培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)余莉

內(nèi)容提要培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞生長過程培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分內(nèi)容提要培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞生長過程培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式按生長方式:2型粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才

能生長的細(xì)胞。

懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而

在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，

只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞

可在懸浮狀態(tài)下生長

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分一：粘附生長型細(xì)胞（較為多見）粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)

生存和生長發(fā)育的基本存在方式含義:

兩方面其一是細(xì)胞與細(xì)胞之間相互接觸其二是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合結(jié)果:基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，

有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須

粘附于一固相表面

才能生存和生長。

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分培養(yǎng)時(shí)：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于粘附型細(xì)胞。粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細(xì)胞。一：粘附生長型細(xì)胞（較為多見）2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分類型

細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式：存在差異

體內(nèi)：粘附是全方位

外形具有復(fù)雜的立體特征

體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面

外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同

一：粘附生長型細(xì)胞（較為多見）2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài),可將其分為成纖維細(xì)胞型上皮細(xì)胞型游走型細(xì)胞多型性細(xì)胞2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分1.成纖維型細(xì)胞：(fibroblast)來自中胚層名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)胞體梭形或不規(guī)則三角形胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長短不等的突起中有卵圓形核2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分生長特點(diǎn):排列成放射狀，漩渦狀,并不緊靠連成片，細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而,單獨(dú)行動(dòng)游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞常有幾個(gè)伸長的細(xì)胞突起1.成纖維型細(xì)胞：(fibroblast)來自中胚層2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分1.成纖維型細(xì)胞：(fibroblast)來自中胚層2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2、上皮細(xì)胞型(epithliumcelltype)

名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全等于--來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞如：皮膚及其衍生物消化道，乳腺，肺泡上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞

扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分生長特點(diǎn)

易相連成片相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀

生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)

很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)2、上皮細(xì)胞型(epithliumcelltype)

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2、上皮細(xì)胞型(epithliumcelltype)

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞2、上皮細(xì)胞型(epithliumcelltype)2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2、上皮細(xì)胞型(epithliumcelltype)2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分3、游走型細(xì)胞(wanderingcelltype)

特點(diǎn)：在支持物上散在生長,不連接成片,胞質(zhì)伸出偽足或突起呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng),速度快不規(guī)則,密度大連接成片呈多角形不易與其他類型的細(xì)胞區(qū)別。

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分

表現(xiàn)這種形態(tài)的細(xì)胞主要是具有吞噬作用的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞,如顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝枯否細(xì)胞(pffercell)以及某些腫瘤細(xì)胞等。在植塊培養(yǎng)時(shí),這類細(xì)胞最先從植塊遷移出來。3、游走型細(xì)胞(wanderingcelltype)

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分4、多形型細(xì)胞(polymorphiccelltype)特點(diǎn)：無規(guī)律的形態(tài)，如神經(jīng)細(xì)胞。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分新生24小時(shí)wistar大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞1.細(xì)胞種類：大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：5天；3.放大倍速：倒置顯微鏡X200倍；4.培養(yǎng)基種類：DEME-F12＋N25.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：神經(jīng)細(xì)胞聚集成球，向外爬行生長，各神經(jīng)球之間有豐富的神經(jīng)絲聯(lián)系。單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞胞體呈錐形或圓形，樹突交錯(cuò)呈網(wǎng)，貼壁生長。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分（二）懸浮生長型細(xì)胞(suspendedcelltype)

概念培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞也可能特點(diǎn)在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分優(yōu)點(diǎn)

生存空間大，提供數(shù)量大

傳代方便(不需消化)

易于收獲可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)觀察不方便很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤以正常細(xì)胞)

（二）懸浮生長型細(xì)胞(suspendedcelltype)

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分胚胎干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成的擬胚體倒置顯微鏡×20（二）懸浮生長型細(xì)胞(suspendedcelltype)

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分強(qiáng)調(diào)：一般形態(tài)并不是一項(xiàng)可靠指標(biāo)要受各方面影響。如：反復(fù)開關(guān)溫箱、溫度、C02的濃度、培養(yǎng)基變堿、支原體、pH值。細(xì)胞在接種時(shí)呈三角型狀態(tài)，經(jīng)培養(yǎng)一定時(shí)間后，細(xì)胞在傳代前已形成上皮型細(xì)胞。

細(xì)胞形態(tài)受環(huán)境的影響2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分

細(xì)胞貼壁延展過程2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定

血清Hela高血清低血清

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

pH

Hela太酸或太堿標(biāo)準(zhǔn)pH

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞

細(xì)胞密度3T3低密度高密度

成纖維細(xì)胞樣上皮樣細(xì)胞生長狀態(tài)改變

懸浮或貼附懸浮貼附

圓形成纖維或上皮樣

轉(zhuǎn)化與否未轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化后

成纖維樣可成上皮樣細(xì)胞形態(tài)受環(huán)境的影響2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分衰退期細(xì)胞2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分衰退期細(xì)胞2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分內(nèi)容提要培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞生長過程培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分總的：與體內(nèi)仍有相似--

體外培養(yǎng)的細(xì)胞仍存在細(xì)胞和細(xì)胞、

細(xì)胞和基質(zhì)的相互關(guān)系但有不同

相對孤立、相對單一

失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)

分化減弱或不顯

萬變不離其宗，入鄉(xiāng)隨俗1.去分化2.貼壁和鋪展3.接觸抑制和密度依賴性生長抑制二、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分1.去分化

