酶免疫試驗(yàn)專題知識(shí)講座

放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)掌握：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；熟悉：酶和酶作用底物、固相載體、酶免疫測(cè)定的應(yīng)用；了解：酶標(biāo)記抗體或抗原、酶免疫技術(shù)的分類；第一節(jié)酶免疫試驗(yàn)的組成要素第二節(jié)酶免疫試驗(yàn)的分類第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第四節(jié)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)第五節(jié)發(fā)光酶免疫試驗(yàn)第六節(jié)酶免疫試驗(yàn)的臨床應(yīng)用及常用商品試劑的方法特點(diǎn)第七節(jié)影響酶免疫試驗(yàn)的主要因素酶免疫試驗(yàn)(enzymeimmunoassay,EIA)

以酶標(biāo)記抗體（抗原）作為主要試劑，將酶高效催化反應(yīng)的專一性和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的免疫檢測(cè)技術(shù)。

酶免疫測(cè)定技術(shù)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性原理及特點(diǎn)原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析原理及特點(diǎn)原理及特點(diǎn)特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。第一節(jié)

酶免疫試驗(yàn)的組成要素固相抗體或抗原是非均相酶免疫技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物迅速分離的最常用方法

固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面

一、固相載體要求

結(jié)合抗體或抗原的容量大抗體或抗原牢固地固定在其表面不影響免疫反應(yīng)性利于反應(yīng)充分進(jìn)行固相方法簡(jiǎn)便易行，快速經(jīng)濟(jì)種類微孔板磁微粒膜載體固相載體將抗原或抗體結(jié)合于固相載體（直接包被、間接包被）用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異性吸附包被coating封閉blocking二、包被抗原或抗體直接包被稀釋抗原或抗體（用0.05mol/LPH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋抗原或抗體到3-10μg/mL）4°c過(guò)夜封閉（牛血清白蛋白或小牛血清）間接包被親和素-生物素化抗體（抗原）SPA-抗體（抗原）間接吸附于固相載體上1.辣根過(guò)氧化物酶（HRP）2.堿性磷酸酶（ALP)3.β-半乳糖苷酶

(β-Gal)

三、酶結(jié)合物HRP的常見底物

鄰苯二胺(OPD)四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸(5-ASA)2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)常用底物四、酶的顯色底物與酶促發(fā)光底物OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測(cè)定波長(zhǎng)492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色

，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測(cè)定波長(zhǎng)450nm，穩(wěn)定，無(wú)致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

酶和酶作用底物ALP底物

β-Gal的底物

對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405nm。

酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測(cè)量。常用底物酶和酶作用底物

第二節(jié)酶免疫試驗(yàn)的分類酶免疫試驗(yàn)酶免疫組化酶免疫測(cè)定技術(shù)均相：不需要分離異相固相酶免疫試驗(yàn)液相酶免疫試驗(yàn)組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位

液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測(cè)定

酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會(huì)發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理一、均相酶免疫試驗(yàn)最具代表性的兩種技術(shù)：酶放大免疫分析技術(shù)EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供體免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫測(cè)定酶放大免疫分析技術(shù)EMIT示意圖常用酶：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和溶菌酶酶放大免疫分析技術(shù)EMIT示意圖克隆酶供體免疫分析（CEDIA）示意圖與均相不同之處需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物二、異相酶免疫試驗(yàn)分類：液相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是目前最為常用的固相酶免疫測(cè)定1關(guān)于均相酶免疫測(cè)定，下列哪項(xiàng)正確（）A多用于大分子物質(zhì)的測(cè)定B酶標(biāo)抗原和抗體在固相載體表面形成復(fù)合物，作用于底物顯色C需要分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物D常利用酶標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合后的空間位阻降低酶活性E酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，故最終酶活力的大小與標(biāo)本中抗原量負(fù)相關(guān)第二節(jié)習(xí)題2酶免疫技術(shù)是根據(jù)何種特性分為均相和異相的（）A抗原特性B抗體特性C抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物D酶的穩(wěn)定性E載體特性第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體12洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離34一、基本原理二、ELISA方法建立的基本步驟（一）ELISA方法類型的建立1初步確定方法類型2.工作條件的優(yōu)化3.ELISA檢測(cè)結(jié)果測(cè)定（二）對(duì)建立的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)固相的抗原或抗體

酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物）

酶反應(yīng)的底物

三個(gè)必要試劑三、方法類型及反應(yīng)原理

elisa試驗(yàn).exe方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測(cè)抗原的方法1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測(cè)抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無(wú)抗原與抗體結(jié)合3、加酶標(biāo)抗體無(wú)抗原結(jié)合YYYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYYEY+-競(jìng)爭(zhēng)法

方法：用已知抗體包被，同時(shí)加入待測(cè)血清和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競(jìng)爭(zhēng)與包被物結(jié)合。加底物顯色。

應(yīng)用：用于只有一個(gè)抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）ELISA檢測(cè)抗原的方法洗滌洗滌競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原+-YYYYYEYYEYYYYYE2、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測(cè)物和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合YEYYEYEYEYE

elisa間接法陽(yáng)性.exe方法用已知抗原包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點(diǎn)一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用常測(cè)定HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等ELISA檢測(cè)抗體的方法1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無(wú)抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測(cè)抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+

雙抗原夾心.exe原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測(cè)抗體的方法ELISA檢測(cè)抗體的方法競(jìng)爭(zhēng)法原理：類似檢測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)法應(yīng)用：HBcAb和HBeAb的檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)法非經(jīng)典競(jìng)爭(zhēng)法非經(jīng)典競(jìng)爭(zhēng)法捕獲法應(yīng)用：

