核酸分子雜交(研究生課程)

內(nèi)容提要第二節(jié)核酸探針（Probe）第三節(jié)雜交類別與應用第一節(jié)分子雜交概念與基本原理本文檔共77頁；當前第1頁；編輯于星期二\16點27分第一節(jié)分子雜交概念與基本原理

Concept&PrincipleofMolecularHybridization本文檔共77頁；當前第2頁；編輯于星期二\16點27分

單鏈的核酸分子在合適的條件下，與具有堿基互補序列的異源核酸形成雙鏈雜交體的過程稱核酸分子雜交（molecularhybridization）一、分子雜交概念本文檔共77頁；當前第3頁；編輯于星期二\16點27分變性復性

DNA-DNA雜交雙鏈分子本文檔共77頁；當前第4頁；編輯于星期二\16點27分二、分子雜交基本原理變性復性本文檔共77頁；當前第5頁；編輯于星期二\16點27分DNA加熱變性DNA冷卻復性DNA/RNA雜交Tm(meltingtemperature)

：DNA從部分變性到完全變性是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)進行，這一溫度范圍的中點稱為熔點溫度。本文檔共77頁；當前第6頁；編輯于星期二\16點27分（一）DNA變性（denaturation）1、DNA變性某些理化因素導致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性。本文檔共77頁；當前第7頁；編輯于星期二\16點27分2、變性的方法（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。（2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（3）化學試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛純水等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。本文檔共77頁；當前第8頁；編輯于星期二\16點27分3、DNA變性曲線

AT區(qū)先解鏈

GC區(qū)后解鏈

階梯式曲線本文檔共77頁；當前第9頁；編輯于星期二\16點27分DNA變性的基本過程本文檔共77頁；當前第10頁；編輯于星期二\16點27分（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.34、GC含量與Tm值之間的關(guān)系本文檔共77頁；當前第11頁；編輯于星期二\16點27分定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復性或雜交。具有互補序列兩條單鏈都可形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。（二）DNA復性（renaturation）本文檔共77頁；當前第12頁；編輯于星期二\16點27分復性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子本文檔共77頁；當前第13頁；編輯于星期二\16點27分

三、影響雜交（復性）的因素1、核酸分子的濃度和長度

濃度越大，復性速度越快分子越大，復性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1～0.5μg/ml,濃度過高影響雜交效率本文檔共77頁；當前第14頁；編輯于星期二\16點27分2、溫

度

（1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低20～25℃（2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5℃本文檔共77頁；當前第15頁；編輯于星期二\16點27分3、離子強度

（1）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度本文檔共77頁；當前第16頁；編輯于星期二\16點27分4、甲酰胺

（1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在35～42℃雜交；（2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在68℃雜交。

本文檔共77頁；當前第17頁；編輯于星期二\16點27分5、核酸分子的復雜性

（1）核酸的復雜性是指存在于反應體系中不同序列的總長度（２）兩個DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于DNA的相對復雜性本文檔共77頁；當前第18頁；編輯于星期二\16點27分6、非特異性雜交反應

（1）雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附（2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉本文檔共77頁；當前第19頁；編輯于星期二\16點27分第二節(jié)核酸探針（Probe）本文檔共77頁；當前第20頁；編輯于星期二\16點27分

1、什么是探針(probe)一小段用同位素、生物素或熒光染料標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。一、探針概念本文檔共77頁；當前第21頁；編輯于星期二\16點27分

DNA探針是最常用的核酸探針，長度在幾百bp以上的雙鏈或單鏈cDNA片段（通常400—500bp）放射性或非放射性標記的RNA分子，用于探測與之互補的DNA或RNA鏈，RNA探針通常通過克隆相應DNA在體外轉(zhuǎn)錄合成而制備（通常400—500bp）

RNA探針

寡核苷酸探針一般有17-50個核苷酸組成，可以是寡聚脫氧核醣核酸、寡聚核糖核酸和肽核酸二、探針種類本文檔共77頁；當前第22頁；編輯于星期二\16點27分

理想標記物應具備的特性高度靈敏性不影響堿基配對的特異性不影響探針分子的主要理化性質(zhì)對酶促反應活性無影響或影響不大檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性三、探針標記物本文檔共77頁；當前第23頁；編輯于星期二\16點27分核素標記物：32p、35s、3H非核素標記物半抗原：生物素、地高率配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等化學發(fā)光探針：標記物與某種底物反應發(fā)光，如生物素?；膲A性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光。

