第五章 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

第五章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR基因放大連瑣反應(yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)簡稱PCR，是以DNA為模板，利用DNA聚合酶的特性體外擴(kuò)增特定的基因片斷，這種方法被稱為DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。第二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)InventedbyKaryMullisin1983.Firstpublishedaccountappearedin1985.AwardedNobelPrizeforChemistryin1993.第三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)KaryB.Mullis（1944－）TheNobelPrizeinChemistry1993第四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)，1987獲專利。1986，PE-Cetus公司發(fā)現(xiàn)并純化出適用于PCR的耐熱DNA聚合酶1987，PE-Cetus公司推出PCR自動化熱循環(huán)儀1988，PE-Cetus公司獲得基因工程方法生產(chǎn)的耐熱DNA聚合酶1989，PE-Cetus公司獲得PCR方法、天然Taq酶及重組Taq酶三項專利1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。第五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）第一節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增原理第二節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系第三節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物設(shè)計原則第四節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)類型第五節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)應(yīng)用第七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)PCR擴(kuò)增原理DNA體內(nèi)復(fù)制PCR原理第八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)PCR擴(kuò)增原理第九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)PCR擴(kuò)增原理

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。①模板DNA變性：模板DNA經(jīng)93℃左右加熱一定時間后，雙鏈DNA模板或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離成為單鏈。②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合。③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的單鏈。變性--退火--延伸三步驟的重復(fù)循環(huán)，就可獲得更多的“模板互補(bǔ)鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。多次循環(huán)后目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。第十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)PCR擴(kuò)增原理DNA模板的變性：將待擴(kuò)增DNA加熱到950C左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈（即：使模板DNA或延伸后的雙鏈DNA發(fā)生熱變性），并游離于反應(yīng)體系中作為模板；模板與引物的結(jié)合（退火或復(fù)性）：將體系溫度降至合適溫度（550C左右），使加入的引物與模板DNA兩端（3ˊ端）堿基序列互補(bǔ)結(jié)合。（由于加入的引物量遠(yuǎn)多于模板量，所以引物與模板的結(jié)合比例遠(yuǎn)大于模板自身的復(fù)性）；引物延伸：將體系溫度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按堿基互補(bǔ)原則連接在DNA引物3ˊ端，使引物延伸，形成兩條與模板互補(bǔ)的新鏈。以上為一次PCR循環(huán)（變性、復(fù)性和延伸）

（新合成的鏈可作為下一輪循環(huán)的模板）按照上述步驟重復(fù)操作，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增。模板DNA擴(kuò)增倍數(shù)T=2n(n:循環(huán)次數(shù))。第十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)PCR擴(kuò)增原理PCR的基本原理變性、復(fù)性、半保留復(fù)制一生二，二生四，四生萬物

PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右PCR過程

變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)PCR擴(kuò)增原理1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1-3步,循環(huán)20-30次目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本循環(huán)第十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)PCR擴(kuò)增原理第十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系一、PCR反應(yīng)操作程序以30μl體系為例各種成分的實際用量應(yīng)根據(jù)實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的儲備液濃度進(jìn)行核算

10×buffer：

1×30/10=3μl

MgCl2:1.5×30/25=1.8μl

dNTPs:0.2×30/10=0.6μl

引物P：

0.4×30×2/10=2.4μl

Taq酶(5U/μl)：1/5=0.2μl

模板：1μl

水：30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl第十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系一、PCR反應(yīng)操作程序操作示例：

5份標(biāo)本總體積30μl×6=180μl1.取一0.5mlEp管，依次加入下列試劑：

10×buffer：3μl×6=18μlMgCl2:1.8μl×6=10.8μldNTPs:0.6μl×6=3.6μl

引物P：2.4μl×6=14.4μlTaq酶(5U/μl)：0.2μl×6=1.2μl

水：21μl×6=126μl

共174μl，先用移液器/指彈混勻，后用離心機(jī)瞬時混勻（管壁上液體沉至管底）。第十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系一、PCR反應(yīng)操作程序

2.另取5支0.2mlEp管，分別加入上述液體29μl。

3.分別取標(biāo)本模板各1μl，加入上述5支Ep管中，混勻，分別加入2滴液體石蠟（防止加溫過程中液體蒸發(fā)影響反應(yīng)體積），離心機(jī)瞬時離心，備用。

4.反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增儀

94℃5m′,(94℃30″，55℃30″，72℃

1′，35個循環(huán))，72℃延伸5′。第十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系二、PCR反應(yīng)的成份1.緩沖液