細(xì)胞分化(celldifferentiation)細(xì)胞分化是指在個(gè)體發(fā)育中，由一種相同的細(xì)胞類型經(jīng)細(xì)胞分裂后逐漸在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上形成穩(wěn)定性差異，產(chǎn)生不同的細(xì)胞類群的過程。分化的結(jié)果是在空間上，細(xì)胞之間出現(xiàn)差異；在時(shí)間上同一細(xì)胞和它以前的狀態(tài)有所不同。從本質(zhì)上說，細(xì)胞分化是從化學(xué)分化到形態(tài)、功能分化的過程。只有通過細(xì)胞分化,才能形成各種不同的細(xì)胞,進(jìn)而形成不同的各具功能的器官,使生物體成為一個(gè)個(gè)體,否則假如細(xì)胞只是長大變多也就是說只有干重的增加而不分化,所有的細(xì)胞都只能保持原始的干細(xì)胞的狀態(tài)也就無法形成生物體了。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的變化

體內(nèi)細(xì)胞--三方面的影響與調(diào)節(jié):

體外環(huán)境的影響

體內(nèi)神經(jīng)—體液因素的調(diào)節(jié)

細(xì)胞與局部微環(huán)境的相互作用

控制--

維持著細(xì)胞的分化特征。體外培養(yǎng)時(shí)，

失去了--

分化特征逐漸減弱

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分去分化(脫分化):

是指已分化成熟的細(xì)胞和組織倒退分化,返回原始幼稚的狀態(tài)(逐漸失去各自的形態(tài)與功能“個(gè)性”，表現(xiàn)出某種趨同性)

有2點(diǎn)去分化2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分1.

去分化并不意味著完全返回胚胎時(shí)期的原始細(xì)胞狀態(tài)

如:高度分化的神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞

已經(jīng)喪失的增生活性不可能恢復(fù)

但已經(jīng)具備的生物電活動(dòng)特性

不會(huì)完全失去去分化2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2.可重新表現(xiàn)出分化特點(diǎn)

如：

把表皮細(xì)胞放在氣液界面上培養(yǎng)，可分化成

含大量角蛋白絲的角質(zhì)細(xì)胞

內(nèi)皮細(xì)胞--

但，這種能力會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長

逐漸喪失

總之，體外培養(yǎng),使細(xì)胞

結(jié)構(gòu)與功能上的“可塑性”增大

去分化2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2.貼附和鋪展

2010/11/29本文檔共179頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分貼附(粘附)和附著

粘附于固相表面是錨定依賴性細(xì)胞生命活動(dòng)的基本要求

細(xì)胞被接種到培養(yǎng)器皿內(nèi)以后

首先要發(fā)生粘附(adherence)，

是細(xì)胞培養(yǎng)以后能否成功的第一步.

細(xì)胞懸液后

耽擱得越久，越容易發(fā)生退化

提供什么樣的生長表面

是細(xì)胞能否成功粘附的主要因素。

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分

不同細(xì)胞的粘附能力不同

如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等粘附能力強(qiáng)

能在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)粘附到固相表面

如神經(jīng)元細(xì)胞、羊水細(xì)胞，粘附能力弱

需要數(shù)小時(shí)乃至更長的時(shí)間才能粘附到固相表面粘附能力強(qiáng)的細(xì)胞---粘附能力弱的細(xì)胞---可利用此特點(diǎn)（粘附：快、牢；慢、弱）

分離、純化細(xì)胞貼附(粘附)和附著

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞形態(tài)

因是否貼附于底物而不同

懸浮的細(xì)胞:

基本圓形

粘附和貼壁的細(xì)胞:

扁平圓形

相差顯微鏡

“亮圈”

很快過渡--貼附(粘附)和附著

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分貼附過程：3步貼附因子粘附細(xì)胞開始附著細(xì)胞進(jìn)一步

牢固附著—伸展貼附(粘附)和附著

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分各種細(xì)胞不同如接種30’后…第二瓶30’…(附著最強(qiáng))巨噬細(xì)胞一成纖維細(xì)胞

——上皮細(xì)胞——血細(xì)胞(最弱)生物因素血清、培養(yǎng)液中的促附著因子

機(jī)械，物理等其他因素因素離心：促進(jìn)附著

流動(dòng)：培養(yǎng)液流動(dòng)可阻止細(xì)胞附著低溫：可抑制附著影響因素2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分1.包被

對分化程度高、生長能力差的細(xì)胞

可在培養(yǎng)瓶皿表面包被有利于細(xì)胞粘附和

生長的生物活性物質(zhì)如:--

通過其所帶電荷先吸附--,培養(yǎng)的細(xì)胞再與其結(jié)合。

血清內(nèi)含有多種能夠

促進(jìn)細(xì)胞粘附的成分

細(xì)胞本身也可能產(chǎn)生一些粘附分子

措施（因素）2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2.減少接種時(shí)細(xì)胞懸液的量

待細(xì)胞粘附和貼壁之后，再補(bǔ)充足夠的培養(yǎng)液3.減少培養(yǎng)液中血清的含量

使培養(yǎng)液黏度降低4.培養(yǎng)液中離子成分及其濃度

如，培養(yǎng)液中的Ca含量過低時(shí)不利于

細(xì)胞的粘附、貼壁和鋪展5.培養(yǎng)液的溫度

低溫會(huì)減低細(xì)胞的活動(dòng)，妨礙黏附和貼壁措施（因素）2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分鋪展

鋪展（伸展）(spread)

進(jìn)行生命活動(dòng)的一種基本的生長特點(diǎn)或生長行為鋪展?fàn)顩r制約細(xì)胞的分裂增殖活動(dòng)