標記物種類本文檔共77頁；當前第24頁；編輯于星期二\16點27分四、探針標記方法隨機引物標記

DNA缺口平移標記全程RNA探針標記化學法全程標記

3′末端標記

5′末端標記

本文檔共77頁；當前第25頁；編輯于星期二\16點27分隨機引物標記—最常用DNA模板引物和模板DNA結(jié)合加入klenow片斷、3種dNTP和1種標記dNTP引物延伸標記的DNA片段未標記的DNA模板本文檔共77頁；當前第26頁；編輯于星期二\16點27分DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性5’－3’聚合酶活性）＋3dNTP＋1dNTP#DNaseⅠDNA聚合酶Ⅰ（5’－3’核酸外切酶活性5’－3’聚合酶活性）模板DNA切開模板DNA形成一到幾個堿基的缺口摻入標記基團缺口平移DNA缺口平移標記本文檔共77頁；當前第27頁；編輯于星期二\16點27分在△處酶切在◆處酶切從T7啟動子轉(zhuǎn)錄從SP6啟動子轉(zhuǎn)錄全程RNA探針標記本文檔共77頁；當前第28頁；編輯于星期二\16點27分一、設(shè)計原理化學法全程標記(生物素或地高辛標記)

與地高辛標記的探針雜交加入與堿性磷酸酶結(jié)合的抗地高辛抗體加入底物BCIP/NBTCSPD本文檔共77頁；當前第29頁；編輯于星期二\16點27分一、設(shè)計原理末端標記3’-末端標記5’3’3’5’5’末端突出的DNA5’5’3’3’3’末端標記的DNA完整雙鏈DNAKlenowDNA聚合酶32p—dNTP變性32p末端標記的單鏈DNA探針本文檔共77頁；當前第30頁；編輯于星期二\16點27分一、設(shè)計原理末端標記5’-末端標記本文檔共77頁；當前第31頁；編輯于星期二\16點27分乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白質(zhì)凝膠過濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（<80bp)等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是SephadexG-50微柱離心法：其原理與上述凝膠過濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來純化探針。五、探針的純化本文檔共77頁；當前第32頁；編輯于星期二\16點27分第三節(jié)雜交類別與應用本文檔共77頁；當前第33頁；編輯于星期二\16點27分三種印跡技術(shù)的比較本文檔共77頁；當前第34頁；編輯于星期二\16點27分

（一）液相雜交

（二）固相雜交（三）原位雜交（四）基因芯片技術(shù)點雜交/狹縫雜交菌落雜交Northern雜交Southern雜交反點向雜交本文檔共77頁；當前第35頁；編輯于星期二\16點27分一、MASA液態(tài)芯片本文檔共77頁；當前第36頁；編輯于星期二\16點27分二、雜交的基本分類MASA是一種在懸浮液態(tài)體系中進行的生物分子間反應，并以100種不同熒光編碼的微球作為探針的一類新型生物芯片技術(shù)。它集合了流式細胞技術(shù)、數(shù)字信號處理技術(shù)、激光技術(shù)及傳統(tǒng)化學技術(shù)為一體，是一種新型生物分子檢測技術(shù)。其反應體系中可以進行大分子蛋白、小分子蛋白、核酸等生物的檢測。本文檔共77頁；當前第37頁；編輯于星期二\16點27分MASA技術(shù)的原理是用不同的熒光顏色對乳膠顆粒進行編碼使之具有檢測多個靶分子的能力二、雜交的基本分類本文檔共77頁；當前第38頁；編輯于星期二\16點27分

概念：反向點雜交(reversedotblot，RDB)是Saiki等提出的一種斑點雜交技術(shù)，是將探針固定在玻璃芯片或尼龍膜上，用于檢測擴增產(chǎn)物中是否含有目標基因的技術(shù)。二、反點向雜交本文檔共77頁；當前第39頁；編輯于星期二\16點27分原理與應用：RDB是先將待用的探針分別點到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，每個探針一個點并編上號，再將待測的DNA樣本(一般是經(jīng)PCR特異性擴增的產(chǎn)物，在PCR引物5’端預先進行生物素標記，使擴增產(chǎn)物相應標記有生物素)與之雜交；本文檔共77頁；當前第40頁；編輯于星期二\16點27分

待檢樣本就會與具有同源序列的探針結(jié)合，經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的DNA樣本，由于待測的DNA樣本具有生物素類的標記物，結(jié)合了待測DNA的探針點上就帶有生物素類的標記物，再經(jīng)相應的顯色反應就能顯出雜交信號。

一次就可以判斷某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此利用這樣的工作原理還可以用于基因分型、病原體檢測、腫瘤研究等。

