第十四章 高效液相色譜法

第十四章高效液相色譜法第一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五學(xué)習(xí)大綱§14-1概述§14-2高效液相色譜儀§14-3液相色譜的固定相與流動相§14-4高效液相色譜的方法§14-5色譜分離方法的選擇第十四章高效液相色譜法一、高效液相色譜法二、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別三、HPLC與GC區(qū)別四、HPLC的特點和應(yīng)用一、高壓輸液系統(tǒng)二、進樣系統(tǒng)三、色譜柱四、檢測器一、液相色譜固定相二、液相色譜的流動相一、分配色譜二、吸附色譜三、離子交換色譜四、離子色譜五、離子對色譜法六、尺寸排阻色譜法七、親合色譜第二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五§14-1概述高效液相色譜(HPLC)是以溶劑液體為流動相的色譜方法。按照固定相不同可分為：液液分配色譜；吸附色譜(液固色譜)；離子交換色譜；尺寸排阻色譜(凝膠滲透色譜)。一、高效液相色譜法早期液相色譜是在直徑1~5cm,長50~500cm的玻璃柱中進行的。填充的固定相顆粒直徑多在150~200μm范圍內(nèi)。但流速低(<1mL/min)，分析時間長；當(dāng)加壓增加流速時，盡管分析時間減少，但Hmin也相應(yīng)增加了，柱效下降了。最為有效地增加柱效的唯一方法是減小填充物的粒徑（3~10μm）！直到60年代，由于在高壓下操作的液壓設(shè)備、高效固定相以及高靈敏檢測器的出現(xiàn)及發(fā)展，才徹底解決了分析時間及柱效的問題。高效液相色譜技術(shù)才真正得到廣泛應(yīng)用。首頁下一頁末頁退出第三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五H－dp關(guān)系圖首頁上一頁下一頁末頁退出第四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五經(jīng)典LCHPLC僅做為一種分離手段分離和分析柱內(nèi)徑1～3cm固定相粒徑>100μm且不均勻柱內(nèi)徑2～6mm固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）常壓輸送流動相高壓輸送流動相柱效低（H↑，n↓）柱效高（H↓，n↑）無法在線檢測可以在線檢測分析周期長分析時間大大縮短二、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段首頁上一頁下一頁末頁退出第五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五三、HPLC與GC區(qū)別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測差別：分析對象的差別和流動相的差別1、分析對象GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測，占有機物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性限制，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機物的80%首頁上一頁下一頁末頁退出第六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五2、流動相差別GC：流動相為惰性氣體,組分與流動相無親合作用力，只 與固定相作用。HPLC：流動相為液體，與組分間有親合作用力，為提高柱 的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大 作用流動相種類較多，選擇余地廣，流動相極性和 pH值的選擇也對分離起到重要作用。選用不同比例 的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選 擇性。3、固定相差別液相色譜固定相類型多，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜的固定相有限。4、操作條件差別GC：加溫操作HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。惠^低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。根據(jù)實際情況也可采用控溫方式，以提高分離速度。首頁上一頁下一頁末頁退出第七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五由于液體的擴散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，柱外效應(yīng)就顯得特別重要；而在氣相色譜中，柱外區(qū)域擴張可以忽略不計。液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復(fù)雜，價格昂貴。在實際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補充的。第八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五四、HPLC的特點和應(yīng)用“三高”、“一快”、“一廣”高柱效——遠(yuǎn)高于一般LC高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣（可分析80%有機化合物）首頁上一頁末頁退出第九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五分析應(yīng)用食品添加劑殘留“天然”化合物酸類化合物抗生素氨基酸抗氧化劑霉菌毒素酯類化合物防腐劑無機離子糖人工甜味劑農(nóng)藥維生素香料化合物無機離子色素首頁上一頁下一頁末頁退出第十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五HPLC儀器包括：1、高壓輸液裝置