10～50mMTris-Cl(pH8.4)

維持Taq酶作用環(huán)境的偏堿性

25～50mMKCl

促進(jìn)引物退火，>50mM會抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)

對酶有一定的保護(hù)性，如質(zhì)量不好將起相反的作用，建議使用乙?；腂SA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇(DTT)也有類似作用。第十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系二、PCR反應(yīng)的成份2.MgCl2

1.5～2.0mMTaq酶具有Mg2+依賴性，顯著影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)量，過量能增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率，過低則酶活性顯著下降。第十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系二、PCR反應(yīng)的成份3.dNTPs

dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物

0.02～0.2mMdNTPs可與Mg2+結(jié)合，應(yīng)注意Mg2+濃度與dNTPs

濃度之間的關(guān)系，Mg2+濃度比dNTPs濃度高0.2～2.5mM。過高：加快反應(yīng)速度，還可增加堿基的錯誤摻入率和室驗成本。過低：反應(yīng)速度下降，可提高實驗的精確性。第二十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系二、PCR反應(yīng)的成份4.引物(Primer-P)

預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。

0.2～1μM

偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。5.TaqDNA聚合酶：耐高熱

0.5～5U/100μl

1U/25～50μl

偏高：引物非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增偏低：產(chǎn)物量降低第二十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系二、PCR反應(yīng)的成份6.模板DNA(Template)

最低102

～105bpDNA片段，實際用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過此量，用量需在實驗中摸索。1～5μl

過高：非特異產(chǎn)物增加過低：產(chǎn)量降低7.水去離子水，補(bǔ)足整個反應(yīng)體積第二十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系三、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化1、溫度、循環(huán)參數(shù)⑴變性溫度和時間：保證模板DNA解鏈完全是保證整個PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90～95℃，30～60s，再復(fù)雜的DNA分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時間。一般情況下選擇94℃30″，可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。第二十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系三、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化1、溫度、循環(huán)參數(shù)

⑵復(fù)性溫度和時間：

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度的選擇，可根據(jù)引物的長度和G+C含量確定，長度在15～25bp之間時，復(fù)性溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)計算得到，一般位于40～60℃，30～60s。復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。一般情況下選擇55℃30″，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。第二十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系三、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化1、溫度、循環(huán)參數(shù)⑶延伸溫度和時間：一般位于Taq酶最適作用溫度70～75℃之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70～75℃。延伸反應(yīng)時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，<1Kb，1分鐘足夠；>1Kb需加長延伸時間，10Kb片段延伸時間可達(dá)15分鐘。延伸時間過長可出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，常用72℃1′。第二十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系三、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化1、溫度、循環(huán)參數(shù)⑷循環(huán)數(shù)：其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20～25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20～30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。第二十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系三、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

2、MgCl2濃度

可顯著影響PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性1.5～2.0mM

過高：增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率過低：酶活性顯著下降。

3、引物

0.2～1μM

偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。引物設(shè)計原則：總原則是提高擴(kuò)增的效率和特異性第二十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系平臺期與平臺效應(yīng)

1.平臺效應(yīng)（plateaueffect）

PCR經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，DNA片段不再呈指數(shù)累積，而是進(jìn)入靜止期即平臺期。第二節(jié)PCR體系第二十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)PCR體系平臺期影響因素：

1.引物及dNTP底物濃度降低。

2.酶與模板比例下降。

3.最終產(chǎn)物的阻化作用（焦磷酸鹽、雙鏈DNA）

4..非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體與反應(yīng)模板的競爭作用

5.濃度在10-8mol/L時的特異引物的重退火（延伸率降低，TapDNA聚合酶消耗，產(chǎn)物鏈分叉，引物移位）

6.變性和在高產(chǎn)物濃度下產(chǎn)物分離不完全

實際應(yīng)用提示：定量PCR應(yīng)考慮平臺期效應(yīng)，選擇最適循環(huán)次數(shù)。第二十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)PCR引物設(shè)計原則引物設(shè)計缺陷而引起的后果第三十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)PCR引物設(shè)計原則1.引物長度：15-30bp，常用為20mer左右引物的有效長度不能大于38mer，否則最適延伸溫度會超過Taq

DNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性2.引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段3.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列4.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶第三十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)PCR引物設(shè)計原則5.引物3’端的堿基要求嚴(yán)格配對特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗6.引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處7.引物的特異性引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性8.引物量每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會

RT-PCR引物設(shè)計特別注意：跨越兩個外顯子第三十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)PCR引物設(shè)計原則引物5′端修飾技術(shù)附加核酸序列用途

