第三章高效液相色譜

第三章高效液相色譜1第一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四高效液相色譜法一、高效液相色譜法的特點二、流程及主要部件三、固定相和流動相四、主要分離類型五、影響分離的因素第二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四以液體作為流動相的色譜過程HPLC定義第三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四高效液相色譜法的特點高壓

---150~350x105Pa高效---3萬塔板/米高靈敏度---10-9~10-11g高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法第四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四

GCHPLC流動相惰性氣體（無親和性，只起運載作用）氣體、沸點較低的化合物不同極性的液體（有一定親和作用）溫度較高一般室溫分析對象高沸點、不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物、生物大分子、高分子化合物GC與HPLC比較第五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四（一）分配色譜（二）吸附色譜（三）離子交換色譜法（四）排阻色譜法高效液相色譜法的類型第六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四分配色譜液液分配色譜(LLPC)鍵合固定相分配色譜(LSPC)

分配色譜法(PartitionChromatography)液體固定相通過物理吸附固定于載體表面有機分子通過化學反應(yīng)鍵合到載體表面第七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四分配色譜–分離原理不同組分在兩相間分配系數(shù)不同第八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四固定相

---物理吸附（擔體+固定液）全多孔型擔體薄殼型微珠擔體分配色譜固定相固定相

---化學鍵合R---極性基團疏水基團離子交換基團第九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四固定相的化學構(gòu)造非鍵合相表面鍵合相表面ODCC18C8C1Phenyl-NH2-CN第十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四正相HPLC（normalphaseHPLC）：

是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。反相HPLC（reversedphaseHPLC）：

由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱），代表性的流動相是甲醇和乙腈。是當今液相色譜的最主要分離模式。ODS（OctaDecyltrichloroSilane)第十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四正相分配色譜反相分配色譜固定相性質(zhì)極性非極性鍵合基團

極性基團疏水基團流動相性質(zhì)非極性極性出峰順序極性小先出極性大先出第十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四吸附色譜法分離原理溶質(zhì)與流動相分子在吸附劑表面上的吸附競爭第十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四吸附色譜固定相

以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。第十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四離子交換色譜固定相為離子交換樹脂，流動相為無機酸或無機堿的水溶液。

各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。分離原理固定相分離對象離子或可離解的化合物（無機離子、氨基酸、蛋白質(zhì)等）第十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四分離原理根據(jù)樣品分子尺寸大小分離

大分子不能進入多孔中，不被保留，隨Vm流出中分子部分進入多孔中，一般保留小分子完全進入多孔中，長時間保留。排阻色譜法

(凝膠色譜法)第十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四1.軟凝膠：鉸鏈葡萄糖的多孔聚合物，聚丙烯酰胺凝膠。（凝膠過濾色譜）2.半硬凝膠：聚苯乙烯珠（凝膠滲透色譜）高硬凝膠和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，經(jīng)化學鍵合處理，不隨壓力及溶劑改變尺寸，（高效排阻色譜）

排阻色譜固定相第十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四高分子化合物分子量及分子量分布DNA碎片不同堿基支鏈分離。應(yīng)用第十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四流動液貯存提供脫氣輸液泵進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)控制與記錄系統(tǒng)

高效液相色譜儀第十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四日本島津公司第二十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四美國Waters公司第二十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四（1）真空泵抽濾系統(tǒng)（2）低溶性惰性氣體導入替換（3）超聲脫氣（4）在線脫氣流動相脫氣方法第二十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四輸液系統(tǒng)高壓輸液泵：高壓輸液泵是液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復性和準確性。

活塞泵注射泵氣動泵第二十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四進樣系統(tǒng)不使整個壓力變化的情況下將樣品注入色譜柱，通常使用所謂六通閥第二十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四色譜柱色譜柱泵泵12進樣

不使整個壓力變化的情況下將樣品注入色譜柱，通常使用所謂六通閥進樣系統(tǒng)第二十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四色譜柱色譜柱是實現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。第二十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四檢測器

用來連續(xù)監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。紫外-可見檢測器熒光檢測器電化學檢測器蒸發(fā)光散射檢測器質(zhì)譜檢測器第二十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四單波長UV檢測器，光源用Hg燈，加濾光片可以到254，280，313，334，365等。生化中用到很多。多波長光度計類似，光柵或棱鏡分光A＝lg（I0/It)=εbc紫外-可見檢測器第二十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四熒光檢測器 許多有機化合物，特別是芳香族化合物、被一定強度和波長的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長要長的熒光。但可以與發(fā)熒光物質(zhì)反應(yīng)衍生化后檢測。

特點：有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測法高23個數(shù)量級，特別適合于藥物和生物化學樣品的分析。第二十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四熒光檢測器結(jié)構(gòu)示意圖光源檢測器濾光片檢測室第三十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四蒸發(fā)光散射檢測器蒸發(fā)光散射檢測器適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測。第三十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四電化學檢測器（以電導檢測器為例）電導儀電極電極第三十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四標準樣品法譜庫