2、進樣系統(tǒng)3、分離系統(tǒng)4、檢測系統(tǒng)此外還配有梯度淋洗、自動進樣和數(shù)據(jù)處理裝置HPLC工作過程示意圖首頁上一頁下一頁末頁退出第十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五首頁上一頁下一頁末頁退出分析前，選擇適當(dāng)?shù)纳V柱和流動相，開泵，沖洗柱子，待柱子達(dá)到平衡而且基線平直后，用微量注射器把樣品注入進樣口，流動相把試樣帶入色譜柱進行分離，分離后的組分依次流入檢測器的流通池，最后和洗脫液一起排入流出物收集器。當(dāng)有樣品組分流過流通池時，檢測器把組分濃度轉(zhuǎn)變成電信號，經(jīng)過放大，用記錄器記錄下來就得到色譜圖。第十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五一、高壓輸液系統(tǒng)（150～350×105Pa）

1、貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔徑約2μm，可防止顆粒物進入泵內(nèi)。

2、脫氣：流動相使用前必須進行脫氣，以防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會造成熒光猝滅。常用的脫氣方法比較：

氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機相。超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。在線真空脫氣法：真空脫機利用膜滲透技術(shù)，在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。

首頁上一頁下一頁末頁退出第十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五3、輸液泵：輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%，這對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100ml/min；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300kg/cm2；④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。恒壓泵：保持輸出壓力恒定，適于柱的勻漿填充。流量隨外界阻力變化而變化，保留時間的重現(xiàn)性差，如果系統(tǒng)阻力不發(fā)生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。

恒流泵：能給出恒定流量的泵，其流量與流動相粘度和柱滲透無關(guān)。首頁上一頁下一頁末頁退出第十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五4、梯度洗脫裝置：梯度洗脫是在一個分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。

外梯度：利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度：一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。首頁上一頁下一頁末頁退出第十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五梯度洗脫類似GC中程序升溫，梯度洗脫的實質(zhì)是通過不斷地變化流動相的強度，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。流動相A洗脫時，若樣品中各成分容量因子Ｋ相差大，大的峰寬而低且分析時間長。流動相B溶解力強。洗脫時，各成分很快出來，則K(1.2)小的峰達(dá)不到分離。A→B若將A、B流動相的組成隨時間改變，則即分離好，又縮短分析時間。首頁上一頁下一頁末頁退出第十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五在進行梯度洗脫時必須充分重視：①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達(dá)到完全平衡。首頁上一頁下一頁末頁退出第十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五二、進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)包括進樣口、注射器和進樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進行分離。

1、隔膜注射進樣：使用微量注射器進樣。裝置簡單、死體積小。但進樣量小且重現(xiàn)性差。2、高壓進樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進樣量可由樣品管控制，因此進樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好。首頁上一頁下一頁末頁退出第十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五進樣系統(tǒng)高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術(shù)要求較嚴(yán)。第十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五三、色譜柱1、對色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長多為10~30cm，內(nèi)徑為4~5mm(尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱內(nèi)徑更大)2、柱的填充：主要采用勻漿法。平衡密度法：使溶劑密度和填充顆粒密度相近，此時顆粒沉降速度趨于0。常用的勻漿試劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：采用粘度較大的試劑，如CCl4，CH3OH,丙酮，二氧雜環(huán)已烷、THF等。填充方法：填充時，按上述方法制作勻漿液，用流動相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無空氣進入(影響填充均勻性)。首頁上一頁下一頁末頁退出第二十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五檢測器

