現(xiàn)代生物技術(shù)導(dǎo)論-發(fā)酵工程

第九講發(fā)酵工程發(fā)酵工程及特點(diǎn)古老的新技術(shù):發(fā)酵技術(shù)發(fā)展歷程發(fā)酵原理:人類如何利用微生物發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn):現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)發(fā)酵工程及特點(diǎn)發(fā)酵的概念發(fā)酵工程的特點(diǎn)發(fā)酵的概念

發(fā)酵(Fermentation)英文來(lái)自拉丁語(yǔ)ferver,意思是“發(fā)泡”.描述果汁或谷物發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生CO2的現(xiàn)象.實(shí)際上,在后來(lái)的啤酒果酒生產(chǎn)中,起泡現(xiàn)象一直作為重要的直觀指標(biāo).發(fā)酵的概念

巴斯德認(rèn)為:發(fā)酵是酵母在無(wú)氧狀態(tài)下的呼吸過(guò)程,是生物獲得能量的一種形式.發(fā)酵的概念

現(xiàn)代發(fā)酵定義:利用微生物在有氧或無(wú)氧條件下的生命活動(dòng)來(lái)制造產(chǎn)品的過(guò)程.葡萄糖代謝

三羧酸循環(huán)

發(fā)酵的特點(diǎn)微生物的共性發(fā)酵工程的特點(diǎn)微生物的共性體積小,面積大吸收多,轉(zhuǎn)化快生長(zhǎng)旺,繁殖快適應(yīng)強(qiáng),易變異分布廣,種類多PetriDiskCultivationofaPureStrain發(fā)酵工程的特點(diǎn)

反應(yīng)條件溫和:常溫常壓原料來(lái)源廣泛并無(wú)需精制眾多反應(yīng)都在同一發(fā)酵罐內(nèi)完成發(fā)酵技術(shù)發(fā)展歷程

古代發(fā)酵近代發(fā)酵現(xiàn)代發(fā)酵古代發(fā)酵距今8000至4500年前開(kāi)始(中國(guó)),距今4000至3000年前開(kāi)始(外國(guó))特點(diǎn)只知現(xiàn)象,不知本質(zhì)產(chǎn)品米酒啤酒近代發(fā)酵—純培養(yǎng)技術(shù)的建立巴斯德(LouisPasteur,1822-1895)于1857年發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵是由微生物引起的,從而使傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)發(fā)酵變成了一門科學(xué).巴斯德發(fā)明的消毒器現(xiàn)代化工廠仍采用巴氏消毒法巴斯德消毒法：60～65℃作短時(shí)間加熱處理，殺死有害微生物人們心中的巴斯德免疫學(xué)——預(yù)防接種首次制成狂犬疫苗近代發(fā)酵—純培養(yǎng)技術(shù)的建立布雷費(fèi)爾德(Brefeld)于1872年創(chuàng)立了霉菌純培養(yǎng)技術(shù).丹麥科學(xué)家漢遜(Hansen)1878年創(chuàng)立了酵母純培養(yǎng)技術(shù)德國(guó)科學(xué)家科赫(RobertKoch,1843-1910)于1881年創(chuàng)立了細(xì)菌純培養(yǎng)技術(shù).德國(guó)人柯赫（RobertKoch）（1843～1910）近代發(fā)酵—純培養(yǎng)技術(shù)的建立上述技術(shù)突破,人們可以控制發(fā)酵進(jìn)程,從而使發(fā)酵技術(shù)從天然發(fā)酵走向純種發(fā)酵.完成了發(fā)酵技術(shù)的第一次轉(zhuǎn)折.主要產(chǎn)品:酒精甘油丙酮-丁醇現(xiàn)代發(fā)酵通氣攪拌發(fā)酵

