臨床實驗室質(zhì)譜檢測原理介紹

臨床試驗室質(zhì)譜檢測原理簡介臨床試驗室質(zhì)譜檢測原理簡介臨床試驗室質(zhì)譜〔massspectrometry,MS〕技術(shù)在臨床試驗室中的應(yīng)用隨著MS的創(chuàng)不斷拓展。最早的MS承受扇形電場及磁場實現(xiàn)質(zhì)量分別,體積大、價格貴。隨著四極桿MS與色譜分別、第1代氣〔gaschromatographyGC〕〔liquidchromatography,LC〕技術(shù)的聯(lián)用,大大提升了MS技術(shù)的有用性。三重四極桿等多重MS技術(shù)的聯(lián)用與LCMS[1MS的不斷進展及軌道阱〔Orbitrap〕MS的誕生,LC-MS的聯(lián)用更是如虎添翼。GC/MS[2]及有機酸[3]進展檢測是MSMS〔inbornerrorofmetabolism,IEM〕后,其在臨床檢測中的應(yīng)用開頭加速[4LC-MS尤其是與串聯(lián)四極桿MS聯(lián)用時,能實現(xiàn)對小分子藥物及其代謝產(chǎn)物的量化檢測,促進了該領(lǐng)域儀器研發(fā)的進步[5]。治療藥物監(jiān)測與毒理學(xué)的快速進展在提升儀器靈敏度及有用性的同時,進一步擴大了MS技術(shù)的應(yīng)用范圍[6]。1儀器MSMS可對單個分子或分子片段進展質(zhì)量分析,要求被分析對象帶電荷并呈氣相,一般由嚴(yán)密相連的離子源、質(zhì)量分析器及檢測器3個局部組成。離子源外接樣品引入系統(tǒng),是離子生成的部位;多數(shù)MS的質(zhì)量分析器依據(jù)離子質(zhì)荷比〔mass-to-chargeratio,m/z〕區(qū)分別子;檢測器將離子分別轉(zhuǎn)換成信號并傳入儀器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)把握整個儀器。MS濃度檢測手段的校準(zhǔn)方法。僅當(dāng)某方法被作為參考方法且檢測嚴(yán)格依據(jù)書面程序進展時,可將液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜〔liquidchromatographytandem-massspectrometry,LC-MS/MS〕作為“金標(biāo)準(zhǔn)”。但由于MS系統(tǒng)簡潔、維持其周密度以獲得準(zhǔn)確的結(jié)果亦具有確定難度,MS技術(shù)常被視作“無其他方法可用時的最正確技術(shù)”。MS依據(jù)m/z[離子質(zhì)量〔相對原子質(zhì)量〕÷電荷數(shù)]分析被測物的質(zhì)量。例如,25D3400,當(dāng)參與1[〔400+1〕個質(zhì)子]而帶單電荷時,可在m/z401處被檢測到;當(dāng)參與2個質(zhì)子而帶雙電荷時[〔400+2〕個質(zhì)子,402/2=201],可在m/z201被檢測到。通常以m/z衡量準(zhǔn)確度,檢測越準(zhǔn)確則分子式鑒定力氣越強。仍以25-羥基維生素D3為例,其分子式為C27H44O2,分子離子經(jīng)質(zhì)子化后的相對原子質(zhì)量為401〔參與1個質(zhì)子形成C27H45O2〕,其準(zhǔn)確質(zhì)量保存至5位小數(shù),為401.34197C27H45O2〔25-羥基維生素D3,m/z401.34197〕C28H49O〔菜油甾醇,m/z401.37052〕之間的0.02855,但MS技術(shù)仍可通過m/z打算了質(zhì)量檢測結(jié)果所對應(yīng)的潛在分子式的數(shù)量。高區(qū)分質(zhì)譜儀〔highresolutionmassspectrometer,HRMS〕m/z。整體準(zhǔn)確性及有效位數(shù)層面的質(zhì)量檢測力氣是區(qū)分不同類型MS的標(biāo)準(zhǔn)之一。為提升整體準(zhǔn)確性,MS常承受四極桿作為質(zhì)量過濾器。四極4根桿組成,以相對的21組,通過在2MS都可供給準(zhǔn)確的質(zhì)量信息,如檢測加速離子飛行時間的飛行時間〔timeofflight,TOF〕MS[7,8],檢測捕獲離子振蕩頻率的——利用磁場捕獲離子的傅里葉變換質(zhì)譜〔Fouriertransformmassspectrometer,FTMS〕與通過經(jīng)典吸引MS[9,10,11]。