過程，細(xì)胞先由圓形變?yōu)?/p>

圓餅形(放射狀鋪展細(xì)胞)

逐漸鋪開伸展成為扁平的極性細(xì)胞

極性細(xì)胞就是各種有機(jī)體細(xì)胞

在體外的特征性細(xì)胞形態(tài)

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分鋪展?fàn)顩r

是調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀的主要方面

鋪展得越好，細(xì)胞越扁

意味著細(xì)胞與生長基質(zhì)表面接觸面越大鋪展?fàn)顩r

與細(xì)胞的生長有密切關(guān)系

只有當(dāng)細(xì)胞鋪展到合適的程度

DNA合成才開始進(jìn)行通過比較貼壁依賴性細(xì)胞

不同鋪展程度與DNA合成率之間的關(guān)系

發(fā)現(xiàn)細(xì)胞越扁(厚度越小)

DNA合成率越高鋪展

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分合適的細(xì)胞形狀-伸展

細(xì)胞形狀(伸展)與細(xì)胞的生長對正常細(xì)胞的DNA合成重要

對其生長重要伸展的意義2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分實(shí)驗(yàn)一

成纖維細(xì)胞

1.附著于玻璃或塑料底物:細(xì)胞增殖

2.

懸浮培養(yǎng):細(xì)胞不增殖

3.a.培養(yǎng)在懸浮的玻璃纖維上:

若夠長:細(xì)胞可增殖

若短于20um,細(xì)胞可附著,但增殖很慢

或不增殖

伸展的意義2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分原因分析

在1.附著培養(yǎng)物上:細(xì)胞很扁平,很伸展

在2.懸浮培養(yǎng)中:細(xì)胞圓球形,未伸展

在3.培養(yǎng)中:細(xì)胞維持介于扁平與圓球之間

因此,細(xì)胞形狀,至關(guān)重要

伸展至原來的形態(tài),才能增殖伸展的意義-實(shí)驗(yàn)2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分

細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中時(shí)，近似球體形狀當(dāng)接觸堅(jiān)硬平面即鋪展于底物上，扁平狀

與底物形成很多接觸點(diǎn)伸展過程2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分(1)開始階段開始附著鋪開細(xì)胞附著于底物球形的細(xì)胞，下方表面與底物接觸成扁但尚未形成新的偽足伸展分幾個(gè)階段2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分(2)

放射狀鋪展階段

在球形細(xì)胞體的周圍形成很多偽足隆起

偽足形狀

主要柱形絲狀:直徑0.2-0.5um長10-20

扁平片狀:厚0.1-0.5寬2-5

尚有:小泡狀葉狀:直徑1-2

開始時(shí):絲狀多

以后:片狀增加

伸展分幾個(gè)階段2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分

許多偽足

形成薄的胞質(zhì)小片牢固貼于底物

胞體中央部分扁

整亇細(xì)胞扁平(3)極化階段

伸展分幾個(gè)階段2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分底物細(xì)胞能在很多固體表面附著最終鋪展的程度，取決于底物的性質(zhì)影響因素：活性物質(zhì)(貼附、伸展因子):血清、培養(yǎng)液中，

或細(xì)胞分泌的生物活性物質(zhì)被底物吸附后可利于細(xì)胞的鋪展細(xì)胞借助這些分子,可附著于各種”非特異性”的底物上如膠原，聚賴氨酸機(jī)械，物理因素附著、伸展的條件2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分3.接觸抑制和密度依賴性生長抑制正常細(xì)胞：細(xì)胞相互接觸能抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制(contactinhibition)。腫瘤細(xì)胞：沒有這種現(xiàn)象，可作為區(qū)別正常與腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志之一。當(dāng)腫瘤細(xì)胞達(dá)到一定密度后向三維空間發(fā)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積(piledup)。由于細(xì)胞不斷增殖分裂，細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增多，培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多，細(xì)胞受營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制(Densityinhibition),導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分3.接觸抑制和密度依賴性生長抑制2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分運(yùn)動(dòng)的接觸抑制

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分密度依賴性生長抑制增殖的密度抑制實(shí)驗(yàn)方法：3T3細(xì)胞，接種105于6cm培養(yǎng)皿，

5d細(xì)胞計(jì)數(shù)于加入10％、20％、30％牛血清的

培養(yǎng)液中，結(jié)果：

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分結(jié)果：①10％血清：

20hr后鋪滿

(匯合confluent)

以后至5d細(xì)胞數(shù)不再增加

(細(xì)胞數(shù)約106／6cm皿)

密度抑制30%血清：

以后經(jīng)常換液至5d，

細(xì)胞密度繼續(xù)增加

(可達(dá)6xl06／6cm皿)說明:密度抑制---鋪滿后

不再增殖(分裂停止)

血清可降低密度抑制密度依賴性生長抑制2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分只加入于3T3停止生

長的培養(yǎng)液中

細(xì)胞不生長當(dāng)再加入血清

細(xì)胞又生長說明

血清可消除密度抑制密度依賴性生長抑制2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分(2)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的密度抑制降低①用此培養(yǎng)液

3T3細(xì)胞不再分裂增殖②當(dāng)再加入10％血清，

3T3細(xì)胞可再增殖表示血清可消除密度抑制③但當(dāng)用此培養(yǎng)液，

于轉(zhuǎn)化的3T3細(xì)胞

(SV3T3)

卻生長良好表示轉(zhuǎn)化細(xì)胞密度抑制降低

(血清需要降低)說明：轉(zhuǎn)化細(xì)胞的密度抑制降低.