檢測器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一。對檢測器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對溫度和流量的變化不敏感等。在液相色譜中，有兩種類型的檢測器，一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)。屬于此類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等；另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理和化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)。屬于此類檢測器有示差折光檢測器等。第二十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五四、檢測器1、紫外檢測器其檢測原理和UV-Vis方法一樣。只是此時所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程為2-10mm,體積約為1~10μL。HPLC分析中，約有80%的物質(zhì)可以在254nm或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。因此該類檢測器應(yīng)用很廣。在選擇測量波長時注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的最低使用波長。首頁上一頁下一頁末頁退出第二十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五二極管陣列（PDA）檢測器首頁上一頁下一頁末頁退出第二十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五首頁上一頁下一頁末頁退出第二十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對光的折射率不同，其中一束光（通常是通過樣品+溶劑相）因為發(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強度差發(fā)生變化，將此差示信號放大并記錄，該信號代表樣品的濃度。2、熒光檢測器許多有機物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強的活性。熒光檢測器是一種選擇性很強的檢測器，其靈敏度比UV檢測器高2~3個數(shù)量級。3、示差折光檢測器為通用型檢測器，靈敏度為10-7g/mL。但對溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。首頁上一頁下一頁末頁退出第二十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五4、安培檢測器由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池（體積為1~5μL）組成。該檢測器是利用待測物流入反應(yīng)池時在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，兩電極間就有電流通過，此電流大小與待測物濃度成正比。采用安培檢測器時，流動相必須含有電解質(zhì)，且呈化學(xué)惰性。它最適于與反相色譜匹配。但此檢測器只能檢測具有電活性的物質(zhì)。首頁上一頁下一頁末頁退出第二十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五5、電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器主要用于離子色譜的檢測。其原理是基于待測物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來測量電離物質(zhì)的含量。電導(dǎo)檢測器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。另外，當(dāng)pH>7時，該檢測器不夠靈敏。6、其它檢測器MSIREvaporativelightscatteringdetector(光散射)極譜首頁上一頁下一頁末頁退出第二十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五檢測器性能指標(biāo)（1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速和溶劑的影響。噪音和漂移都會影響測定的準(zhǔn)確度，應(yīng)盡量減小。

（2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測器時所給出的信號大小。對濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位為mV·ml/g。對質(zhì)量型檢測器，它表示在單位時間內(nèi)通過檢測器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號的大小，單位為mV·s/g。（3）檢測限(detectionlimit)：指恰好產(chǎn)生可辨別的信號時進入檢測器的某組分的量。又稱為敏感度(detectability)。D＝3N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小。檢測限是檢測器的一個主要性能指標(biāo)，其數(shù)值越小，檢測器性能越好。首頁上一頁下一頁末頁退出第二十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五（4）線性范圍(linearrange)：指檢測器的響應(yīng)信號與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下，最大與最小進樣量（濃度型檢測器為組分在流動相中的濃度）之比。線性范圍一般可通過實驗確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些，能同時測定主成分和痕量成分。（5）池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測器的池體積都小于10µl。在使用細(xì)管徑柱時，池體積應(yīng)減少到1~2µl甚至更低，不然檢測系統(tǒng)帶來的峰擴張問題就會很嚴(yán)重。而且這時池體、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計，否則會嚴(yán)重影響柱效和靈敏度。首頁上一頁末頁退出第二十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五§14-3液相色譜的固定相與流動相一、液相色譜固定相stationaryphasesofLC1、液-液分配及離子對分離固定相（1）全多孔型擔(dān)體由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；首頁下一頁末頁退出第三十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣；c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N首頁上一頁下一頁末頁退出第三十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五化學(xué)鍵合固定相的特點（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定；（3）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；（4）有利于梯度洗脫；（5）存在著雙重分離機制（鍵合基團的覆蓋率決定分離機理）高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；首頁上一頁下一頁末頁退出第三十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五2、離子交換色譜分離固定相結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂

薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相

薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團）樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）首頁上一頁下一頁末頁退出第三十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五3、空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠

葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠

苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠；非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑。（3）硬質(zhì)凝膠

多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶颍哂泻愣讖胶驼６确植肌?、液-固吸附分離固定相種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；首頁上一頁下一頁末頁退出第三十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五二、液相色譜的流動相mobilephasesofLC1、流動相特性（1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2、流動相類別按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。首頁上一頁下一頁末頁退出第三十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五3、流動相選擇在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。

采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。常用溶劑的極性順序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)首頁上一頁下一頁末頁退出第三十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五4、選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）高效液相色譜靈敏度高，盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。不純的溶劑還會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。（2）化學(xué)穩(wěn)定性好，避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）溶劑與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強烈吸收，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達(dá)到最高靈敏度。（5）低粘度（粘度適中）

若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。首頁上一頁末頁退出第三十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五§14-4高效液相色譜的方法

