng)光譜的寬度；ex和em相差不大時，應(yīng)適當減小帶寬，以避免干擾；存在干擾物質(zhì)時可適當減小帶寬若待測物質(zhì)見光易分解，應(yīng)適當減小激發(fā)光的出射帶寬，如維生素C、維生素B12等5-1-3熒光/磷光分析法應(yīng)用（2）常規(guī)測定方法直接測定間接測定熒光衍生法熒光淬滅法敏化熒光法多組分混合物的熒光分析直接法測定食品中苯并芘的測定（GB/T5009.27-2003）

環(huán)己烷（石油醚）提取，濃縮層析柱凈化紙色譜分離（用標注物定性）剪下斑點用苯溶解ex=365nm，掃描365460nm范圍內(nèi)的熒光光譜與標準物對比（定性）ex/em=365/406nm處定量。其他例子見課本p98表5.4熒光衍生法根據(jù)衍生手段可分為化學衍生法、電化學衍生法和光化學衍生法?；瘜W衍生法最為常用，所涉及的反應(yīng)有配位、降解、氧化還原、偶聯(lián)、縮合、酶催化等等。熒光法測定血清中的鎂熒光法測定水樣中的過氧化氫NOMgNO其他例子見課本p98表5.5多組分混合物的熒光分析蒽的激發(fā)和發(fā)射光譜菲和蒽的熒光光譜（激發(fā)波長265nm)

——利用共存組分的激發(fā)/發(fā)射光譜的差異實現(xiàn)分別測定蒽和菲的測定菲在360nm以上無吸收，用365nm激發(fā)光時，菲無熒光，可以在400nm測定蒽的熒光。在265nm,蒽和菲均有吸收，以此波長的光激發(fā)，在350nm只有菲有熒光，故可測定菲。5-1-3熒光/磷光分析法應(yīng)用（3）熒光法的其他應(yīng)用測定蛋白質(zhì)及研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)（熒光探針、偏振熒光）免疫分析（或酶聯(lián)免疫分析）或核酸分析中的標記物平板色譜中斑點定位、液相色譜的檢測器其他熒光分析技術(shù)激光誘導熒光/時間分辨熒光/熒光偏振/同步熒光熒光顯微鏡人肝癌細胞5-1-4分子磷光的測定（1）低溫磷光

由于T1壽命較長，為減小非輻射失活的影響，通常需在低溫（液氮）條件下測定磷光。對所用溶劑的基本要求是：易提純且在分析波長區(qū)無強吸收和發(fā)射；低溫下形成具足夠粘度的透明的剛性玻璃體。常用的溶劑：

EPA——乙醇+異戊烷+二乙醚（2+2+5） IEPA——CH3I+EPA（1+10）5-1-4分子磷光的測定（2）室溫磷光（RTP）固體基質(zhì)：以固體基質(zhì)（如纖維素等）吸附磷光物質(zhì)，增加其分子剛性、減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。膠束增穩(wěn)：利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境、增加定向約束力，減小內(nèi)轉(zhuǎn)換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性。利用膠束增穩(wěn)、重原子效應(yīng)和溶液除氧是該法的三要素。敏化磷光：其過程可以簡單表示為：（選擇合適受體是該法關(guān)鍵）5-1-4分子磷光的測定（3）磷光光譜儀

與在熒光光譜儀的基