可生長至較高的密度密度依賴性生長抑制2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分總的說明：①細(xì)胞生長有密度抑制②血清可降低密度抑制③轉(zhuǎn)化細(xì)胞可降低密度抑制

密度依賴性生長抑制2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分內(nèi)容提要培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞生長過程培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程細(xì)胞系的生長過程每代貼附生長細(xì)胞的生長過程細(xì)胞周期（細(xì)胞分裂周期）2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分體外培養(yǎng)細(xì)胞的整個(gè)生命活動(dòng)可分為原(初)代培養(yǎng)期傳(繼)代培養(yǎng)期衰退期三個(gè)時(shí)期（一）細(xì)胞系的生長過程2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分1、原代培養(yǎng)期取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。組織到第一次傳代時(shí)間大約為1～4周特點(diǎn)：細(xì)胞活躍移動(dòng),分裂,但不旺盛,多呈二倍體核型。原代與體內(nèi)原組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)基本相似。異質(zhì)性各細(xì)胞的遺傳性狀互不相關(guān)，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)，如果把這種稀釋分散成單細(xì)胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞克隆的形成率(cloningefficiency)下降，表明細(xì)胞獨(dú)立生存性差。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2、傳代培養(yǎng)期初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代便稱之為細(xì)胞系(cellline)特點(diǎn)：細(xì)胞增殖旺盛，并維持二倍體核型，也叫二倍體細(xì)胞系(diploidcellline)為了保存二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代或傳代早期凍存為好。一般細(xì)胞在10代以內(nèi)凍存。細(xì)胞逐漸進(jìn)入去分化狀態(tài)。原本成分混雜的培養(yǎng)物中,某一種增殖能力較強(qiáng)的細(xì)胞會(huì)逐漸處于優(yōu)勢,比例越來越大,而將其它數(shù)量較少比例較小的細(xì)胞逐漸淘汰掉。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分3、衰退期特點(diǎn)：細(xì)胞仍生存增殖減慢不增殖輪廓增強(qiáng)衰退凋亡注意：細(xì)胞在三期中的任何一期（一般發(fā)生在傳代后期或衰退期）在某些因素影響下,如血清質(zhì)量不佳、病毒污染、溫度和pH不穩(wěn)等,細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(spontaneoustransformation);2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞可能獲得永生性(immortality)或稱為惡性(malignancy)。細(xì)胞獲得持久性的增殖能力,這樣的細(xì)胞群體稱為連續(xù)細(xì)胞系(continuouscellline)。而細(xì)胞獲得不死性后,細(xì)胞核型大多變成異倍體(heteroploid)接觸抑制消失。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第75頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分有限細(xì)胞系及連續(xù)細(xì)胞系的特征特征有限細(xì)胞系連續(xù)細(xì)胞系倍性整倍體，二倍體非整倍體，異倍體轉(zhuǎn)化正常永生性，成瘤性停泊依賴性是否接觸抑制是否細(xì)胞增殖密度抑制是減弱或消失生長方式單層單層或懸浮維持周期性穩(wěn)定狀態(tài)血清需求高低克隆形成率低高標(biāo)志組織特異的標(biāo)志染色體的，酶的，抗原的標(biāo)志特殊功能可能保留常常消失生長速率慢快產(chǎn)量地高控制參數(shù)代數(shù)，組織特異標(biāo)志株特征2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第76頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞株(CellStrain)

：系用克隆培養(yǎng)、物理分離或其他選擇方法分離選擇，在培養(yǎng)的細(xì)胞群體中獲得了已經(jīng)被確認(rèn)的某種特殊特征，這樣的細(xì)胞系被稱之為細(xì)胞株。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第77頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺(tái)期）

(二)每代貼附生長細(xì)胞的生長過程2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第78頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時(shí)游離期：2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第79頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）貼壁期：2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第80頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第81頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第82頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分

潛伏期特點(diǎn)：長短與細(xì)胞接種密度、種類、使用的培養(yǎng)基性質(zhì)有關(guān)。(1)細(xì)胞貼附后進(jìn)入潛伏期,細(xì)胞無增殖。少見分裂相，細(xì)胞有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。(2)初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期約為24～96小時(shí)或更長，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期約6～24小時(shí)。(3)細(xì)胞接種密度大潛伏期短。(4)細(xì)胞出現(xiàn)分裂相增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增生期。潛伏期(latentphase)：

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第83頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分對數(shù)生長期(logarithmicgrowthphase)特點(diǎn)：細(xì)胞增殖最旺盛階段,分裂相增多。細(xì)胞分裂指數(shù)(mitotieindexMI)：表示每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。條件：分裂相數(shù)與細(xì)胞種類、培養(yǎng)成分、pH培養(yǎng)箱溫度有關(guān)。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第84頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞分裂指數(shù)：初代細(xì)胞：在0.1％～0.5％之間,連續(xù)分裂細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞：3～5％。指數(shù)增生期是作為細(xì)胞一代活力最好的時(shí)期,是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)最好和最主要的階段。指數(shù)增生期持續(xù)3～5天，細(xì)胞數(shù)量增多后生長空間變小，細(xì)胞相互接觸可連接成片。對數(shù)生長期(logarithmicgrowthphase)2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第85頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分特點(diǎn)：細(xì)胞不增殖,有代謝活動(dòng)。培養(yǎng)液中的營養(yǎng)已逐漸耗盡,代謝產(chǎn)物積累增多,pH降低，此時(shí)需要傳代,否則細(xì)胞將會(huì)中毒,發(fā)生形態(tài)改變,細(xì)胞會(huì)從底物脫落死亡。機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性抑制注意：傳代過晚將影響下一代細(xì)胞的生長,至少要再傳1～2代,通過換液淘汰死細(xì)胞和受損較輕的細(xì)胞。待細(xì)胞全部恢復(fù)后再用。在這一點(diǎn)上要特別注意。停止期(stagnatephase)／平臺(tái)期（plateauphase）：2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第86頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞生長曲線2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第87頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分（三）細(xì)胞周期（細(xì)胞分裂周期）概念：指單個(gè)細(xì)胞的生長過程，亦指母細(xì)胞分裂后形成的細(xì)胞到下一代再分裂成兩個(gè)子細(xì)胞之間的時(shí)期。細(xì)胞周期或者定義為：細(xì)胞從一次分裂結(jié)束時(shí)起，到下一次分裂結(jié)束為止的一段時(shí)期。