按分離原理可將HPLC分為分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜等。一、分配色譜1、原理：根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動相的移動，這種分配平衡需進行多次，造成各待測物的遷移速率不同，從而實現(xiàn)分離的過程。2、流動相:HPLC分析中，為防止固定相的流失，流動相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜（流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）和反相分配色譜（流動相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）。首頁下一頁末頁退出第三十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五液液色譜固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類：（1）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體），由直徑為30~40m的實心玻璃球和厚度約為1~2m的多孔性外層所組成。（2）全多孔型載體，由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑30~50m的多孔型顆粒。（3）全多孔型微粒載體，由nm級的硅膠微粒堆積而成，又稱堆積硅珠。這種載體粒度為5~10m。由于顆粒小，所以柱效高，是目前使用最廣泛的一種載體。第三十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五由于液相色譜中，流動相參與選擇作用，流動相極性的微小變化，都會使組分的保留值出現(xiàn)較大的差異。因此，液相色譜中，只需幾種不同極性的固定液即可因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：β,β’-氧二丙腈、聚乙二醇、三甲撐二醇、十八烷、角鯊?fù)?。根?jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機械涂漬型和化學(xué)鍵合型，后者應(yīng)用更為廣泛。

3、固定液（1）機械涂漬固定相：

將固定液通過機械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體(5-10%涂布量)上形成的液液色譜固定相。該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。

為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動相進入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和。這種色譜方法適合于分離芳烴、稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物首頁上一頁下一頁末頁退出第四十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五（2）化學(xué)鍵合固定相Si-O-R：對熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強極性會水解，使酯鏈斷裂，因此只適于以不含水或醇的流動相。Si-R(或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使用水溶液作流動相時，其pH應(yīng)在4-8之間。Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對水穩(wěn)定。首頁上一頁下一頁末頁退出第四十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五液—固色譜法

固定相是固體吸附劑。吸附劑是一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心。根據(jù)各組分在固定相上的吸附能力的差異進行分離。吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和理化性質(zhì)，試樣的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)等。組分與吸附劑的性質(zhì)相似時；當(dāng)組分分子結(jié)構(gòu)與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結(jié)構(gòu)相適應(yīng)時，易于吸附，呈現(xiàn)高的保留值。吸附色譜成為分離幾何異構(gòu)體的有效手段；不同的官能團具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族分離化合物。吸附色譜對同系物沒有選擇性（即對分子量的選擇性?。?，不能用該法分離分子量不同的化合物。第四十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五液—固色譜法固定相采用的固體吸附劑按其性質(zhì)可分為極性和非極性兩種類型。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。非極性吸附劑最常見的是活性炭。極性吸附劑可進一步分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等，堿性吸附劑有氧化鋁、氧化鎂和聚酰胺等。酸性吸附劑適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質(zhì)，如酚、羧和吡咯衍生物等。各種吸附劑中，最常用的吸附劑是硅膠，其次是氧化鋁。第四十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五液—固色譜法流動相必須符合下列要求：（1）能溶解樣品，但不能與樣品發(fā)生反應(yīng)。（2）與固定相不互溶，也不發(fā)生不可逆反應(yīng)。（3）粘度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效。（4）應(yīng)與所用檢測器相匹配。例如利用紫外檢測器時，溶劑要不吸收紫外光。（5）容易精制、純化、毒性小，不易著火、價格盡量便宜等。在液-固色譜中，選擇流動相的基本原則是極性大的試樣用極性較強的流動相，極性小的則用低極性流動相。為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種、三種或更多種不同極性的溶劑混合起來使用，如果樣品組分的分配比k值范圍很廣則使用梯度洗脫。第四十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五化學(xué)鍵合相色譜法化學(xué)鍵合固定相一般都采用硅膠（薄殼型或全多孔微粒型）為基體。在鍵合反應(yīng)之前，要對硅膠進行酸洗、中和、干燥活化等處理，然后再使硅膠表面上的硅羥基與各種有機物或有機硅化合物起反應(yīng)，制備化學(xué)鍵合固定相。鍵合相可分為四種鍵型：（1）硅酸酯型（=Si-O-C=）鍵合相將醇與硅膠表面的羥基進行酯化反應(yīng)，在硅膠表面形成（=Si-O-C=）鍵合相。反應(yīng)生成單分子層鍵合相。一般用極性小的溶劑洗脫，分離極性化合物。（2）硅氮型（=Si-N=）鍵合相如果用SOCl2將硅膠表面的羥基先轉(zhuǎn)化成鹵素（氯化），再與各種有機胺反應(yīng)，可以得到各種不同極性基因的鍵合相?？捎梅菢O性或強極性的溶劑作為流動相。（3）硅碳型（=Si-C=）鍵合相將硅膠表面氯化后，使Si-Cl鍵轉(zhuǎn)化為Si-C鍵。在這類固定相中，有機基團直接鍵合在硅膠表面上。（4）硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）鍵合相將硅膠與有機氯硅烷或烷氧基硅烷反應(yīng)制備。這類鍵合相具有相當(dāng)?shù)哪蜔嵝院突瘜W(xué)穩(wěn)定性，是目前應(yīng)用最為廣泛的鍵合相。第四十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五化學(xué)鍵合相色譜法正相鍵合色譜法將固定液的官能團鍵合在載體的表面，而構(gòu)成化學(xué)鍵合相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜法（BPC）。該法主要用于分離異構(gòu)體，極性不同的化合物，特別是用來分離不同類型的化合物。（1）分離機制：