HPLC-FTIRHPLC-MS定性分析定量分析峰面積∝濃度或質(zhì)量第三十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四小結(jié)四種色譜分離模式的分離機理及應(yīng)用范圍反相色譜的概念紫外可見檢測器常用的固定相和流動相第三十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四高效液相色譜應(yīng)用實例第三十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四

柱后pH調(diào)節(jié)電導檢測對有機酸具有高選擇性和高靈敏度第三十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四有機酸分析系統(tǒng)流程圖2348756

9101

1、2泵3進樣器4柱溫箱5電導檢測器6數(shù)據(jù)處理機7混合室8柱子9流動相10緩沖液第三十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四分析條件分離條件

色譜柱：Shim-packSCR-102H(8mmI.D．×300mmL.)1個或2個分析柱連接

保護柱SCR-102H(6mmI.D.×50mmL.)流動相：5mMp-甲苯亞磺酸水溶液流量：0.8mL/min溫度：40℃或45℃檢測條件緩沖液：20mMBis-tris水溶液

含

5mMp-甲苯亞磺酸和100μＭEDTA流量：0.8mL/min檢測器：電導檢測器

polarity;+第三十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四樣品的分析實例食品啤酒，清酒，葡萄酒，醬油等體液血清，尿等醫(yī)藥品腎的透析液，鈣制劑等發(fā)酵微生物培養(yǎng)液，酸奶等環(huán)境工廠廢水等第三十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四有機酸標準品的色譜圖1一個分析柱

1.磷酸

2.檸檬酸3.丙酮酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.乙酰丙酸10.焦谷氨酸第四十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四啤酒的色譜圖

1.磷酸2.檸檬酸3.丙酮酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.焦谷氨酸10.碳酸前處理振蕩除去碳酸氣后，過濾10μＬ進樣第四十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四清酒的色譜圖

1.磷酸2.檸檬酸3.丙酮酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.乙酸8.焦谷氨酸前處理過濾后，進樣10μＬmin.第四十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四葡萄酒的色譜圖

1.磷酸

2.檸檬酸3.酒石酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.焦谷氨酸前處理用水稀釋10倍后過濾進樣量10μＬ

min.第四十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四

醬油的色譜圖

1.磷酸

2.檸酸3.丙酮酸4.蘋果酸5.琥珀酸6.乳酸7.甲酸8.乙酸9.乙酰丙酸10.焦谷氨酸前處理用水稀釋10倍后過濾進樣量10μＬ第四十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四血清的色譜圖

1.磷酸2.檸檬酸3.丙酮酸4.乳酸5.甲酸6.乙酸7.焦谷氨酸8.未知物前處理加高氯酸用離心法去沉淀物，取上清液5uL進樣第四十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四尿樣的色譜圖

1.磷酸2.檸檬酸3.乳酸4.甲酸5.未知物6.焦谷氨酸7未知物前處理過濾后，進樣10μＬ第四十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四酸奶的色譜圖

1.磷酸

2.檸檬酸3.琥珀酸4.乳酸5.甲酸6.乙酸前處理用水稀釋10倍后過濾進樣量10μＬ第四十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四工廠廢水的色譜圖

1.甲酸2.乙酸3.丙酸4.碳酸5.丁酸6.戊酸前處理過濾后，進樣10μＬ第四十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四食品安全是所有國家的每個消費者關(guān)心的基本問題。殘留農(nóng)藥和獸藥是食品中主要的污染物世界上許多國家制定并實施食品安全法規(guī)，但是在美國、加拿大、歐盟以及日本食品安全法規(guī)更加嚴格的完善。在食品和農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易中，殘留農(nóng)藥和獸藥的檢測中非?？量痰摹Ｊ称钒踩c污染物

第四十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四農(nóng)產(chǎn)品 -谷物：大米等 -豆類：大豆、豌豆等。 -水果：橘柑，蘋果，葡萄等。 -蔬菜：洋白菜（甘藍）、菠菜等 -茶葉，種子，蜂蜜等。食品中殘留檢測

審查農(nóng)藥殘留家畜及水產(chǎn)品 -牛肉，豬肉等 -雞肉、鵪鶉等 -魚類：黃尾魚、虹鱒魚，大馬哈魚等 -蝦，對蝦審查獸藥殘留第五十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四全世界使用的農(nóng)藥超過700種：殺蟲劑，除草劑，殺菌劑，脫葉劑，植物生長調(diào)節(jié)劑。殘留：殘存在農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥（降解緩慢）及其代謝物由以下原因所致：-使用更穩(wěn)定的化學物質(zhì)作農(nóng)藥。-農(nóng)藥的過度使用以及不合理使用。最大殘留限量(MRL)：食品安全的指標，通常MRL≤0.01-0.05mg/kg(ppm)食品中的農(nóng)藥殘留第五十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四農(nóng)藥的殘留（1）有機氯化物：

