WatersUPLC色譜柱使用指南

ACQUITYUPLCTMBEH色譜柱使用和維護(hù)指南感謝您選擇WatersACQUITYUPLCTMBEHACQUITYUPLCTMBEH柱的填料是專為用于WatersACQUITYUPLCTM系統(tǒng)而設(shè)計(jì)的，并且是使用超純的試劑在經(jīng)過cGMP和ISO9002認(rèn)證的工廠生產(chǎn)制造的。每一批ACQUITYUPLCTMBEH柱的填料都用酸性、堿性和中性組分經(jīng)色譜法測(cè)試,且結(jié)獨(dú)的測(cè)試并且色譜性能和批次分析的認(rèn)證都記錄在eCord智能芯片當(dāng)中。Ⅰ開始柱連接部件柱安裝

柱平衡deCord安裝e初始的柱效測(cè)試Ⅱ柱使用a樣品制備bpH范圍c溶劑壓力溫度Ⅲ等度方法的縮放Ⅳ柱清洗,再生和保存清洗和再生保存eCord智能芯片技術(shù)介紹Ⅵ附錄Ⅰ開始每根ACQUITYUPLCTMBEH柱都隨柱帶eCord智能芯片中。每批ACQUITYUPLCTMBEH這些報(bào)告中包括硅膠批號(hào)、未鍵合顆粒的分而且還包括以下信息:硅膠批號(hào)、柱序列號(hào)、參考。a色譜柱的連接部件ACQUITYUPLCTM系統(tǒng)運(yùn)用了符合嚴(yán)格小化柱外體積。優(yōu)化了的柱入口端的管路(部件號(hào)430001084)UPLCTM5/16英吋的扳手?jǐn)Q緊壓緊裝置。相關(guān)的ACQUITYUPLCTM系統(tǒng)檢測(cè)器部分操71500082502)。

沖洗輸送過任何緩沖液流動(dòng)相的泵系統(tǒng)，將色譜柱入口連接到進(jìn)樣器出口端。100%的有機(jī)相(甲醇或乙腈)沖洗色譜0.1ml/min5分鐘0.5ml/min。當(dāng)流動(dòng)相通暢地從柱出口端流出時(shí)，停止流速并且將柱出口端連接到檢測(cè)器。這樣可以避免空氣進(jìn)入到檢測(cè)器系統(tǒng)，從而很快使基線平衡。2步的程序逐漸升流速。待反壓和基線平穩(wěn)之后繼續(xù)以下的步驟。注意:如果流動(dòng)相中有低濃度的添加劑(比如離子對(duì)試劑)100200倍柱體括甲酸鹽(比如甲酸銨，甲酸等)也需要長(zhǎng)時(shí)間的初始柱平衡。柱平衡BEH100%列表)。(10作為沖洗溶劑的體積)b柱安裝柱長(zhǎng)內(nèi)徑（mm）注意:以下給出的升流速的程序適用于(mm)1.02.12.1mm內(nèi)徑、50mm長(zhǎng)、1.7μm的色譜柱。200.0160.07對(duì)于1.0mm內(nèi)徑的色譜柱，用第Ⅲ節(jié)的計(jì)算300.0240.1500.040.2力的指南。1000.080.41500.120.5為避免流動(dòng)相中緩沖鹽在色譜柱或系統(tǒng)5倍柱體積的水/有機(jī)相混合溶劑來溶劑組成。(60%40%緩沖液之60%的甲醇水溶液沖洗色譜柱和系統(tǒng))。TM安裝dTM按扣應(yīng)該安在柱溫箱裝置的旁邊。dTM殊地定位。初始的柱效測(cè)定在使用之前進(jìn)行柱效測(cè)定，Waters推薦使用“性能測(cè)試色譜圖”中所用的合適的混合物分析您所收到的色譜柱。測(cè)定理論塔板數(shù)，并用這個(gè)值來定期地比較。隨著時(shí)間的推移，要每間隔一段時(shí)間就重新測(cè)定一下，以此追蹤色譜柱性能。由于色譜系統(tǒng)中連接質(zhì)量、操作環(huán)境、系統(tǒng)電子學(xué)、試劑質(zhì)量以及柱條件和操作技術(shù)的不同，因此方法有時(shí)需要稍作改變。Ⅱ色譜柱使用為確保ACQUITYUPLCTMBEH柱的持續(xù)高效，請(qǐng)遵循以下準(zhǔn)則：