代謝控制發(fā)酵

基因工程菌發(fā)酵

通氣攪拌發(fā)酵

英國(guó)科學(xué)家弗萊明(A.Fleming),1929年發(fā)現(xiàn)了青霉素英國(guó)科學(xué)家弗洛里(Haward.Flory)和錢恩(E.B.Chain)精制分離出青霉素(1940年)第二次世界大戰(zhàn)對(duì)青霉素的急切需求推動(dòng)了工業(yè)化生產(chǎn)(1944年)技術(shù)關(guān)鍵無(wú)菌空氣制備,通風(fēng)攪拌發(fā)酵代表產(chǎn)品青霉素意義：完成了發(fā)酵技術(shù)的第二次技術(shù)轉(zhuǎn)折代謝控制發(fā)酵代謝控制發(fā)酵1959年木下祝郎發(fā)明了用微生物發(fā)酵發(fā)生產(chǎn)谷氨酸.味精的分子式為:HOOC-(CH2)2CHNH2COONa.H2O技術(shù)特點(diǎn)從DNA分子水平上控制(無(wú)定向誘變)微生物代謝途徑,進(jìn)行最合理代謝.該技術(shù)的發(fā)展完成了發(fā)酵技術(shù)的第三次轉(zhuǎn)折.代表產(chǎn)品:氨基酸核苷酸等基因工程菌發(fā)酵1970S以來(lái)基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展,為發(fā)酵工程技術(shù)插上了騰飛的翅膀,人們可以定向改變生物的性狀和功能,創(chuàng)造新的“物種”,是發(fā)酵工業(yè)能夠生產(chǎn)出超出自然界微生物所不能合成的產(chǎn)物.技術(shù)特點(diǎn):可定向改造生物基因,按人們的意志生產(chǎn)產(chǎn)品.意義:將引起發(fā)酵工程的技術(shù)革命.產(chǎn)品:人生長(zhǎng)素,干擾素,疫苗發(fā)酵工程是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)和關(guān)鍵技術(shù)，是生物技術(shù)四大支柱產(chǎn)業(yè)化的核心，無(wú)論傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，如抗生素、氨基酸等，還是現(xiàn)代基因工程產(chǎn)品，如疫苗、人體蛋白質(zhì)等，都需要發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。發(fā)酵工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的地位和作用發(fā)酵原理與機(jī)制黃色短桿菌賴氨酸的合成與調(diào)節(jié)機(jī)制細(xì)胞膜通透性的改造發(fā)酵中如何控制關(guān)鍵條件回憶一個(gè)概念反饋抑制:代謝途徑的末端產(chǎn)物(即終產(chǎn)物)過(guò)量時(shí),這個(gè)產(chǎn)物反過(guò)來(lái)直接抑制該途徑第一個(gè)酶的活性,使整個(gè)反應(yīng)過(guò)程減慢或停止.反饋抑制

協(xié)同反饋抑制分支代謝途徑中的幾個(gè)末端產(chǎn)物同時(shí)過(guò)量時(shí)才能抑制共同途徑中的第一個(gè)酶的一種反饋調(diào)節(jié)方式.單獨(dú)一種產(chǎn)物過(guò)量并不能引起抑制作用.協(xié)同反饋抑制黃色短桿菌生物合成Lys調(diào)節(jié)機(jī)制黃色短桿菌生物合成Lys調(diào)節(jié)機(jī)制酶3活性比酶2高15倍,代謝優(yōu)先生成高絲氨酸酶4活性比高絲氨酸激酶高,代謝優(yōu)先向蛋氨酸方向進(jìn)行蛋氨酸過(guò)量反饋?zhàn)瓒裘?,3的合成異亮氨酸過(guò)量反饋抑制酶5的活性蘇氨酸過(guò)量反饋抑制酶3的活性,并且與過(guò)量賴氨酸協(xié)同抑制酶1的活性積累賴氨酸的菌株特性通過(guò)基因突變使酶3失去活性,切斷向蘇氨酸方向的代謝流在培養(yǎng)液中加入限制量的高絲氨酸(或蘇氨酸和蛋氨酸)細(xì)胞膜通透性的改造用能積累谷氨酸菌株做如下實(shí)驗(yàn):生物素充足時(shí),細(xì)胞內(nèi)含大量谷氨酸,但培養(yǎng)液里幾乎不含谷氨酸.用溶菌酶消化細(xì)胞壁得到的原生質(zhì)體仍不分泌谷氨酸.當(dāng)把原生質(zhì)體放入低滲溶液里,將其漲破,谷氨酸才排出.生物素亞適量時(shí),培養(yǎng)液里含大量谷氨酸,細(xì)胞里含量少.結(jié)論