限制酶位點(diǎn)克?。ㄈ缍ㄏ蚩寺。┦删w啟動子合成RNA探針、測序蛋白質(zhì)結(jié)合序列產(chǎn)物純化、檢測核糖體結(jié)合序列高效表達(dá)加錯配堿基造成突變定點(diǎn)誘變第三十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)PCR引物設(shè)計原則簡并引物（degenerateprimers）（補(bǔ)充）

針對某一基因編碼蛋白的氨基酸區(qū)域設(shè)計的一組堿基序列不同，但有相同堿基數(shù)的寡核苷酸混合物。

簡并引物設(shè)計及應(yīng)用

1.對純化的未知蛋白測定一段短氨基酸序列。

2.不同物種某一基因編碼的保守氨基酸區(qū)域。

應(yīng)用：基于簡并引物PCR策略克隆新基因第三十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)PCR引物設(shè)計原則第三十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)PCR引物設(shè)計原則引物設(shè)計的方法

1.PC設(shè)計利用下載的引物設(shè)計軟件，自己設(shè)計所需引物。引物設(shè)計的軟件：primeprimer、oligo、DNAstar、DNAMAN等

2.在線引物設(shè)計

Primer3、Primerfinder、codehop等等。

GeneFisher簡并引物在線設(shè)計

http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/Codehop簡并引物設(shè)計軟件

/codehop.html第三十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)PCR技術(shù)類型巢式PCR采用兩對引物進(jìn)行PCR，其中第二對引物位于第一對引物內(nèi)P1上P1下P2上P2下用途：驗證第一次PCR產(chǎn)物的特異性進(jìn)行特殊PCR，如合成探針模板第三十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)PCR技術(shù)類型Alu-PCR第三十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)PCR技術(shù)類型不對稱PCR（asymmetricPCR）目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。

方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。

用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究第三十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)PCR技術(shù)類型反向PCR（inversePCR）原理是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增?？蓪ξ粗蛄袛U(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。第四十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)PCR技術(shù)類型反向PCR（inversePCR）第四十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)PCR技術(shù)類型等位基因?qū)Ｒ籔CR(AllelespecificPCR,ASPCR)

該法可用于檢測點(diǎn)突變。如用于檢測鐮刀形貧血癥。第四十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)PCR技術(shù)類型

競爭引物PCR(competitiveoligonucieotideprimerPCR,COP-PCR)有一個堿基變化的兩種引物在較寬松的復(fù)性條件下競爭DNA模板，其中只有完全互補(bǔ)的引物才能大量配對。該法可用于測定某一DNA片段上是否帶有某一已知堿基置換。第四十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)PCR技術(shù)類型cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)第四十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)PCR技術(shù)類型PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-singlestrandconformation

polymorphism,PCR-SSCP）DNA分子在電泳中的行為取決于分子量和分子構(gòu)象。DNA單鏈的構(gòu)象取決于序列。PCR產(chǎn)物變形后于中性膠中電泳，與正常對照比較，若電泳行為異常，則認(rèn)為內(nèi)含突變的堿基。第四十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)PCR技術(shù)類型

Touch–downPCR又稱降落PCR。即選定一個溫度范圍，如50—35℃，每降1-2℃進(jìn)行1-2個循環(huán)，然后在50度下進(jìn)行15個循環(huán)。觸-向下的的原理：隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經(jīng)擴(kuò)增出來，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。選擇初始復(fù)性溫度的原則：起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的Tm值高出5-10度，然后每個循環(huán)遞減1-2度第四十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)PCR技術(shù)類型熱啟動PCR熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq脫氧核糖核酸聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計的位點(diǎn)因為遺傳元件的定位而受限時，如位置-徑直的突變、表達(dá)克隆或用于脫氧核糖核酸工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。第四十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)PCR技術(shù)類型差示PCR（DD-PCR)利用特殊設(shè)計的引物，在RT的基礎(chǔ)上進(jìn)行PCR，以研究不同基因的表達(dá)狀況。腫瘤組織正常組織第四十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五節(jié)PCR技術(shù)應(yīng)用一、核酸的基礎(chǔ)研究二、序列分析三、檢測基因表達(dá)四、從cDNA庫中放大特定序列五、研究已知片段鄰近基因或未知DNA片段六、進(jìn)化分析七、醫(yī)學(xué)應(yīng)用八、分析生物學(xué)證據(jù)九、性別控制十、轉(zhuǎn)基因檢測第四十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五節(jié)PCR技術(shù)應(yīng)用PCR技術(shù)的主要用途

