基因治療演示文稿

基因治療演示文稿1本文檔共39頁；當前第1頁；編輯于星期六\2點26分（優(yōu)選）第六講基因治療2本文檔共39頁；當前第2頁；編輯于星期六\2點26分一、基因治療的策略

內容提要二、基因轉移技術

四、治療基因的受控表達三、基因干預五、基因治療的應用研究3本文檔共39頁；當前第3頁；編輯于星期六\2點26分

一、基因治療的策略TheStrategyofGeneTherapy4本文檔共39頁；當前第4頁；編輯于星期六\2點26分

（一）基因置換（genereplacement）

定義：指將特定的目的基因導入特定細胞，通過定位重組，以導入的正常基因置換基因組內原有的缺陷基因。

目的：將缺陷基因的異常序列進行橋正。對缺陷基因的缺陷部位進行精確的原位修復，不涉及基因組的任何改變。5本文檔共39頁；當前第5頁；編輯于星期六\2點26分又稱為基因打靶(genetargeting）定點整合的條件:轉導基因的載體與染色體上的DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點，進行部分基因序列的交換，使基因置換這一治療策略得以實現?；蛲粗亟M技術6本文檔共39頁；當前第6頁；編輯于星期六\2點26分要實現基因置換，需要采用同源重組技術使相應的正?；蚨ㄏ驅胧荏w細胞的基因缺陷部位。定向導入的發(fā)生率約1/100萬，采用胚胎干細胞培養(yǎng)的方法，這種同源重組的檢出率最高可達1/10。7本文檔共39頁；當前第7頁；編輯于星期六\2點26分（二）基因添加

基因添加或稱基因增補（geneaugmentation）:通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。類型:在有缺陷基因的細胞中導入相應的正常基因，而細胞內的缺陷基因并未除去，通過導入正?；虻谋磉_產物，補償缺陷基因的功能；向靶細胞中導入靶細胞本來不表達的基因，利用其表達產物達到治療疾病的目的。8本文檔共39頁；當前第8頁；編輯于星期六\2點26分（三）基因干預基因干預（geneinterference）:采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因的結構而使之不能表達，以達到治療疾病的目的。9本文檔共39頁；當前第9頁；編輯于星期六\2點26分（四）自殺基因治療自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。原理:將“自殺”基因導入宿主細胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產生“自殺”效應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。10本文檔共39頁；當前第10頁；編輯于星期六\2點26分自殺基因的作用機制

11本文檔共39頁；當前第11頁；編輯于星期六\2點26分?TK/GCV單純皰疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）轉變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導致細胞死亡。?CD/5-FC大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因，在細胞內將無毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉變成毒性產物5-氟尿嘧啶（5-FU）。1.自殺基因系統(tǒng)12本文檔共39頁；當前第12頁；編輯于星期六\2點26分

旁觀者效應:“自殺基因”治療不僅使轉導了“自殺基因”的腫瘤細胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉導“自殺基因”的腫瘤細胞也被殺死。

2.旁觀者效應13本文檔共39頁；當前第13頁；編輯于星期六\2點26分（五）基因免疫治療通過將抗癌免疫增強細胞因子或MHC基因導入腫瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應。14本文檔共39頁；當前第14頁；編輯于星期六\2點26分二、基因轉移技術

TheTechniqueofGeneTransfer15本文檔共39頁；當前第15頁；編輯于星期六\2點26分基因治療的兩種途徑載體目的基因invivoexvivo靶細胞16本文檔共39頁；當前第16頁；編輯于星期六\2點26分

基因轉移(genetransfer)技術：

1.病毒介導的基因轉移系統(tǒng)。

2.非病毒介導的基因轉移系統(tǒng)。17本文檔共39頁；當前第17頁；編輯于星期六\2點26分

1.病毒介導的基因轉移系統(tǒng)

病毒載體介導的基因轉移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據統(tǒng)計，有72%的臨床實驗計劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉錄病毒載體。18本文檔共39頁；當前第18頁；編輯于星期六\2點26分Retrovirus

（1）逆轉錄病毒

19本文檔共39頁；當前第19頁；編輯于星期六\2點26分20本文檔共39頁；當前第20頁；編輯于星期六\2點26分（1）兩端各有一長末端重復序列LTR。

逆轉錄病毒前病毒的結構特點

（2）LTR由U3、R和U5三部分組成。（3）病毒有三個結構基因（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（ψ）及剪接供體位點(SD)和剪接受體位點(SA)。

（5）含有負鏈DNA轉錄的引物結合位點(PBS)和正鏈DNA轉錄的引物結合位點(PPT)。(1)在U3內有增強子和啟動子；(2)U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS)；(3)在R內還有poly(A)加尾信號。