病原體急性感染診斷中的IgM型抗體甲型肝炎HAV-IgM抗體乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體ELISA檢測(cè)抗體的方法捕獲法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體底物顯色

洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測(cè)物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測(cè)物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體無(wú)抗原結(jié)合，加底物不顯色1下列哪一種ELISA最常用于抗原的測(cè)定（）A雙抗體夾心法ELISAB間接法ELISA

C競(jìng)爭(zhēng)法ELISAD捕獲法ELISAE補(bǔ)體結(jié)合法2捕獲法主要用于何種物質(zhì)的測(cè)定（）AIgGBIgACIgMDIgDEIgE

第三節(jié)習(xí)題3下列關(guān)于雙抗體夾心法原理，不正確的是（）A使用分別針對(duì)抗原不同決定簇的兩種單克隆抗體作為酶標(biāo)記物B一種單克隆抗體作為固相抗體，另一種作為酶標(biāo)抗體

C可使標(biāo)本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入成為一步法D用于檢測(cè)二價(jià)或二價(jià)以上的抗原E采用高親和力的單克隆抗體可提高檢測(cè)的靈敏度和特異性4下列何種方法用一種標(biāo)記物可檢測(cè)多種被測(cè)物（）AELISA雙抗體夾心法BELISA競(jìng)爭(zhēng)法C放射免疫法DELISA捕獲法EELISA間接法5關(guān)于ELISA競(jìng)爭(zhēng)法，下列敘述正確的是（）A用于檢測(cè)抗原B被測(cè)物與酶標(biāo)記物的免疫活性各不相同C被測(cè)物多則標(biāo)記物被結(jié)合的機(jī)會(huì)少D待測(cè)管的顏色比對(duì)照管的淺則表示被測(cè)物量少E結(jié)合于固相的酶標(biāo)記抗原量與被測(cè)抗原量成正比第四節(jié)

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT或ElisaSpot)

包被有待測(cè)細(xì)胞因子抗體的微孔板

分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的待測(cè)細(xì)胞

有或無(wú)刺激物培養(yǎng)細(xì)胞因子被板上的特異性抗體捕獲后續(xù)的反應(yīng)如同ELISA

一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞，斑點(diǎn)的顏色深淺程度與細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量相關(guān)

基本原理+酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)

第五節(jié)

發(fā)光酶免疫試驗(yàn)（LEIA）原理：參與催化某一發(fā)光反應(yīng)的酶來(lái)標(biāo)記抗體（或抗原），在抗原-抗體反應(yīng)后加入發(fā)光物，酶催化和分解底物發(fā)光，由光檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測(cè)物的含量?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫試驗(yàn)熒光酶免疫試驗(yàn)

熒光酶免疫試驗(yàn)

第六節(jié)酶免疫試驗(yàn)的臨床應(yīng)用及常用商品試劑的方法特點(diǎn)（一）均相酶免疫測(cè)定主要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測(cè)。（二）異相酶免疫ELISA用于臨床血液及其他體液標(biāo)志物ELISPOT監(jiān)測(cè)HIV等疫苗研究免疫應(yīng)答反應(yīng)、移植研究、Th0/Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析、自身免疫研究、過(guò)敏機(jī)制探討、傳染性疾病研究。（三）發(fā)光酶免疫試驗(yàn)用于微量物質(zhì)的定量檢測(cè).

第七節(jié)影響酶免疫試驗(yàn)的主要因素一、試劑盒原材料因素二、標(biāo)本因素三、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境因素四、操作因素抗原要求純度高，抗原性完整

抗體需要特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。

抗原抗體選擇1．酶免疫技術(shù)的要點(diǎn)？2．酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理?3．常用的底物有哪幾類？特點(diǎn)？4．常用的酶有哪幾類？特點(diǎn)？思考題酶免疫技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)的一種，它是以酶標(biāo)記的抗原或抗體作為主要試劑的免疫檢測(cè)方法，在抗原與抗體的特異性反應(yīng)完成后，通過(guò)酶對(duì)底物的作用進(jìn)一步提高敏感性。均相酶免疫測(cè)定主要用于小分子激素和半抗原的測(cè)定，異相酶免疫測(cè)定根據(jù)是否使用固相支持物，又可分為液相和固相酶免疫測(cè)定兩種類型。小結(jié)標(biāo)記酶的要求：

1.純度高,活性強(qiáng),催化反應(yīng)效率高。

2.易與抗體或抗原結(jié)合標(biāo)記后酶活性穩(wěn)定，不影響抗原抗體反應(yīng)性。

3.作用專一，且酶活性不受樣品其他成分影響。

標(biāo)記酶的要求：

4.酶催化底物后產(chǎn)生的產(chǎn)物易于判斷或測(cè)量，方法敏感，重復(fù)性好，簡(jiǎn)單易行。

5.酶、輔助因子及其底物對(duì)人體和環(huán)境無(wú)害，易于配制、保存，價(jià)廉易得。

辣根過(guò)氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無(wú)關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比RZ值與酶活性無(wú)關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要

ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶

常用酶酶和酶作用底物堿性磷酸酶（AP）

菌源性AP腸黏膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫測(cè)定

常用酶酶和酶作用底物HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種

H2O2為受氫體，HRP對(duì)受氫體的專一性很高

常用底物酶和酶作用底物HRP的常見底物

鄰苯二胺(OPD)四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸(5-ASA)2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)常用底物酶和酶作用底物OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測(cè)定波長(zhǎng)492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)