樣品制備樣品中的雜質(zhì)常常是色譜柱污染的原因，避免這種情況的一種選擇就是使用合適的Sep-pak小柱在樣品分析前進(jìn)行凈化。最好用流動(dòng)相或是弱于流動(dòng)相(更少的有機(jī)相)來配制樣品，這樣能夠得到好的峰形和靈敏度。如果樣品不溶于流動(dòng)相，要確保樣品溶劑與流動(dòng)相是互溶的，從而避免樣品或是緩沖液的沉淀。的膜過濾樣品以去除顆粒。如果樣品溶于包含有機(jī)相的溶劑中，那么要確保膜材料不會(huì)在有機(jī)相中溶解。聯(lián)系膜生產(chǎn)商咨詢關(guān)于膜的溶劑兼溶性問題。或是8000rmp20分鐘，然后將上層液體轉(zhuǎn)移到合適的進(jìn)樣瓶中。pH范圍ACQUITYUPLCTMBEH柱推薦使用的pH以及添加劑。的磷酸鹽緩沖液會(huì)降低柱壽命。BEH柱推薦使用的pH1-12的緩沖鹽：添加物/緩沖鹽pKa緩沖范圍±pH單位揮發(fā)性可否用于質(zhì)譜備注三氟醋酸0.3有是離子對(duì)添加物會(huì)引起質(zhì)譜信號(hào)的離子抑制用在0.02%-0.1%的范圍內(nèi).醋酸4.76有是當(dāng)與醋酸銨一起使用時(shí),能達(dá)到最大的緩沖能力.用在0.1%-1.0%范圍內(nèi).甲酸3.75有是當(dāng)與甲酸銨一起使用時(shí),能達(dá)到最大的緩沖能力.用范圍內(nèi).醋酸/醋酸銨4.763.76-5.76有是1-10mM的范圍,注意鈉鹽和鉀鹽是不揮發(fā)的.甲酸/甲酸銨3.752.75-4.75有是1-10mM的范圍,注意鈉鹽和鉀鹽是不揮發(fā)的.12.151.15-3.15無否pH緩沖鹽,具有很好的紫外透明度.27.26.20-8.20無否pH7以上,最好降低溫度和濃度且用保護(hù)柱,以此最大程度延長(zhǎng)柱壽命.4-甲基嗎啉~8.47.4-9.4有是10mM或更低濃度.氨水9.28.2-10.2有是10mM以下,30℃以下.碳酸氫銨10.3(HCO3-)9.2(NH4+)6.3(H2CO3)6.8-11.3有是5-10mM范圍(用于質(zhì)譜時(shí),150℃.用氫pH,pH10有很好的緩沖能力.NH4HCO3而不是(NH42CO3醋酸銨9.28.2-10.2有是的范圍甲酸銨9.28.2-10.2有是的范圍硼酸鹽9.28.2-10.2無否最好降低溫度和濃度且用保護(hù)柱,以此最大程度延長(zhǎng)柱壽命.CAPSO9.78.7-10.7無否兩性離子緩沖鹽,與乙腈互溶,1-10mM范圍,氣味小甘氨酸2.4,9.88.8-10.8無否兩性離子緩沖鹽,對(duì)于柱壽命的延長(zhǎng)比硼酸鹽好.1-甲基哌啶10.29.3-11.3有是范圍CAPS10.49.5-11.5無否兩性離子緩沖鹽,乙腈互溶,用1-10mM范圍,氣味小.三乙胺(醋酸鹽)10.79.7-11.7有是0.1-1.0%范圍,只有當(dāng)用醋酸(而不是鹽酸或磷酸).DNA時(shí),pH7-9用作離子對(duì)試劑吡咯烷11.310.3-12.3有是溫和的緩沖液,有利于延長(zhǎng)柱壽命試劑為保持最好的柱性能，請(qǐng)使用高質(zhì)量的色譜級(jí)溶劑。用前過濾所有的緩沖鹽水溶液，推Acrodisc濾膜。溶劑中包含的懸浮顆粒會(huì)在柱入口端的篩板處形成堵塞，這將會(huì)導(dǎo)致高反壓和低柱效。