多重MS技術(shù)的聯(lián)用令MS能夠在離子水平上同時進展多項臨床試驗。由3個嚴(yán)密聯(lián)系的四極桿組成的三重四極桿較為常用,其常見的工作模式見圖1[12生成的全部離子的信號,Q1Q3同時進展掃描,Q2、不含碰撞氣體,見圖1〔a〕;產(chǎn)物離子掃描可對不同質(zhì)量的分子進展定量檢測,Q1設(shè)置為僅特定m/z的離子可通過,Q2中充入碰撞氣體令離子碎片化,Q3對片段產(chǎn)物進展掃描,見圖1〔b〕;母離子掃描可用于確定一類待測物中的全部母離子,識別共同碎片并觀看產(chǎn)生該碎片的全部母離子,由Q1進展掃描,在Q2Q3m/z模式可檢測單個樣品中全部糖基化類型,見圖1〔c〕;與母離子掃描相近的是Q1與Q32中充入碰撞氣體進展離子片段化處理,可通過觀看m/z為〔相當(dāng)于水處的中性喪失狀況來識別全部含羥基的離子,見圖1〔d〕;選擇反響監(jiān)測〔selectedreactionmonitoring,SRM〕為一種三重四極桿常用的模式,可用于定量分析,Q1Q3用于質(zhì)量分析,Q2通過碰撞氣體進展碎片化反響,見圖1〔e〕SRM〔multiplereactionmonitoring,MRM〕,MRMSRM為根底,利用數(shù)據(jù)把握系統(tǒng)循序選擇多重反響類別。當(dāng)MS連接色譜分別入口時,該模式尤顯重要。多重母子離子對即母離子與碎片離子的組合,可在特定時間內(nèi)對色譜洗脫出的特定待測物進展監(jiān)測。如承受化學(xué)性質(zhì)與待測物一樣的同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品,則標(biāo)準(zhǔn)品與待測物的母子離子對同樣可通過MRM進展監(jiān)測。各母子離子對的觀看時間短且與色譜層析圖譜峰寬相關(guān),可準(zhǔn)確測量峰面積并計算待測物濃度。SRMMRM的特異性大幅提升了試驗信噪比,提高了靈敏度。串聯(lián)四極桿可與周密質(zhì)量儀聯(lián)用,較常見的包括Qq-TOF、Qq-FTMS與Qq-Orbitrap[Q代表掃描四極桿,q代表碰撞〔碎片〕四極桿]。這類儀器可運行上述全部模式,其檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。離子化MS分析均以離子為根底,故待測物經(jīng)MS檢測前需進展離子化,是MS檢測的根本操作。MS承受過各類離子源,不斷推陳出,就像很多MSMSLC技術(shù),LC-MS式有3種：電噴霧電離〔electrosprayionization,ESI〕、大氣壓化學(xué)電離〔atmospheric-pressurechemicalionization,APCI〕及大氣壓光電離〔atmospheric-pressurephotoionizationAPPI〕〔1〕ESI最為常用,盡管工作機制尚未完全明確,但重要的是ESI過程始于對預(yù)制離子液的霧化[13]。液滴隨著溶劑分子的“揮發(fā)”而不斷收縮,直至庫侖爆炸令其碎片化。該過程持續(xù)至溶劑完全去除,留下帶電離子經(jīng)過錐孔〔大小需滿足維持分析過程中的真空需求〕進入MS。同軸氣流可關(guān)心霧化,附加氣流利于提升MS的有效檢測范圍。〔2〕APCI承受LC流出物氣流關(guān)心噴射技術(shù),通過電暈針放電令溶液分子產(chǎn)生活性成分,使待測物分子質(zhì)子化或去質(zhì)生成S分析所需的帶電物質(zhì)〔3I同樣承受氣流關(guān)心霧化,但通過紫外線光源對待測物直接電離,或?qū)饺雵婌F的助劑分子進展電離從而使APPI僅適用于含芳香基團的特定類型待測物,但其信噪比極佳,故分析靈敏度格外高。這3類離子化技術(shù)均可與其他類型流體色譜法聯(lián)用。ESI與APCI常產(chǎn)生質(zhì)子化分子離子,通過向待測物添加1個質(zhì)子〔H+〕來觀看帶正電荷的離子,或通過分子離子去質(zhì)子化〔去除H+〕來觀看APPI常通過喪失13類離子化技術(shù)均屬于“軟”電離技術(shù),主要產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子,通過檢測待測物中全部特定m/z的離子來提高其靈敏度。