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第88頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分具有進(jìn)入細(xì)胞周期能力的G0期細(xì)胞／靜止細(xì)胞（Quiescentcell，Q細(xì)胞）／休止細(xì)胞（Restingcell)最終要死亡的終止分化細(xì)胞／終端分化細(xì)胞不分裂細(xì)胞間期細(xì)胞（G1＋S＋G2）有絲分裂期細(xì)胞（M）分裂期細(xì)胞群體細(xì)胞整個(gè)細(xì)胞周期的組成即為（G1／0＋S＋G2＋M）2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第89頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第90頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞周期可劃分為四個(gè)階段2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第91頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞周期調(diào)控

2001年10月8日美國人Leland

Hartwell、英國人PaulNurse、Timothy

Hunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而榮獲2001年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)Leland

Hartwell分離出了幾十個(gè)與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(celldivisioncyclegene，CDC)，如芽殖酵母的CDC28基因，在G2/M轉(zhuǎn)換點(diǎn)發(fā)揮重要的功能。PaulNurse同樣發(fā)現(xiàn)了許多細(xì)胞周期調(diào)控基因，如裂殖酵母的CDC2、CDC25。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)cdc2和cdc28都編碼一個(gè)34KD的蛋白激酶，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行。Timothy

Hunt1983年首次發(fā)現(xiàn)海膽卵受精后，在其卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期劇烈振蕩，在每一輪細(xì)胞間期開始合成，G2/M時(shí)達(dá)到高峰，M結(jié)束后突然消失，下輪間期又重新合成，故命名為周期蛋白(cyclin)。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第92頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分內(nèi)容提要培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞生長過程培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況的觀察2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第93頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分常規(guī)觀察

培養(yǎng)液的顏色與透明度細(xì)胞形態(tài)變化細(xì)胞污染的觀察及防治細(xì)胞生長狀況2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第94頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分狀態(tài)好的細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓清楚，分裂期細(xì)胞多見。狀態(tài)差的細(xì)胞，失去原來的特點(diǎn)，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡、顆粒，細(xì)胞變形，出現(xiàn)死亡。培養(yǎng)液澄清，培養(yǎng)液顏色在指示劑的反映下顯示為中性范圍。（一）培養(yǎng)液的顏色和透明度2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第95頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分（二）培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察1、常規(guī)采用倒置顯微鏡觀察，最基本有兩種形態(tài)：2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第96頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分倒置顯微鏡2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第97頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第98頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分上皮細(xì)胞型

來源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞，如皮膚、乳腺、肝、肺泡、消化道上皮、形態(tài)為扁平的多角型、胞質(zhì)近中有圓形細(xì)胞核，生長特點(diǎn)為細(xì)胞之間緊密相靠，互相銜接，具有連成片的能力。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第99頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分成纖維細(xì)胞型

來源于中胚層的細(xì)胞，如纖維結(jié)締組織，平滑肌、心肌，血管內(nèi)皮細(xì)胞，形態(tài)具有長短不等的數(shù)個(gè)細(xì)胞突起，成棱形、不規(guī)則三角型。核為卵圓形，位于靠近胞質(zhì)的中央，。生長特點(diǎn)為細(xì)胞排列為漩渦狀、放射狀、或柵欄狀。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第100頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分相差顯微鏡把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處。環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。相位板（annularphaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。2、活細(xì)胞的觀察2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第101頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分(三)細(xì)胞生長狀況的觀察2010/11/29本文檔共179頁；當(dāng)前第102頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分1、細(xì)胞計(jì)數(shù)它是了解細(xì)胞生長狀態(tài)的量化指標(biāo)制備細(xì)胞懸液，密度不低于10000細(xì)胞／ml，用10×物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)：細(xì)胞數(shù)／ml原液＝（4大格細(xì)胞數(shù)之和÷4）×10000注意要點(diǎn)：細(xì)胞分散均勻制成單個(gè)細(xì)胞懸液；計(jì)數(shù)時(shí)數(shù)上不數(shù)下；數(shù)左不數(shù)右。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第103頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分

一個(gè)血球計(jì)數(shù)器含有兩個(gè)chamber。每一chamber中有九個(gè)1mm2的大方格，且chamber高度為0.1mm，所以每一個(gè)大方格的體積為0.1mm3。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第104頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞多于1000個(gè)/mm32009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第105頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2、培養(yǎng)細(xì)胞活力測定任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第106頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2、培養(yǎng)細(xì)胞活力測定--臺(tái)盼藍(lán)法

活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色；用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力；方法：1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中；2、加入0.5ml0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘；3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片；4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力；死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。活力測定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第107頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分培養(yǎng)細(xì)胞活力測定---伊紅Y(EosinY)