分配過程：組分在兩相間進行分配，極性強的組分分配系數(shù)大

吸附過程：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力（誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力）（2）固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相（3）流動相：極性小（同LSC）底劑+有機極性調(diào)節(jié)劑例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇首頁上一頁下一頁末頁退出第四十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五（4）流動相極性與k的關(guān)系：流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓（5）出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱。（6）適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍小）分離物質(zhì)也相似。氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性，分析極性大物質(zhì)、糖類等。首頁上一頁下一頁末頁退出第四十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五反相鍵合相色譜（1）分離機制：疏溶劑理論

把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有強的疏水特性。當(dāng)用水與有機溶劑所組成的極性溶劑為流動相來分離有機化合物時：一方面非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會從水中被“擠”出來，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用。另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，使它離開固定相，減少保留值，此即解締過程。這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。（2）固定相：極性小的烷基鍵合相

C8柱，C18柱（ODS柱）（3）流動相：極性大的甲醇-水或乙腈-水流動相極性>固定相極性

底劑+有機調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑）

例：水+甲醇，乙腈，THF首頁上一頁下一頁末頁退出第四十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五正相和反相鍵合色譜法正相鍵合色譜中，隨流動相極性增加，組分分配比k增加。在HPLC分析中，有時要在流動相中加入適量的鹽(碳酸銨、四烷基銨鹽)或酸，其目的都是為了防止峰形拖尾。加入鹽類是為了減少待測物與鍵合相表面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類待測物的離解，使其以游離酸在柱內(nèi)分離。首頁上一頁下一頁末頁退出第四十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五正、反相色譜中極性和保留時間的關(guān)系首頁上一頁下一頁末頁退出第五十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五可見：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長（極性越小），分離效果越好。首頁上一頁下一頁末頁退出第五十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五首頁上一頁下一頁末頁退出第五十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五

第五十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五化學(xué)鍵合色譜具有下列優(yōu)點：（1）適用于分離幾乎所有類型的化合物。一方面通過控制化學(xué)鍵合反應(yīng)，可以把不同的有機基團鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以通過改變流動相的組成合乎種類來有效地分離非極性、極性和離子型化合物。（2）由于鍵合到載體上的基團不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件。（3）鍵合固定相對不太強的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。（4）固定相柱效高，使用壽命長，分析重現(xiàn)性好。第五十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五離子交換色譜此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測定各類陰、陽離子的分離分析方法。它既適于無機離子，也適于有機物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。1、原理：利用不同待測離子對固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來實現(xiàn)分離的。待測離子與離子交換樹脂固定相上帶電荷基團或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：對陽離子，滯留時間從大到小的順序為：Fe3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Cu2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,UO22+,Tl+,Ag+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+

對陰離子，滯留時間從大到小的順序為：檸檬酸根,SO42-,C2O42-,I-,HSO4-,NO3-,CrO42-,Br-,SCN-,Cl-,HCOO-,CH3COO-,OH-,F-