GC是與MS最早進展聯(lián)用的色譜技術(shù)[14,15],在臨床試驗室已有較豐富的應(yīng)用閱歷,但該技術(shù)如今已不LCGC/MS〔electronimpact,EI〕電離技術(shù),優(yōu)勢在于不同儀器所獲得的結(jié)果重復(fù)性較好,能供給大量信息,可外接數(shù)據(jù)庫APCI相像,GC離子化并反響生成可與待測物進一步反響的物質(zhì),經(jīng)質(zhì)子化或去質(zhì)子化形成帶正電荷的陽離子或帶負電荷的陰離子。這種離子化形式亦稱化學(xué)電離〔chemicalionization,CI〕,可削減化合物碎片質(zhì)量的差異,常用于測定未知物質(zhì)的相對分子質(zhì)量。并非MS技術(shù)分析的全部樣品都需要進展色譜分析?；|(zhì)關(guān)心激光解吸離子化技術(shù)〔matrix-assistedlaserdesorption/ionization,MALDI〕常用于蛋[16〔ultraviolet,UV〕的基質(zhì)溶劑混合,點樣于光滑金屬板上,枯燥后放入MS源,一旦到達適宜的UV激光照耀會令少量待測物自樣品中釋出,反響生成預(yù)形成離子或離子作為分析物進入MS。TOFMS電離呈脈沖性,常用于檢測。MALDIMS另一類已成功運用于固體樣品電離的技術(shù)統(tǒng)稱為解吸電離[17]。該技術(shù)通過ESI或APCI并離子化,隨后導(dǎo)入MS〔driedbloodspot,DBS〕[18MSMS聯(lián)合電感耦合等離子體〔inductivelycoupledplasma,ICP〕炬管可組成ICP-MS,能夠檢測金屬物質(zhì)。該電離法承受高溫〔~10000K〕氬氣等離子體氣流分裂樣品并電離。儀器可直接檢測樣品中的金屬物質(zhì),有效開展重金屬中毒篩查[19]或聯(lián)合色譜分析明確待測物類別,供給有關(guān)金屬物質(zhì)化學(xué)環(huán)境的信息[20]。目前臨床化學(xué)色譜分析中廣泛承受的電離技術(shù)見1。1臨床化學(xué)色譜分析常用電離技術(shù)的比較樣品導(dǎo)入正如MS檢測承受各類離子源一樣,樣品導(dǎo)入技術(shù)同樣也有很多種。其中一些基于分別關(guān)心混合物分析,其他則側(cè)重于主體樣品,局部具有成像功能。臨床化學(xué)最常用的2種色譜分析法為LCGC,SFC、凝膠電泳、CE和凝膠滲透色譜〔gelpermeationchromatography,GPC〕等較少被承受[21]。1MSSFC流淌相多承受加壓二氧化碳,常用于手性分子分別[22]。CE同凝膠電泳一樣利用電場進展分別,但在狹小的毛細管中進展[23GPC亦稱尺寸排阻色譜〔size-exclusionchromatography,SEC〕,常用于檢測較大生物分子,LC[24]。LC技術(shù)正處在儀器根本性的變革中。2023年美國Waters公司推出了超高效液相色譜〔ultra-performanceliquidchromatography,UPLC〕。該高效液相色譜〔high-performanceliquidchromatography,HPLC〕系統(tǒng)泵的最大工作壓力可達1000bar〔15000psi〕,較以往提升了2倍,令柱化學(xué)技術(shù)得以被承受,尤其對于較小粒徑的物質(zhì),反過來提高了色譜區(qū)分率或三維樣品成像。ICP可直接將樣品導(dǎo)入MS[25],也可通過連接LC加以實現(xiàn)[19]。LC-ICP-MS待測物類型、來源及用戶群體臨床MS檢測樣品的制備依據(jù)MS的分析類型、待測物、進樣系統(tǒng)及離子源而不同[26,27,28,29,30]。樣品類型與來源對樣品制備及預(yù)期的檢意義,該法承受可溶溶劑對樣品簡潔稀釋,常用于尿液檢測[31];另一種稍簡潔的樣品制備技術(shù)是蛋白沉淀,該法將溶劑參與血液樣品,令蛋白分散并沉淀,常通過離心加強這一過程,一般無法去除樣品中的基質(zhì)或脂質(zhì)干擾。液-液萃取是與既往技術(shù)相比具有確定優(yōu)勢的經(jīng)典樣品制備技術(shù),但難以實現(xiàn)自動化。固相萃取技術(shù)使用固化吸附劑吸附待測物,可徹底去除樣品中的基質(zhì)或脂質(zhì)干擾[32品的關(guān)鍵在于通過操作到達所需的樣品清潔度及充分的檢出限〔limitofdetection,LOD〕即可,超出檢測所需的制備操作會增加時間與本錢。常用LC-MS/MS2。