細(xì)胞懸液與7倍量的0.15%伊紅Y染液（生理鹽水配制）混合2分鐘后鏡檢，死細(xì)胞為桃紅色。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第108頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2、細(xì)胞活力測定---MTT比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)，四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第109頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。（4）酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（檢測波長為570nm）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線操作步驟2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第110頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分（四）細(xì)胞污染觀察與防治CELLCULTURECONTAMINATION2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第111頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分簡介introduction凡混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染細(xì)胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第112頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞污染的分類物理污染化學(xué)污染生物污染（支原體污染）提綱outline控制污染掌握良好的無菌操作技術(shù)建立細(xì)胞庫合理應(yīng)用抗生素保持工作區(qū)清潔建立良好的規(guī)章制度檢測細(xì)胞污染2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第113頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分溫度孵箱放在溫度較恒定的房間中培養(yǎng)液從冰箱取出后在室溫放置放射線試劑周圍不能放同位素振動(dòng)孵箱周圍不能放引起振動(dòng)的設(shè)備輻射試劑不要放在帶有玻璃門的冰箱中物理污染Physicalcontamination2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第114頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分化學(xué)污染血清培養(yǎng)液及試劑水培養(yǎng)用器皿孵箱化學(xué)污染chemicalcontamination2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第115頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分化學(xué)污染chemicalcontamination培養(yǎng)液及試劑選用純度最高的試劑經(jīng)過權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)定正確的儲(chǔ)存方法血清新購買的血清用之前要試應(yīng)選用同一批次的血清2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第116頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分實(shí)驗(yàn)試劑：縮寫為LR，又稱四級試劑。

化學(xué)純試劑：縮寫為CP，又稱三級試劑，一般瓶上用深藍(lán)色標(biāo)簽。

分析純試劑：縮寫為AR，又稱二級試劑，一般瓶上用紅色標(biāo)簽。

保證試劑：縮寫為GR，又稱一級試劑，一般瓶上用綠色標(biāo)簽（又稱優(yōu)級純）2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第117頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分水用來配液和清洗容器傳統(tǒng)用雙蒸和三蒸水現(xiàn)在用純水儀millipore超純水放置過久純度下降化學(xué)污染chemicalcontamination2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第118頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分容器生產(chǎn)過程中有毒物質(zhì)殘留消毒劑和清洗劑的殘留鋁箔和包裹紙殘留化學(xué)污染chemicalcontamination孵箱co2混有有毒氣體消毒劑和清洗劑的殘留2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第119頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分生物污染biologicalcontamination生物污染外界的微生物如昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物、原蟲、霉菌、細(xì)菌、支原體和其它類型的細(xì)胞都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境引起污染容易發(fā)現(xiàn)的生物污染包括細(xì)菌、霉菌和酵母菌不容易被發(fā)現(xiàn)的生物污染包括病毒、原蟲、昆蟲、支原體和其它細(xì)胞系2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第120頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分生物污染biologicalcontamination對實(shí)驗(yàn)人員是一個(gè)潛在的危險(xiǎn)因素細(xì)胞系交叉污染污染在這是個(gè)錯(cuò)誤的用詞難于發(fā)現(xiàn)若出現(xiàn)傳代細(xì)胞的生長速度異常，考慮交叉污染同一時(shí)間只傳同一種細(xì)胞每種細(xì)胞要有單獨(dú)的液體建立細(xì)胞庫每三個(gè)月更換一次細(xì)胞支原體污染細(xì)菌、霉菌和酵母無抗生素污染易被發(fā)現(xiàn)抗生素存在易造成隱性污染隱性污染引起嚴(yán)重后果病毒最難發(fā)現(xiàn)和清除嚴(yán)格的宿主性自限性2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第121頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)菌與真菌的污染2010/11/29本文檔共179頁；當(dāng)前第122頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)菌污染檢測肉眼直接觀察法：培養(yǎng)液渾濁或細(xì)胞生長緩慢。培養(yǎng)檢查法：用肉湯培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基37度培養(yǎng)待檢樣品數(shù)日，觀察肉湯培養(yǎng)基有無渾濁，或瓊脂培養(yǎng)基有無菌落形成。顯微鏡觀察法：鏡下可見大量菌體細(xì)菌與真菌的污染2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第123頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分真菌污染的檢測肉眼直接觀察法：大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面顯微鏡觀察法：鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀菌絲，縱橫交錯(cuò)。念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵圓形。細(xì)菌與霉菌的污染2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第124頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)菌與真菌的污染常見污染的細(xì)菌有革蘭陰性菌如：大腸埃希菌、假單胞菌等；革蘭陽性菌有葡萄球菌、枯草桿菌等.真菌污染?？砂l(fā)生，尤其炎熱、潮濕的季節(jié)十分常見，如煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子苗等。霉菌和細(xì)菌生長迅速，能在短時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長，或產(chǎn)生有意物質(zhì)殺死細(xì)胞。鏡下可見腦漿內(nèi)出現(xiàn)大量顆粒，細(xì)胞變圓或崩潰，從瓶壁脫落。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第125頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分

霉菌污染容易發(fā)現(xiàn)，大多形成白色或淺黃色菌團(tuán)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見，有的散在生長，鏡下可見絲狀菌絲，縱橫交錯(cuò)于細(xì)胞之間。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第126頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分常見真菌形態(tài)2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第127頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分真菌污染的成纖維細(xì)胞2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第128頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分白假絲酵母菌污染