硫丹、莢蟥醚、克菌丹、抑菌靈、乙酯殺螨醇、溴螨酯、六六六、滴滴涕、異狄氏劑、敵菌丹、狄氏劑、六氯苯、七氯有機磷化物：

苯硫磷，乙硫磷，滅線磷，乙嘧硫磷，硫線磷，喹硫磷，毒死蜱，甲基毒死蜱，毒蟲畏，蔬果磷，敵敵畏，樂果，二嗪磷，甲基嘧啶磷，殺螟硫磷，豐索磷，倍硫磷，稻豐散，丙硫磷，仗殺硫磷，馬拉硫磷，殺撲磷，異稻瘟凈，敵瘟磷，甲基立枯磷，特丁硫磷，抑草磷，苯腈磷，對硫磷，甲基對硫磷，甲拌磷第五十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四氨基甲酸酯：

滅除威，異滅威，甲萘威，滅殺威，抗蚜威，仲丁威，殘殺威，惡蟲威，速滅威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹擬除蟲菊酯

氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯，七氟菊酯，四溴菊酯，氰戊菊酯，氟氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，氯菊酯含氮化合物：

甲氰菊酯，噻嗪酮，吡螨胺，惡霜靈，滅螨猛，三唑醇，三唑酮，氯苯嘧啶醇，氟酰胺，丙環(huán)唑，聯(lián)苯三唑醇，滅銹胺，滅草靈，莠去津，雙苯酸草胺，敵稗，二甲戊靈，氟樂靈，多效唑。農(nóng)藥的殘留（2）第五十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四在過去幾年中，相關(guān)法規(guī)已完成或修訂，控制程度更加嚴格。在歐盟和美國已建立起完整的監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)（參考實驗室；參考材料及標準；計算機監(jiān)視小組等）在樣品凈化，色譜分離和檢測中使用改進的和新的分析技術(shù)及方法，如GC/MS和LC/MS，就會產(chǎn)生更靈敏，更準確和更可靠的結(jié)果。公眾比以前更加關(guān)注食品安全。歐盟和美國現(xiàn)在的形勢第五十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四

滅除威，異滅威，甲萘威，滅殺威，抗蚜威，仲丁威，殘殺威，惡蟲威，克百威

(呋喃丹),速滅威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹

氨基甲酸酯類農(nóng)藥第五十五頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四丁醛肟威草肟威呋喃丹CPMC殘殺威（PHC，Arprocarb）苯噁威

二甲殺威（MPMC）乙硫甲威滅定威甲萘威（NAC）XMC苯氧丁威（BPMC）甲硫威（Mercaptodimethur）異丙威（MIPC）乙肟威甲氧威（MTMC）氨基甲酸酯類農(nóng)藥結(jié)構(gòu)第五十六頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四N-甲基氨基甲酸酯的HPLC分析方法流程圖

1、脫氣裝置10、反應(yīng)試劑輸液機構(gòu)2、低壓梯度裝置11、混合裝置3、流動相輸液機構(gòu)12、熒光檢測器4、梯度混合器13、阻尼盤管5、自動進樣器14、反應(yīng)盤管6、柱溫箱15、反應(yīng)盤管7、分析柱M1，M2：流動相8、化學反應(yīng)箱R1，R2：反應(yīng)試劑液9、脫氣裝置第五十七頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四N-甲基氨基甲酸酯的HPLC分析方法

N-氨基甲酸甲酯類農(nóng)藥的基本化學結(jié)構(gòu)式它們的化合物在堿的條件下加水分解生成甲胺。這里生成的甲胺與一級胺的熒化衍生化試劑O-苯二甲醛（OPA）反應(yīng)，可進行較高靈敏度的熒光檢測。第五十八頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四氨基甲酸酯前處理過程第五十九頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四8成分的N-氨基甲酸甲酯類農(nóng)藥標準試樣同時分析的色譜圖

1994年6月9日官報上登載的成分的分析例

第六十頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四16成分的N-氨基甲酸甲酯類農(nóng)藥標準試樣同時分析的色譜圖第六十一頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四甲硫威及其代謝物甲硫威代謝物高靈敏度分析例

（例如在橘子汁中不得含50ppb以上）

甲硫威的檢測限（S/N=3）為2ppb

第六十二頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四離子色譜離子色譜過渡金屬分析系統(tǒng)CN-離子分析系統(tǒng)第六十三頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四氨基酸分析系統(tǒng)

第六十四頁，共七十一頁，編輯于2023年，星期四氨基酸分析系統(tǒng)

NH2

RCCOOH