1、目的基因的克隆：

PCR技術(shù)為在重組DNA過程中獲得目的基因片段提供了簡便快速的方法。

2、基因的體外突變：可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。第五十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五第五節(jié)PCR技術(shù)應(yīng)用3、DNA和RNA的微量分析：PCR技術(shù)高度敏感，對模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。實際工作中，一滴血液、一根毛發(fā)或一個細(xì)胞已足以滿足PCR的檢測需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應(yīng)用前景。4、DNA序列測定：PCR技術(shù)的引入使DNA測序工作大大簡化，也提高了測序的速度。5、基因突變分析：利用PCR與一些技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。第五十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五PCR常見問題（補(bǔ)充）一、出現(xiàn)假陰性二、出現(xiàn)假陽性三、出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶四、出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶第五十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五PCR常見問題（補(bǔ)充）一、PCR出現(xiàn)假陰性原因

1．模板因素

2．酶失活

3．引物

4．Mg2+濃度

5．反應(yīng)體積的改變

6．物理原因

7．靶序列變異第五十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五PCR常見問題（補(bǔ)充）一、PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案

模板因素：

1.模板中含有雜蛋白；

2.模板中含有Taq酶抑制劑；

3.模板中蛋白質(zhì)殘留，特別是染色體中的組蛋白殘留；

4.提取制備模板時丟失過多；

5.模板核酸變性不徹底。模板因素引起假陰性解決方案：

1.配制有效而穩(wěn)定的消化處理液;

2.提取程序固定,不宜隨意改動；

3.模板DNA的溶解液應(yīng)固定不變。第五十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五PCR常見問題（補(bǔ)充）一、PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案酶失活：

1.酶本身的質(zhì)量問題(供應(yīng)商的問題）；

2.酶存放時間太長；

3.酶存放方式不當(dāng)，或其他意外原因；

4.忘記添加Taq酶。

酶失活引起假陰性解決方案：

1.檢查加樣程序及過程，看是否忘記加Taq酶；

2.更換新的Taq酶;

3.新舊兩種Taq酶同時使用第五十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五PCR常見問題（補(bǔ)充）一、PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案

引物：

1.引物質(zhì)量；

2.引物濃度；

3.兩條引物的濃度是否對稱等。

引物引起假陰性解決方案:

1.選定一個好的引物合成單位;

2.引物濃度不僅要看OD值，稀釋時更要平衡其摩爾濃度；

3.引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止反復(fù)凍融或長期冷凍保存，導(dǎo)致引物的變質(zhì)降解失效，也可要求合成單位將固體分裝；

4.引物設(shè)計不合理，如長度不夠，引物本身或兩條引物之間形成二聚體等。第五十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五PCR常見問題（補(bǔ)充）一、PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案

Mg2+濃度：

Mg2+濃度對PCR擴(kuò)增效率影響極大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性；濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗，出現(xiàn)假陰性。

Mg2+濃度引起假陰性解決方案：設(shè)置一組反應(yīng)，其中每一反應(yīng)中的其他離子濃度相同（如Tris.Cl,KCl等），而MgCl2濃度不同（由0.5~6mmol/L,每次增加0.5mmol/L)，由此來摸索最佳Mg2+濃度。第五十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五PCR常見問題（補(bǔ)充）一、PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案

反應(yīng)體積的改變：做小體積PCR后，再做大體積時，一定要重新摸索條件，而非簡單地將反應(yīng)體系中的各個成分加大幾倍，否則易失敗。靶序列變異：靶序列變異導(dǎo)致假引性的情況常常發(fā)生在靶序列變異正好發(fā)生于特異性引物與之結(jié)合部的中間，使引物失效。解決方案：根據(jù)已知序列重新選擇區(qū)段設(shè)計引物。

第五十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期五PCR常見問題（補(bǔ)充）一、PCR出現(xiàn)假陰性原因分析及解決方案物理原因：

1.變性溫度低，變性時間短；

2.退火溫度過高，影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率；

3.延伸時間過短等。

物理原因引起假陰性解決方案：

1.提高變性溫度，延長變性時間，特別是首次循環(huán)，必要時可設(shè)為95℃

，10min，或PCR反應(yīng)以前在開水中煮沸幾分鐘。

2.退火溫度應(yīng)根據(jù)Tm值來設(shè)定，也可首先將退火溫度設(shè)為45℃

，然后再逐次提高（以2℃/次為宜）。

3.延伸溫度以1000bp/min足夠，必要時也可適當(dāng)延長，特別是末次循環(huán)，一定