2LC-MS/MSGC-MSGC分子不揮發(fā)或受熱降解,則在保證樣品干凈度的同時,還要進展衍生化處理令其揮發(fā)[33,34]。MALDI及其他未涉及色譜層析分別的技術(shù)承受不同的樣品制備方式。定量MALDI與LC-MS/MS相像,常承受同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)參與濃度樣品。在一樣溶劑中溶解樣品與基質(zhì)會帶來結(jié)晶、非必要沉淀等問題。微生物MS檢測要求樣品制備方式有較高的重復(fù)性,以便查閱。MALDI及其他成像技術(shù)則需維持樣品空間構(gòu)型[35]。ICP-MS需要排解受外部環(huán)境污染的可能[36],所以對樣品清潔度要求極高。2臨床試驗室開展MS試驗室自建檢測工程〔laboratorydevelopedtest,LDT〕標(biāo)準(zhǔn)化的缺乏LDTLDT檢測的方法相像,但仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的根底。盡管供給商正在著手開發(fā)囊括全部針對臨床試驗室對流淌相、校準(zhǔn)措施、質(zhì)控措施以其他檢測所需組件仍承受自行研發(fā)的方式。雖然在監(jiān)管、標(biāo)準(zhǔn)化及室間比對等方面已做了一些努力,但不同臨床試驗室間的檢測結(jié)果仍存在差異。缺少適宜的內(nèi)標(biāo)經(jīng)同位素標(biāo)記的“重”標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)格外普遍[38],其與待測物化學(xué)性質(zhì)完全一樣,但特定元素被較重的同位素所代替,如2H13C15N與18O代的元素數(shù)目各異,但待測物分子質(zhì)量的增加要求其可與標(biāo)準(zhǔn)品易于區(qū)分,所以有必要為每個待測物都設(shè)立特定標(biāo)記內(nèi)標(biāo),但在檢測多個待測物或仍缺乏與待測物接近,由于待測物洗出時存在干擾物質(zhì)會減弱MS信號,承受同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品可局部補償這類離子抑制效應(yīng)[39]。ESI最易受到離子抑制的影響,APCI與APPI色譜區(qū)分率自無活性的異構(gòu)體表睪酮中分別出睪酮是較為困難的[40],由于著對不同形式維生素D檢測需求的日益凸顯[41],色譜分別需進一步努力提高區(qū)分率。當(dāng)被測物質(zhì)量不同時可不承受色譜分別,色譜設(shè)備供給商已開頭通過柱化學(xué)提高區(qū)分率,但需對儀器進展更換,本錢較高。LCGC為確保GC的時間。樣品制備過程無法實現(xiàn)自動化樣品制備需基于樣品類型、待測物、分析方法、已有設(shè)備、操作人員技術(shù)水平、各批次樣品數(shù)量、樣品制備與儀器〔柱〕污染間的本錢/時間平衡,因此關(guān)于何為“最正確”樣品制備方法的意見尚未統(tǒng)一。血液、血漿與血清被視為最簡潔的樣品基質(zhì),需要最煩瑣的制備處理,常需要屢次蛋白沉淀與提取,而的樣品制備方法是實現(xiàn)穩(wěn)定可重復(fù)的定量分析的關(guān)鍵之一。自動化樣品制備雖然備受期盼,其在高通量檢測中的前景最為開闊,但前期開發(fā)耗時長且設(shè)備耗材費用昂揚。試驗室信息系統(tǒng)的限制處理帶有批次樣品結(jié)果的電子數(shù)據(jù)表并進展手工輸入是數(shù)據(jù)處理的限速步驟,質(zhì)控數(shù)據(jù)的回憶以及人工核對臨床樣品峰值。專業(yè)人員的短缺操作者是結(jié)果重復(fù)性及試驗室穩(wěn)定運行的關(guān)鍵。目前,美國的很多臨床試驗室都存在專業(yè)人員短缺的問題。臨床化學(xué)MS試驗室對人員技術(shù)水平的要求高于自動化試驗室,需同時具備手工樣品制備、色譜及儀器日常維護力氣。美國臨床化學(xué)學(xué)會〔AmericanAssociationforClinicalChemistry,AACC〕與分別分委會〔MassSpectrometryandSeparationSciencesDivision,MS3〕等組織正努力在這方面供給更多的培訓(xùn)時機。財務(wù)考量通常,MS及其相關(guān)設(shè)備的前期本錢昂揚,