乙肝血清標志物檢測

關于乙肝血清標志物檢測第1頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三

前言病毒性肝炎在我國各類傳染病中發(fā)病率最高乙型病毒性肝炎在我國危害極大我國乙型肝炎患者近3千萬病毒性肝炎，一般特指由嗜肝病毒感染所引起的肝炎。HBV-屬嗜肝DNA病毒第2頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三A病毒性肝炎HepatitisVirus腸道傳播腸道外傳播F,TTV?其它ENANBBDC病毒性肝炎-背景第3頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三

傳染源糞便血液/血源性物質/體液血液/血源性物質/體液血液/血源性物質/體液糞便傳播途徑糞-口經皮膚/經粘膜經皮膚/經粘膜經皮膚/經粘膜糞-口慢性感染否是是是否病毒性肝炎類型ABCDE基因組類型ssRNAdsDNA

ssRNA

ssRNA

ssRNA第4頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三HepatitisBVirus乙型肝炎的病原體乙型病毒性肝炎[1]是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹鞑⒖梢鸲嗥鞴贀p害的一種傳染病。本病廣泛流行于世界各國，主要侵犯兒童及青壯年，少數(shù)患者可轉化為肝硬化或肝癌。因此，它已成為嚴重威脅人類健康的世界性疾病，也是我國當前流行最為廣泛、危害性最嚴重的一種傳染病。第5頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三乙型病毒性肝炎無一定的流行期，一年四季均可發(fā)病，但多屬散發(fā)。近年來乙肝發(fā)病率呈明顯增高趨勢估計全球半數(shù)以上人口已被HBV感染過，5%的人口為HBV慢性感染.中國：乙肝高發(fā)區(qū)，人群HBsAg的檢出率達9.8%第6頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三電鏡下HepatitisBVirus第7頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三乙型肝炎病毒HBV乙型肝炎病毒（HBV）為專一的嗜肝病毒，近年由于核酸分子雜交技術的進展，在肝外器官細胞也能檢出HBV-DNA。通過北京乙肝肝病毒試驗研究提供了在肝外細胞復制的證據(jù)。人HBV也可能在肝外細胞內復制，有待深入研究。HBV感染者血清經電鏡檢查有3種病毒顆粒.1.大球形顆粒，完整的HBV顆粒直徑為42nm，又名Dane顆粒，分為包膜與核心的兩部分，外衣殼及包膜含有表面抗原，衣殼內為核心結構，有核心抗原，核心抗原下面藏有e抗原。第8頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三乙型肝炎病毒HBV２.小球形顆粒，陽性血清中最多的顆粒，主要為表面抗原，不含核酸及ＤＮＡ成分，為不完整的ＨＢＶ．３.管形顆粒，實際上是一串小球形顆粒聚合在一起的，也含有表面抗原．第9頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三1.HBV形態(tài)結構大球形顆粒（Dane顆粒）小球形顆粒管形顆粒第10頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三HBVvirionTheinfectiousvirioniscalledtheDANEparticle.第11頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài)HBsAgHBcAgHBVDNADNAP（外膜蛋白）（核衣殼蛋白）第12頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三BothcomprisedofHBsAg第13頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三HBVnomenclatureHBV:hepatitisB

virusHBsAg:hepatitisBvirussurfaceantigenHBsAb:hepatitisBvirussurfaceantibodyHBcAg:hepatitisBviruscoreantigenHBcAb:hepatitisBviruscoreantibodyHBeAg:hepatitisBviruse

antigenHBeAb:hepatitisBviruse

antibody第14頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三抗原組成(一)--HBsAg位于病毒表面，是一種糖蛋白(曾用名：澳抗)出現(xiàn)時間：HBV感染后2～6個月（潛伏期）HBsAg有10個亞型，各亞型間存在不完全的交叉免疫。近年用亞型單克隆抗體研究表明，d和y、w和r決定簇可以同時存在于同一病毒抗原顆粒上，形成adwr、aywr、adyw和adyr復合亞型。第15頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三其機制為①不同亞型病毒的雙重感染；②單一亞型病毒感染后，有的HBV-DNA發(fā)生點突變。臨床表現(xiàn)病情反復，肝臟損害較重，因而有的HBV感染者血清中同時HBsAg陽性、抗-HBs陽性。4種亞型(adr,adw,ayr,ayw)。刺激機體產生保護性抗體即抗-HBs.第16頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三