首頁上一頁下一頁末頁退出第五十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五一般形式：R一A＋B＝R－B＋A達(dá)平衡時，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：式中[A]r，[B]r分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（B）的濃度，[A]、[B]則代表它們在溶液中的濃度。KB/A越大，說明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。第五十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五2、固定相按離子交換劑類型分四種：按固定相制作方法可分為：多孔型離子交換樹脂(包括微孔型和大孔型)；表面多孔型(包括薄膜型）離子交換樹脂；離子交換鍵合型。首頁上一頁下一頁末頁退出第五十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五（1）多孔型聚苯乙烯+二乙烯苯交聯(lián)，分微孔型和大孔型。交換基團多——交換容量大，穩(wěn)定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分析速度慢。（2）表面多孔型薄膜型=惰性核+樹脂薄層(1-2μm)多孔型=惰性核+硅膠微球+樹脂薄層克服了多孔型離子交換樹脂的不足，但交換容量低，柱子易超負(fù)荷。首頁上一頁下一頁末頁退出第五十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五（3）離子交換鍵合相

利用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團鍵合到惰性載體表面。載體可以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微粒。使用后者為載體，可得到性能穩(wěn)定、耐壓、高柱效的柱子。

3、流動相

離子交換色譜流動相為鹽類緩沖溶液(有一定pH和離子強度)，通過改變pH、緩沖劑類型、離子強度、加入有機試劑和配位劑等條件來控制分配比k，改變交換劑的選擇性，進而影響樣品待測物的分離。

pH值：影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分?jǐn)?shù)。當(dāng)組分以分子形式存在時，則不被保留；離子分?jǐn)?shù)越高，保留值越大。常用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。要視不同情況而定。例如，分離有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可通過改變流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結(jié)果相反。但無論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。

首頁上一頁下一頁末頁退出第五十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五無論在強的還是弱的陰離子交換柱上，蛋白質(zhì)均顯示不同pH值影響結(jié)果，因此決定了它的保留選擇性、分離度和回收率等因素。首頁上一頁下一頁末頁退出第六十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五首頁上一頁下一頁末頁退出第六十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五離子強度I：對保留值的影響比pH更大。組分保留值受流動相中鹽類總濃度控制。增加外加陰或陽離子將增加它們對-R+或-R-的競爭能力，使組分保留值減小。通過加入不同種類的鹽，可影響柱的選擇性，因為不同物質(zhì)對交換劑的親和能力不同。有機溶劑：外加有機溶劑通常減小組分的保留值。其極性越小，保留值越小。常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。配離子L：當(dāng)大量L和組分X隨流動相進入柱后，發(fā)生配位劑交換：RM-L+X??RM-X+L。該法用于分離各種氨基酸或堿類。首頁上一頁下一頁末頁退出第六十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五四、離子色譜離子色譜(IC)是70年代發(fā)展的新方法。其分離原理與離子交換色譜原理一樣，只是流出的各種離子用電導(dǎo)檢測器檢測。但由于流動相都是強電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測離子約高2個數(shù)量級，這種強背景電導(dǎo)會完全掩蓋待測離子信號。為解決此問題，1975年Small提出，在離子交換柱之后，再串結(jié)一根抑制柱。該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動相，從而可用電導(dǎo)檢測器檢測各種離子的含量。例如：分析陽離子時，以無機酸為流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換樹脂，則發(fā)生下列反應(yīng)：R+—OH+HCl(流動相)——R+—Cl-+H2OR+—OH+MCl(待測物)——R+—Cl+M+OH-可見，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。首頁上一頁下一頁末頁退出第六十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五由反應(yīng)可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動相本底電導(dǎo)的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2．6倍，提高了所測陽離子電導(dǎo)的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機理。在分離柱后加一個抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了分離度。后來，F(xiàn)rits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。第六十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五優(yōu)點：（1）分析速度快可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個試樣的分析；（2）分離能力高在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱首頁上一頁下一頁末頁退出第六十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期五該法的不足之處在于：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過抑制柱后會展寬，降低分離