在使用前要完全脫氣。推薦使用在線過濾裝置。這對(duì)于低壓梯度尤其重要，因?yàn)橛袡C(jī)相和水相在梯度混和時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡。壓力ACQUITYUPLCTMBEH柱能夠耐受極性樣品非極性樣品蛋白樣品1.水極性樣品非極性樣品蛋白樣品1.水1.異丙醇(或合適的異丙醇/水混和溶液)1.重復(fù)進(jìn)樣少量二甲基亞砜2.甲醇2.四氫呋喃2.10%到90%B;A=0.1%三氟醋酸水液;B=0.1%三氟醋酸乙腈溶液3.四氫呋喃3.二氯甲烷4.甲醇4.正己烷5.水5.異丙醇(接著用合適比例的異丙醇/水混和溶液)3.7M的鹽酸胍或是7M的尿素沖洗6.流動(dòng)相6.流動(dòng)相溫度為確保ACQUITYUPLCTMBEH柱的選擇性、降低溶劑粘度和提高質(zhì)量遷移速率，推薦20℃-55℃柱溫下使用。在極端的pH條件、溫度或是反壓下工作會(huì)縮短柱壽命。Ⅲ按比例縮放等度方法按以下的公式可以在維持同樣的線速度的條件下等比例縮放方法，并能計(jì)算出新的上樣量。如果柱內(nèi)徑和長(zhǎng)度變化:F2=F1(r2/r1)2Load2=Load1(r2/r1)2(L2/L1)進(jìn)樣體積2=進(jìn)樣體積1Load1(r2/r1)2(L2/L1)其中:柱半徑F=流速L=柱長(zhǎng)1=原始或是參比柱2=新柱Ⅳ柱清洗、再生和保存清洗和再生峰形改變、峰分岔、肩峰、保留時(shí)間漂移、分離度變化或是反壓增加可能表明色譜柱被污染。用純有機(jī)溶劑沖洗(注意不要有緩沖鹽沉淀)通常足夠去除這些污染。如果沖洗程序不能解決問題，可用以下清洗和再生程序來沖洗色譜柱。選用清洗程序應(yīng)適合樣品的性質(zhì)或是任何你認(rèn)為柱內(nèi)的污染物(3)20倍柱體HPLC級(jí)溶劑清洗，增加柱溫到35-55℃會(huì)增加清洗效率。如果再生和清洗之后柱效仍Waters辦事處以得到更多的幫助。

3柱清洗程序*用低的有機(jī)溶劑組成來避免緩沖鹽沉淀.b保存100%于在高溫下的應(yīng)用，為保證最好的柱壽命應(yīng)在100%柱保存在緩沖鹽洗脫液中。如果流動(dòng)相包括緩10HPLC級(jí)水(參見表1通常的柱體積)沖洗色譜柱,100%的乙腈替換保存。如果不用水過渡，當(dāng)100%的乙腈充滿柱時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽在柱中沉淀。色譜柱應(yīng)完全密封以避免溶劑揮發(fā)，柱床變干。ⅤeCorda介紹eCord智能芯片是一項(xiàng)新的技術(shù)，能夠在色譜柱使用過程中全程記錄色譜柱性能的歷史。eCord永久地連接在色譜柱上以確保在色譜柱從一個(gè)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換到另一個(gè)系統(tǒng)時(shí)，柱的性能歷史得到記錄。在生產(chǎn)色譜柱的時(shí)候,質(zhì)量追蹤和控制的信eCord當(dāng)中。在芯片中保存這些信息就不再需要紙面的分析認(rèn)證。一旦使用者安裝了柱子，軟件就會(huì)自動(dòng)地載入柱歷史的主eCord提供了簡(jiǎn)單的追蹤柱使用歷史的方法。安裝eCordeCord安裝在柱溫箱Masslynx軟件識(shí)別，并且會(huì)讓使用者獲得色譜柱的全部使用信息。生產(chǎn)信息eCordQC檢測(cè)結(jié)果。eCord芯片給用戶提供了生產(chǎn)廠商QC檢測(cè)條件和結(jié)果，信息包括流動(dòng)相，測(cè)試條件和測(cè)試所用的分析物。另外QC結(jié)果和驗(yàn)收?qǐng)?bào)告也都放在了色譜柱中。用戶使用信息eCord芯片會(huì)自動(dòng)捕獲色譜柱使用的數(shù)據(jù)。屏幕上方顯示了色譜柱的化學(xué)品種類,色譜柱內(nèi)包括開始使用的日期,樣品組數(shù),用戶名稱,樣品組中的最高反壓和溫度以及色譜柱是否符合基本的系統(tǒng)適應(yīng)性要求。Ⅵ附錄信息a對(duì)于ACQUITYUPLCTMBEH1.7um柱推薦流速和預(yù)期的反壓值2.1mmID色譜柱(40℃)UPLC線速度(mm/sec)3456柱內(nèi)徑流速(ml/min)流速(ml/min)流速(ml/min)流速(ml/min)2.1Χ20mm0.4522000.6029000.7536000.9044002.1Χ30mm0.4530000.6041000.7551000.9061002.1Χ50mm0.4548000.6064000.7580000.9095002.1Χ100mm0.4591000.60121000.75152000.90182001.0mmID色譜柱(40℃)UPLC線速度(mm/sec)3456柱內(nèi)徑流速(ml/min)反壓(psi)流速(ml/min)反壓(psi)流速(ml/min)反壓(psi)流速(ml/min)反壓(psi)1.0Χ2