谷氨酸的分泌是由細(xì)胞膜控制細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)怎樣?磷脂分子形成細(xì)胞膜磷脂分子結(jié)構(gòu)式生物素缺陷型可分泌谷氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型:微生物因突變不能合成某種必需生長(zhǎng)因子,需外加該因子才能生長(zhǎng)的菌株.如高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型.

生物素是脂肪酸合成最初反應(yīng)關(guān)鍵酶的輔酶,生物素缺陷型菌株不能合成生物素,通過(guò)控制生物素亞適量,使磷脂合成不完全而導(dǎo)致細(xì)胞膜滲漏.從而使谷氨酸分泌到細(xì)胞外發(fā)酵工程關(guān)鍵技術(shù)生物反應(yīng)器：

機(jī)械攪拌式

氣升式 過(guò)程參數(shù)檢測(cè)（實(shí)時(shí)在線與離線）：

pH，溶氧，溫度，攪拌

菌體，產(chǎn)物，底物，RQ(呼吸商)等發(fā)酵過(guò)程控制：

pH，溶氧，溫度，底物流加等發(fā)酵工藝發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工藝主要組成部分微生物生長(zhǎng)得數(shù)學(xué)模型發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工藝組成部分培養(yǎng)基制備↓“種子”培養(yǎng)→發(fā)酵罐→產(chǎn)物的提取精制↑無(wú)菌空氣微生物的營(yíng)養(yǎng)元素水平:CHONPSClK…化合物水平

C:糖,脂,有機(jī)酸,醇,烴等

N:氨基酸,蛋白質(zhì),尿素等

O:溶解氧

P,S,Cl,K等:主要來(lái)自含該元素的無(wú)機(jī)鹽.原料水平C:葡萄糖,蔗糖,淀粉,糖蜜,天然氣,乙酸,乙醇及氨基酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)等.N:各種氨基酸,蛋白胨,酵母粉,魚粉,豆餅粉,麥皮,尿素,硝酸胺等.O:空氣或氧氣等.P,S,Cl,K等:K2HPO4,KH2PO4,NH4Cl,MgSO4.好氧發(fā)酵的氧為何如此重要

氧是一種難溶氣體，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，空氣中的氧在純水中的溶解度為0.25mol/m3左右。對(duì)于菌體濃度為1015個(gè)/m3的發(fā)酵液，假定每個(gè)菌體的體積為10-16m3（直徑為5.8μ），細(xì)胞呼吸強(qiáng)度為2.6*10-3molO2/(kg干細(xì)胞.s)，菌體密度為1000kg/m3，含水量為80%，則每立方米發(fā)酵液的需氧量為:

2.6×10-3×10-16×1015×1000×0.2=0.052molO2/m3S=187.2molO2/m3h

在1小時(shí)里菌體的需氧量是溶解量的750倍。因此，溶解氧的供給常常是好氧發(fā)酵的限制性因素。微生物生長(zhǎng)的化學(xué)計(jì)量

對(duì)產(chǎn)黃青霉以葡萄糖和NH3為原料進(jìn)行通氣培養(yǎng)，經(jīng)測(cè)得菌體的元素組成為CH1.92O0.61N0.16，只與菌體生長(zhǎng)有關(guān)的葡萄糖消耗轉(zhuǎn)化系數(shù)為Y=88。6g菌體/mol葡萄糖.菌體生長(zhǎng)原料消耗的計(jì)量關(guān)系。C6H12O6+NH3+O2→CH1.92O0.61N0.16+CO2+H2O求出1摩爾C對(duì)應(yīng)菌體所含元素總摩爾數(shù)(相當(dāng)于分子量)為12+1×1.92+16×0.61+14×0.16=25.92Y=88.6g菌體/mol葡萄糖=3.42mol菌體/mol葡萄糖然后按順序配平C,N,H,OC6H12O6+0.55NH3+2.39O2→3.42CH1.92O0.61N0.16+2.58CO2+3.54H2O微生物生長(zhǎng)的數(shù)學(xué)模型假設(shè)發(fā)酵微生物是細(xì)菌(分裂方式為一分為二),發(fā)酵剛開(kāi)始細(xì)胞濃度為X0,在一小時(shí)內(nèi)有部分細(xì)胞分裂.設(shè)分裂細(xì)胞的分率為μ,1h分裂的細(xì)胞數(shù)為μX0.經(jīng)1小時(shí)后細(xì)胞的濃度為X1:X1=μX0+X0=X0(1+μ)經(jīng)2小時(shí)后細(xì)胞的濃度為X2:X2=X1(1+μ)=X0(1+μ)2經(jīng)t小時(shí)后細(xì)胞的濃度為Xt:Xt=X0(1+μ)t我們把一小時(shí)分成ξ個(gè)無(wú)窮小的單位時(shí)間,則在一個(gè)無(wú)窮小的時(shí)間單位內(nèi)分裂的細(xì)胞的分率為ε=μ/ξ,并且有:X1’=X0(1+ε)X2’=X1’(1+ε)=X0(1+ε)2X1=X0(1+ε)ξ→(1+ε)ξ=(1+μ)Xt=X0(1+ε)ξt=X0((1+ε)1/ε)μtLim(1+ε)1/ε=eε→0Xt=X0eμtdX/dt=X0deμt/dt=μX0eμt=μX實(shí)際生長(zhǎng)比速dX/Xdt=μ-kX解上述微分方程，設(shè)U=1/X得dU/dt+μ

U=k求解得1/X=Ae-μt+k/μ邊界條件t=0,X=X0解得X=k/μ/(1+((k/μ-X0)/X0)e-μt)發(fā)酵設(shè)備及檢測(cè)控制系統(tǒng)

B|Braun公司發(fā)酵罐：Biostat系列參數(shù)檢測(cè)多級(jí)控制：

人工

DCU

MFCSBiostatB2BiostatED10BiostatBPilotBiostatUD50DCU數(shù)字式控制單元MFCSFermentorDisplay現(xiàn)代發(fā)酵工程規(guī)模低值工業(yè)品大型化

以規(guī)模來(lái)取勝（幾十?dāng)?shù)百噸）。如味精、氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、飼料、食品工業(yè)用產(chǎn)品等；高價(jià)值轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品小型化（幾十?dāng)?shù)百升）。基因工程大腸桿菌、酵母菌高密度培養(yǎng)；動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞培養(yǎng)；研究中心智能化、全能性?，F(xiàn)代發(fā)酵工程

對(duì)工藝控制的需要規(guī)模生產(chǎn)

必要的檢測(cè)手段

準(zhǔn)確的執(zhí)行成熟的工藝控制策略實(shí)驗(yàn)室研究

完善的檢測(cè)手段

全能性的過(guò)程控制軟件 發(fā)酵過(guò)程工藝的

后續(xù)改進(jìn)研究青霉素（幾百倍的提高）菌種改造要求新工藝市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)要求成本降低新的工藝控制策略

以高密度培養(yǎng)為例

Gln目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)谷氨酰胺的專業(yè)廠家只有3--4家，其生產(chǎn)能力低，而且采用的