(1)gag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；(2)pol基因，編碼逆轉錄酶；(3)env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

21本文檔共39頁；當前第21頁；編輯于星期六\2點26分22本文檔共39頁；當前第22頁；編輯于星期六\2點26分逆轉錄病毒介導的基因轉移系統(tǒng)

——由兩部分組成：(1)逆轉錄病毒載體(2)輔助細胞株(如PA317)23本文檔共39頁；當前第23頁；編輯于星期六\2點26分Retroviralpackagingsystem24本文檔共39頁；當前第24頁；編輯于星期六\2點26分

逆轉錄病毒載體的特點

①逆轉錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細胞膜上的特異性受體識別，從而使逆轉錄病毒攜帶的遺傳物質高效地進入靶細胞。

②逆轉錄病毒結構基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。

③前病毒可以高效整合至靶細胞基因組中，有利于外源基因在靶細胞中的永久表達。

④包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。

25本文檔共39頁；當前第25頁；編輯于星期六\2點26分

逆轉錄病毒載體的主要缺點

隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險；逆轉錄病毒載體的容量較小，只能容納7kb以下的外源基因。26本文檔共39頁；當前第26頁；編輯于星期六\2點26分

（2）腺病毒(adenovirus，AV)載體

腺病毒是一種大分子(36kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導的內吞作用進入細胞內，然后腺病毒基因組轉移至細胞核內，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中。

腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現與腫瘤發(fā)生有關聯(lián)。宿主細胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細胞，如神經元等。27本文檔共39頁；當前第27頁；編輯于星期六\2點26分28本文檔共39頁；當前第28頁；編輯于星期六\2點26分腺病毒的優(yōu)點1.基因導入效率高，對人類安全；2.宿主范圍廣；3.基因轉導與細胞分裂無關；4.重組腺病毒可通過口服經腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內滴注；5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因；29本文檔共39頁；當前第29頁；編輯于星期六\2點26分

腺病毒載體缺點2.宿主的免疫反應導致腺病毒載體表達短暫。3.有兩個環(huán)節(jié)可能產生復制型腺病毒。4.靶向性差。

1.不能整合到靶細胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細胞，導入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機會增多，表達時間相對較短。(1)腺病毒產生過程中與293輔助細胞內E1區(qū)序列發(fā)生同源重組；(2)腺病毒載體與被治療的患者體內已感染的野生型腺病毒，甚至乳頭瘤病毒、巨細胞病毒發(fā)生重組。30本文檔共39頁；當前第30頁；編輯于星期六\2點26分

（3）腺病毒相關病毒載體腺病毒相關病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時，才能進行復制和溶細胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。AAVVirusParticles31本文檔共39頁；當前第31頁；編輯于星期六\2點26分StructureofAAVVirusGenomicDNAREP:病毒復制基因,CAP:編碼衣殼蛋白的基因32本文檔共39頁；當前第32頁；編輯于星期六\2點26分AAV的特點●以潛伏感染為主；●病毒基因組與細胞共存；●只要宿主細胞正常，AAV基因表達就處于抑制而維持潛伏狀態(tài)；●若細胞受刺激，表達應激基因，AAV基因表達從而使AAV病毒復制；●產生子代病毒并釋放，又感染新的細胞，建立新的潛伏狀態(tài)。33本文檔共39頁；當前第33頁；編輯于星期六\2點26分AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對人類無致病性。AAV可以高效定點整合至人19號染色體的特定區(qū)域19q13.4中，并能較穩(wěn)定地存在。這種靶向定點整合可以避免隨機整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達，并可受到周圍基因的調控，兼具逆轉錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點。

34本文檔共39頁；當前第34頁；編輯于星期六\2點26分

AAV載體的缺陷：

AAV載體容量小，目前最多只能容納5kb外源DNA片段；感染效率比逆轉錄病毒載體低。在40%-80%的成人中存在過感染，可能會引起免疫排斥。35本文檔共39頁；當前第35頁；編輯于星期六\2點26分

2.非病毒載體介導的基因轉移系統(tǒng)

（1）脂質體介導的基因轉移技術脂質體介導的基因轉移技術使用方便、成本低廉。

基本原理:利用陽離子脂質體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質體，然后與細胞一起孵育，即可通過細胞內吞作用將外源DNA（即目的基因）轉移至細胞內，并進行表達。

36本文檔共39頁；當前第36頁；編輯于星期六\2點26分脂質體介導的基因轉移示意圖37本文檔共39頁；當前第37頁；編輯于星期