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第129頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)菌污染如果較嚴(yán)重時(shí)培養(yǎng)基上清混濁，較輕時(shí)鏡下可見小的菌體在細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)，同時(shí)可涂片染色鏡檢或進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，加以確定。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第130頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分支原體（雜草）支原體污染biologicalcontamination2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第131頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第132頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分支原體（雜草）支原體污染biologicalcontamination污染嚴(yán)重難發(fā)現(xiàn)難去除顯微鏡看不到不引起培養(yǎng)液渾濁和PH改變營養(yǎng)要求高不容易用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法檢測到不能通過過濾清除大多數(shù)抗生素對其無效2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第133頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分支原體污染來源人體的組織及體液成分是細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的主要來源。污染的細(xì)胞中通常能分離到人類口腔支原體、發(fā)酵支原體、唾液支原體以及其它一些與人有關(guān)的支原體，操作過程中，操作者能產(chǎn)生有污染性的隨空氣傳播的飛沫和微粒，造成培養(yǎng)體系的污染。培養(yǎng)體系中支原體污染的最可能途徑是經(jīng)已被支原體污染的細(xì)胞擴(kuò)散和傳播。牛血清中能分離到A.laidlawii、M.arginini和M.hyorhinis支原體，因此血清可能成為支原體污染的來源2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第134頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分支原體污染危害1）雜交瘤技術(shù)

1融合細(xì)胞無分泌單抗的能力

2雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗不是針對靶抗原，而是針對支原體

3支原體消耗胸腺嘧啶，干擾HAT*篩選

4在HAT篩選過程中喪失了雜交瘤細(xì)胞2）細(xì)胞遺傳學(xué)

1造成羊水污染

2姊妹染色單體交換增多

3染色體隨機(jī)斷裂和畸變增多

4產(chǎn)生額外的染色體

5干擾羊水培養(yǎng)的結(jié)果

6精子污染后受精能力下降

7染色體數(shù)目減少2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第135頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分3）病毒學(xué)

1轉(zhuǎn)錄酶活性下降

2干擾某些逆轉(zhuǎn)錄病毒的分離

3降低禽痘病毒的感染力及空斑的形態(tài)

4誘導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生干擾素

5抑制腺病毒的增殖

6誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生干擾素

7污染病毒疫苗

8引起巨細(xì)胞病毒及帶狀病毒形成假空斑

9降低腺病毒及SV40胸腺嘧啶的摻入

10抑制腺病毒和單純皰疹病毒的增殖

11抑制脊髓灰質(zhì)炎病毒和牛痘病毒的增殖

12支原體與病毒在蔗糖梯度離心中共沉淀

13抑制新城病病毒（NDV）產(chǎn)生干擾素

支原體污染危害2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第136頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分4）代謝

1降低鳥氨酸脫羧酶的產(chǎn)生

2降低蛋白質(zhì)和RNA的產(chǎn)生

3消耗培養(yǎng)液中的精氨酸

4改變尿苷／尿氨酸的比例

5降低DNA和RNA的合成

6增加胸腺嘧啶的降解

7誘導(dǎo)3T3細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶

8增加致癌物誘導(dǎo)芳香烴羥化酶的產(chǎn)生

9促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的增殖

10降低嘌呤替代途徑

11降低ATP水平5）生物反應(yīng)性

引起鼠的淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化支原體污染危害2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第137頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分支原體污染檢測由于支原體污染并不引起細(xì)胞外觀的明顯變化，故常規(guī)的支原體檢測非常必要的。人們可利用一系列直接或間接的方法檢測支原體。但由于支原體種類的多樣性，目前還沒有一種方便、廣譜、特異性高、準(zhǔn)確的檢測方法。因此，有必要對不同檢測方法的靈敏度及局限性有所了解。

2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第138頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分支原體檢測方法支原體污染檢測biologicalcontamination方法敏感性優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)直接DNA染色(如Hoechst33258)低快速，便宜需要熒光顯微鏡結(jié)果不易解釋指示細(xì)胞上間接DNA染色(如

Vero)中放大污染結(jié)果易解釋費(fèi)時(shí)免疫熒光單克隆抗體易操作靈敏需要熒光顯微鏡肉湯和瓊脂培養(yǎng)高靈敏慢需要專業(yè)解釋ELISA中快速檢查種類有限PCR中-高特異性強(qiáng)快速需要PCR設(shè)備2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第139頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分直接培養(yǎng)法是最敏感的，但也是最耗時(shí)的檢測方法，大約需28天。從理論上講，只需一個(gè)有活力的支原體就能在培養(yǎng)基上生長。但某些難以培養(yǎng)的支原體限制了直接培養(yǎng)法的應(yīng)用。直接培養(yǎng)法還需要活性支原體作為陽性對照，而且耗時(shí)，操作繁瑣，因而不適于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。支原體檢測方法2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第140頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分間接檢測法包括：PCR、ELISA、電子顯微鏡檢查、DNA探針、DNA熒光染色及生化分析法等。間接法能檢測到107／L的滴度。通常情況下，支原體污染后其滴度一般超過109／L，故盡管間接法不敏感，但相對較精確。由于支原體的多樣性，表達(dá)不同特異性的抗原及酶，為生化及免疫檢測法帶來技術(shù)上的困難。在選擇PCR、DNA探針等方法前，應(yīng)考慮好選擇合適的靶序列及引物序列。