HBsAg血清中HBsAg陽性是HBV感染的標志。本身具有抗原性，無傳染性。但由于HBsAg常與HBV同時存在，故認為是傳染性標志之一。但須注意，HBV-DNA可自X基因區(qū)終點起逆向與肝細胞發(fā)生整合，整合后的S基因表達較強，不斷產生HBsAg，整合的HBcAg基因組被抑制，不表達HBeAg、HBcAg，在這種情況下，即使HBV已從體內清除，而HBsAg仍可持續(xù)陽性，從理論上講，這種HBsAg陽性血液并無傳染性。第17頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三急性HBV感染后，血清中首先出現(xiàn)HBsAg，整個急性期均可陽性，至恢復期可滴度下降或轉陰。如HBsAg持續(xù)陽性半年以上，稱為慢性HBsAg攜帶者（無癥狀HBsAg攜帶者），可持續(xù)陽性達數(shù)年。一般認為HBsAg滴度與病變程度不成比例。肝功能正常，HBsAg滴度高，肝臟可重要病變，若HBsAg陰性及DNAp陰性，表示無重要傳染性。反之，肝功能異常，HBsAg滴度不高，肝臟可有明顯病變，如有部分肝硬化、肝癌患者呈HBsAg陰性或低滴度。無癥狀HBsAg攜帶者或慢性活動性乙型肝炎均可有相同的HBsAg滴度變化不能代表病情的輕重，因此分解此不能將HBsAg滴度的變化作為判斷病情輕重和藥物治療效的指標。

第18頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三用免疫電鏡及免疫熒光法在肝細胞漿內證實有HBsAg,而血清中HBsAg陰性，其機制尚無確切解釋。已知原因之一是現(xiàn)用的RIA檢測法，其測試靈敏度為10-5,尚不能測出最低感染量(10-7)，因此有10%假陰性，故對HBsAg的判斷，以陽性有診斷意義，陰性不能排除HBV感染。近年發(fā)現(xiàn)血清中HBV標志均陰性，而在白細胞或肝細胞內檢出HBV-DNA，說明確定或除外HBV感染不能單憑HBsAg是否陽性，應與其他標志結合判斷。第19頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三HBsAg持續(xù)時間●急性自限性肝炎：血中HbsAg大多可持續(xù)1-6周，最長可達6個月內可消失●慢性肝炎或慢性HBsAg攜帶者：可持續(xù)陽性。第20頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三抗原組成(二)--HBcAgHBcAg為HBC復制指標.位于Dane顆粒核心部分和肝細胞核內，在血清中不易檢出游離的HBcAg主要成分是蛋白質刺激機體產生抗-HBc(非保護性抗體)存在于受感染的肝細胞核內，有很強的免疫原性，在乙肝急性期、恢復期和HBsAg攜帶者中?？蓹z出抗-HBc。除非HBVC基因序列出現(xiàn)極少數(shù)變異或感染者有免疫缺陷?？?HBcIgM陽性提示急性期或慢性感染急性發(fā)作，抗HBcIgG出現(xiàn)較遲，但可保持多年或者終生。第21頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三（抗-HBs●出現(xiàn)時間：急性感染后期或HBsAg轉陰后（數(shù)月才能檢測出）.6-12月內逐步上升至高峰，可持續(xù)多年，但滴度會逐漸下降?！窨?HBs為保護性抗體（中和抗體）其出現(xiàn)標志著HBV感染進入恢復期●-HBs對相同HBsAg亞型的HBV再感染有免疫力，但對不同亞型的HBV保護力不完全。第22頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三抗原組成(三)--HBeAg位于HBV的核心,是一種可溶性蛋白抗原HBeAg和Dane顆粒出現(xiàn)相平行，且與DNA多聚酶在血中的消長動態(tài)相符合血中HBeAg的出現(xiàn)可作為HBV復制及血清有感染性的指標.急性HBV感染時HBeAg的出現(xiàn)時間略晚于HBsAg，在病變極期后消失，如果HbeAg持續(xù)存在預示趨向慢性。大部分情況持續(xù)存在表示患者處于高感染低應答期。刺激機體產生抗-HBe。轉換過程意味著由免疫耐受轉換為免疫激活，此時常有病變活動的激化。抗-HBe能與受染肝細胞表面的e抗原結合,通過補體介導破壞受染的肝細胞,抗-HBe的出現(xiàn)是預后良好的征象?？笻Be陽轉后，病毒復制處于靜止狀態(tài)，傳染性降低。部分病人仍有病毒復制，肝炎活動，稱為HBeAg陰性慢性肝炎。第23頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三HBVDNA是病毒復制和有傳染性最直接的證據(jù)檢測方法：斑點雜交法、PCR法近年用多聚酶鏈反應（PCR）這一體外DNA擴增技術，使靈敏度提高100倍以上（10FGfg/ml），可測出極微量的病毒。HBV-DNA-p是HBV核心所具有的DNA-p，在病毒復制過程中起逆轉酶作用。DNA-p活性是表示HBV復缺點活力的重要指標。HBV-DNA及DNA-p檢測有助于判斷HBV感染者病毒復制程度及傳染性大小，較靈敏評價抗病毒藥物的療效。