本文檔共77頁；當前第41頁；編輯于星期二\16點27分本文檔共77頁；當前第42頁；編輯于星期二\16點27分2.Southernblot3.Northernblot4.點雜交和狹縫雜交5.熒光原位雜交6.基因芯片1.菌落雜交三、固向雜交本文檔共77頁；當前第43頁；編輯于星期二\16點27分1.菌落雜交本文檔共77頁；當前第44頁；編輯于星期二\16點27分分子雜交實驗①②③2.Southernblot本文檔共77頁；當前第45頁；編輯于星期二\16點27分2.Southernblot本文檔共77頁；當前第46頁；編輯于星期二\16點27分DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳分離膜上固定DNA片段在緩沖液中將標記的探針加到膜上DNA片段從瓊脂糖凝膠上轉(zhuǎn)印到膜上雜交信號的檢測2.Southernblot本文檔共77頁；當前第47頁；編輯于星期二\16點27分

1、裂解或破碎細胞

2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段待測核酸樣品的制備本文檔共77頁；當前第48頁；編輯于星期二\16點27分1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠，分離小片段用高濃度膠2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應，大分子DNA泳動慢,小分子DNA泳動快，大小相同的分子處于同一條帶3、分子量標準：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標準可用核素標記

待測DNA樣品的電泳分離本文檔共77頁；當前第49頁；編輯于星期二\16點27分凝膠中核酸的變性（堿變化）

凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液。

本文檔共77頁；當前第50頁；編輯于星期二\16點27分Southern印跡指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程本文檔共77頁；當前第51頁；編輯于星期二\16點27分固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應具備的特性①具有較強結(jié)合核酸分子的能力②不影響與探針的雜交反應③與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固④具有良好的機械性能

非特異吸附少本文檔共77頁；當前第52頁；編輯于星期二\16點27分（2）常用的固相支持物

①硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本底低。缺點是DNA分子結(jié)合不牢固②尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高

③化學活化膜：優(yōu)點：DNA與膜共價結(jié)合；對不同大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點：結(jié)合能力較上述兩種膜低本文檔共77頁；當前第53頁；編輯于星期二\16點27分Southern印跡的常用方法

（1）毛細管虹吸印跡法利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上本文檔共77頁；當前第54頁；編輯于星期二\16點27分（2）電轉(zhuǎn)法

利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。本文檔共77頁；當前第55頁；編輯于星期二\16點27分（3）真空轉(zhuǎn)移法

此法原理與毛細管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。本文檔共77頁；當前第56頁；編輯于星期二\16點27分

Southern雜交

1、預雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點預雜交液為不含DNA探針的雜交液

2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交

3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA

本文檔共77頁；當前第57頁；編輯于星期二\16點27分

雜交結(jié)果檢測1、放射自顯影：適用于放射性核素標記的探針2、比色或化學發(fā)光檢測：適于非核素標記的探針本文檔共77頁；當前第58頁；編輯于星期二\16點27分Southern雜交在醫(yī)學中的應用

1、酶切圖譜分析

2、特定基因定性和定量

3、基因突變分析

4、限制性片段長度多態(tài)性的分析本文檔共77頁；當前第59頁；編輯于星期二\16點27分1、基本原理和基本過程與Southernblot

基本相同2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段4、待測樣品為總RNA或mRNA3.Northern印跡雜交本文檔共77頁；當前第60頁；編輯于星期二\16點27分Northern印跡與Southern印跡的不同點

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理3、靶核酸為RNA本文檔共77頁；當前第61頁；編輯于星期二\16點27分4.點雜交和狹縫雜交

DNA樣品點到濾膜上1變性2中和3固定DNA4與標記探針雜交5洗脫與顯影探針DNA探針標記

變性將探針加到固定的DNA上本文檔共77頁；當前第62頁；編輯于星期二\16點27分

1、斑點印跡為圓形2、狹縫印跡為線狀3、鑒別DNA、RNA4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量本文檔共77頁；當前第63頁；編輯于星期二\16點27分1）定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交。5.原位雜交本文檔共77頁；當前第64頁；編輯于星期二\16點27分保持組織細胞的形態(tài)對核酸無抽提，修飾與降解作用不改變核酸在組織細胞內(nèi)的定位不阻礙核酸與探針的雜交過程對雜交信號無遮蔽作用理化性質(zhì)穩(wěn)定2）雜交過程（1）組織或細胞的固定，理想固定液應具備：本文檔共77頁；當前第65頁；編輯于星期二\16點27分（2）組織細胞雜交前的預處理去垢劑（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白質(zhì)組織細胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復合體控制消化時間，避免細胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻片上脫落本文檔共77頁；當前第66頁；編輯于星期二\16點27分（3）探針的選擇與標記以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針探針的長度一般為50～300bp,有時達1.5kb

放射性核素標記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時間長非核素標記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易于觀察本文檔共77頁；當前第67頁；編輯于星期二\16點27分（4）雜交雜交液體積?。?0～20μlcDNA和RNA探針雜交溫度約為50℃

雜交時間:DNA探針雜交為2～4h.RNA探針雜交過夜雜交前一般將組織切片