支原體檢測方法2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第141頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分DNA熒光染色法原理︰利用熒光染劑（bisbenzimide,Hoechst33258）檢測支原體污染。此染劑會(huì)結(jié)合到DNA的(A-T)rich區(qū)域，因?yàn)橹гwDNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%），所以可將其染色而得以檢測。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點(diǎn)，即為支原體的DNA，證明有支原體之污染。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第142頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞DNA支原體DNA熒光染色法2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第143頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分陽性陰性DNA熒光染色法2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第144頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第145頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第146頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分DNA熒光染色法質(zhì)控與提示（1）標(biāo)記的靶細(xì)胞除CKI－1和vero細(xì)胞外，3T6細(xì)胞（ARCCCCL96）也可使用。本法成功的要點(diǎn)之一是用作靶細(xì)胞質(zhì)控的管理應(yīng)嚴(yán)格，必預(yù)先確認(rèn)該細(xì)胞無支原體的污染才能凍存使用。（2）要明確本檢體的結(jié)果判定，必須使用不含抗生素的培養(yǎng)液。（3）染色液：Hoechst染液不穩(wěn)定，故每次檢測前須新鮮配制，使用DAPI也可以，均應(yīng)新鮮配制。2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第147頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分（4）試驗(yàn)檢體：被試細(xì)胞回收時(shí)用橡膠刮匙刮下，不能用胰蛋白酶等水解酶類消化，制備好的檢體細(xì)胞保存在－80℃冰箱中可存放數(shù)月。（5）陽性對照：本試驗(yàn)采用支原體M.hyorhinis和M.orale為陽性對照，要十分注意避免有新的污染源。DNA熒光染色法質(zhì)控與提示2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第148頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分（6）特異性與敏感性：本法不是支原體的特異性檢出法，對DNA進(jìn)行染色觀察，對其他微生物（細(xì)胞內(nèi)寄生的霉菌、細(xì)菌等）的污染，也可看出同樣的熒光染色。本法針對這些支原體污染的檢出敏感度為1cfu，而一般污染細(xì)胞中的支原體濃度為103－108cfu/mL，故本法仍具有很好的實(shí)用性。DNA熒光染色法質(zhì)控與提示2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第149頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分DNA熒光染色法和直接培養(yǎng)法相結(jié)合是支原體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。美國、加拿大和歐共體國家生物制藥及診斷的監(jiān)督機(jī)構(gòu)推薦使用這種方法。其基本原理在于利用不同的技術(shù)，多次檢測，以彌補(bǔ)各種檢測技術(shù)的缺陷，增加檢測結(jié)果的可信度。

DNA熒光染色法質(zhì)控與提示2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第150頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分PCRkit-Fisher,Strategene,Sigma2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第151頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分分子量對照2陰性對照3-8原有細(xì)胞的懸液9陽性對照VenorGeM試劑盒2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第152頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞系交叉污染2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第153頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分細(xì)胞系交叉污染2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第154頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分生物污染控制biologicalcontamination樹立“預(yù)防為主”的思想保證細(xì)胞來源干凈確?；|(zhì)和器材無菌嚴(yán)格無菌操作細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)避免交談操作結(jié)束時(shí)消毒臺(tái)面每傳15代的細(xì)胞應(yīng)更換所有細(xì)胞培養(yǎng)材料丟棄前應(yīng)高壓消毒2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第155頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分控制污染controlcontamination良好的無菌操作合理利用抗生素建立細(xì)胞庫保持工作區(qū)清潔良好的規(guī)章制度細(xì)胞污染的檢測2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第156頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分良好的無菌操作所有玻璃器皿和培養(yǎng)液與試劑的配制應(yīng)嚴(yán)格無菌避免溢出、濺出和氣溶膠；吸入或吸出液體時(shí)避免傾倒；吸入或吸出液體時(shí)，不要觸碰細(xì)胞培養(yǎng)瓶的瓶口；液體應(yīng)分裝并置4-8oC保存；每種細(xì)胞應(yīng)使用單獨(dú)的液體；清潔區(qū)和污染區(qū)的材料應(yīng)單獨(dú)處理；控制污染controlcontamination2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第157頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分合理利用抗生素過度依賴抗生素會(huì)使人們忽略無菌操作濫用抗生素常導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生牢記抗生素不能代替無菌操作控制污染controlcontamination2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第158頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分建立細(xì)胞庫減少從主管單位獲得細(xì)胞的運(yùn)輸費(fèi)凍存的細(xì)胞生物性狀不發(fā)生改變消除了隱蔽污染的潛在危害控制污染controlcontamination2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第159頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第160頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分良好的規(guī)章制度只有相關(guān)人員才可進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)必須和其他區(qū)域分開每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)應(yīng)布局合理，保證所需物品就近放置，在處理細(xì)胞時(shí)避免不必要的走動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)應(yīng)避免使用水池，從而避免微生物污染控制污染controlcontamination2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第161頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分控制污染controlcontamination保持工作區(qū)清潔常規(guī)清洗地面和臺(tái)面CO2孵箱每2-3個(gè)月消毒清洗孵箱所有濺出或溢出的液滴應(yīng)立即擦拭并消毒每周孵箱內(nèi)水盤需徹底消毒清洗定期清潔水浴箱生物安全柜每次使用后應(yīng)清潔和消毒安全柜的內(nèi)表面定期消毒安全柜工作面下層的盤子；及時(shí)清理廢棄物，高壓感染材料2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第162頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分控制污染controlcontamination細(xì)胞污染的檢測支原體的檢測其它生物污染的檢測使用傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測方法化學(xué)污染的檢測常被誤認(rèn)為生物污染要靠逐一替換的方法確定化學(xué)污染的來源2009/12/04本文檔共179頁；當(dāng)前第163頁；編輯于星期二\0點(diǎn)45分1）使用抗生素抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素(青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL)，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗。

清除污染方法