乙肝第24頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三抗原組成(四)--Pre-S抗原位于HBV的外衣殼上，有兩種刺激機體產生抗Pre-S1和抗Pre-S2，能阻斷HBV與肝細胞受體結合，從而起到抵抗病毒的作用抗Pre-S1和抗Pre-S2的出現(xiàn)，表示病情好轉，趨向痊愈第25頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三傳染源患者潛伏期急性期慢性期無癥狀HBsAg攜帶者第26頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三

高中等低/不能檢出血液精液尿血清陰道分泌物糞便傷口滲出物唾液汗液淚液乳汁各種體液中HBV的濃度第27頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三血源性傳播輸血、注射、外科和牙科手術、針刺等剃刀、牙刷和蚊蟲叮咬等母嬰垂直傳播宮內傳播分娩時微小皮損處傳播產后母嬰密切接觸性傳播HBV傳播途徑第28頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三第29頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三病原學診斷(一)--抗原抗體檢測項目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBcIgM方法ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay，最常用，定性)發(fā)光免疫分析(定量)反相間接血凝試驗(少用)第30頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三ELISA的基本原理利用抗原和抗體特異性結合主要的試劑固相抗原或抗體酶標記的抗原或抗體酶的底物第31頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三ELISA的主要方法間接法:測定抗-HBs夾心法：測定HBsAg和HBeAg競爭法：測定抗-HBc中和法：測定抗-HBe捕捉法：測定抗-HBcIgM第32頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三病原學診斷(二)—核酸檢測核酸雜交探針PCR引物第33頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三各項HBV血清標志物的解釋HBsAg–HBV感染的標志,可能是急性或慢性Anti-HBs–既往感染自然免疫/接種疫苗產生Anti-HBcIgM–急性HBV感染標志Anti-HBcIgG–既往或慢性HBV感染HBeAg–病毒復制活躍，具有高度傳染性

Anti-HBe–慢性感染,病毒不再復制,低傳染性HBV-DNA–直接測定病毒復制狀態(tài)，比HBeAg更準確；臨床主要用于監(jiān)測治療反應第34頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三為什么要開展乙肝“兩對半”定量檢測乙型病毒性肝炎是世界性的傳染病，嚴重地威脅著人類的健康。我國是乙型病毒性肝炎高發(fā)病國家。據(jù)統(tǒng)計全世界無癥狀攜帶者（HBsAg攜帶者）超過2.8億，我國占1億以上，且多數(shù)無癥狀。所以乙肝的早期診斷對控制傳染源、降低發(fā)病率及疾病的治療均具有很重要的意義。酶標（ELISA）檢測始于20世紀80年代中期，它對乙肝“兩對半”定性測定在疾病的診斷，病情監(jiān)測，療效觀察起到了一定的作用，但酶標檢測HbsAg靈敏度較低，不能真正意義上定量測定血清中HbsAg含量。隨著臨床醫(yī)學的發(fā)展，定性檢測已經遠遠不能滿足臨床及患者的要求?；瘜W發(fā)光免疫分析定量測定乙肝“兩對半”大大彌補了酶標定性測定及靈敏度低的不足。第35頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三血清學檢測的臨床意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義

急性或慢性感染(大三陽)+-+-++++乙肝后期或慢性感染(小三陽)--++---潛伏期或急性乙肝早期--+++痊愈或恢復期,有免疫力-----+++--痊愈,有免疫力疫苗接種或曾經感染過,有免疫力第36頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三血清學檢測的臨床意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義血清學檢測的臨床意義血清學檢測的臨床意義

急性或慢性感染(傳染性弱)+---+-++急性乙肝恢復期或既往感染------+急性窗口期或既往感染康復期-----未感染過HBV++--+++--+急性感染趨向恢復;慢性攜帶者HBV感染已恢復,有免疫力第37頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三SymptomsHBeAganti-HBeTotalanti-HBcIgManti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100AcuteHBVInfectionwithRecoveryTypicalSerologicCourseWeeksafterExposureTitre第38頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三IgManti-HBcTotalanti-HBcHBsAgAcute(6months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0481216202428323652YearsWeeksafterExposureTitreProgressiontoChronicHBVInfectionTypicalSerologicCourse小結第39頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三乙肝五項檢測的影響因素1.樣本采集與處理的影響

1.1標本嚴溶血及混有紅細胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內不易洗凈，殘留在孔內的血紅蛋白具有過氧化物酶樣的活性，催化底物顯色造成假陽性，嚴重溶血標本禁用。

1.2塑料試管能吸附抗原物質，樣本久置在塑料管內會使樣本內抗原含量下降造成假陰性。最好使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會增加OD值，可能與高濃度肝素具有強大的負電荷能吸附酶標記物不易洗脫有關；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性。

1.3標本凝固不全，正常血液采集后1/2~2h開始凝固，18~24h血塊完全收縮。在工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果；因此血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽?/p>

第40頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三乙肝五項檢測的影響因素2、試劑的影響

2.1乙肝兩對半試劑廠家較多；不同廠家出產的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，有資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%—99.3%,78~89%存在較大差異。有的廠家酶標板孔間A值差大于15%；標記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定比較差。使用質劣的試劑必然導致結果的假陽性或假陰性。因此。選擇高質量的試劑是保證結果準確的關鍵之一。

2.2不同方法學的檢測試劑，會使兩對半結果出現(xiàn)一些不同。例如：在實際工作中常用ELISA檢測HBsAg結果為陰性，而電化學發(fā)光檢測為陽性。除方法學的靈敏度外；還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對變異抗原或亞型乙肝標志物檢測存在差異，建議試劑廠家對劑的制備應該考慮亞型及型濃度的問題。

第41頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三乙肝五項檢測的影響因素3、干擾物質的影響

有人認為大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質，可以不同程度影響檢測結果；常見的干擾物質有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導的抗鼠Ig抗體、交叉反應物質和其它物質等。如RF因子可與標記二抗的FC段法結合造成假陽性，補體從C1q活化，使一抗和酶標二抗的抗體分子發(fā)生變構，F(xiàn)c的C1q分子結合點暴露出來，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用56℃30分鐘滅活補體可降低假陽性率，高濃度的AFP（如孕婦），在儲存過程中可能形成二聚體會導致本底過深影響檢測結果。

第42頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三乙肝五項檢測的影響因素4、藥物的影響

4.1高效價的乙肝免疫球蛋白會與HBsAg形成復合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測會呈陰性反應，導致乙肝兩對半少見模式的出現(xiàn)，如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時，在孕第8、9、10月常規(guī)注射乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出；而且其所生產的生新兒也常出現(xiàn)HBsAg陰性，HBeAg陽性和HBcAb陽性等少見模式、可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體能通過胎盤進入胎兒體內與胎兒血液中的HBsAg結合形成復合物；則新生兒HBsAg檢測呈陰性；用0.5ML的鹽酸處理標本1小時可提高出率。

4.2為預防乙肝，部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的1—2周內，血清中可檢出HBsAg成份，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能夠把它檢出；如電化學發(fā)光法，建議接種乙肝疫苗后1個月內不應作HBsAg檢測。

第43頁，講稿共49頁，2023年5月2日，星期三乙肝DNA檢測的臨床意義HBV-DNA稱為乙肝病毒脫氧核糖核酸。乙肝病毒是一種部分雙鏈DNA病毒，也就是說它的遺傳物質是DNA，它載有病毒所有遺傳信息，乙肝病毒靠它才可以復制、增殖、繁衍后代。研究證明，乙肝病毒的裸DNA(沒有蛋白質包裹DNA)就有感染性，完成對宿主的侵襲，造成宿主體內出現(xiàn)完整的乙肝病毒顆粒。也就是說HBV-DNA相當于完整的乙肝病毒顆粒。因此，檢測HBV-DNA是判斷乙肝病毒有無復制的“金指標”。DNA的檢測的目的主要是判斷目前患者病毒復制程度的大小，也是傳染性大小，尤其在判斷乙肝的轉歸，以及用藥前后的療效的判斷有很重要的作用，也是重要的用藥指征之一，尤其