動物組織和細(xì)胞培養(yǎng)

關(guān)于動物組織和細(xì)胞培養(yǎng)第1頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三一動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件無菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外燈，電熱干燥箱，高壓滅菌器，抗生素細(xì)胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，

CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細(xì)胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，微孔板震蕩器，高速離心機(jī)，移液器細(xì)胞保存條件：液氮罐實(shí)驗(yàn)室安全：生物實(shí)驗(yàn)室安全，P1,P2,P3實(shí)驗(yàn)室安全第一節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識第2頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三(一)無菌條件凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外燈，電熱干燥箱，高壓滅菌器，抗生素.第3頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三1凈化工作室

------我國藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn)-------潔凈度級別塵粒最大允許數(shù)/立方米塵粒最大允許數(shù)

≥0.5um

≥5um浮游菌/立方沉降菌/皿

100

3,500

0

5

1

10,000

350,000

2,000

100

3

100,000

3,500,000

20,000

500

10

300,000

10,500,000

60,000

NA

15第4頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三●風(fēng)淋室是生物潔凈室的理想配套設(shè)備，用于吹除進(jìn)入潔凈廠房的人、物表面附著的塵埃●是進(jìn)行人身、物料凈化和防止室外空氣侵入潔凈區(qū)的有效設(shè)備●風(fēng)淋室可以配合加熱器，冬天可以加熱，溫度可調(diào)，一般控制溫度在30-35℃較為適宜。

2風(fēng)淋室:

第5頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三

該裝置是一種潔凈室的輔助設(shè)備，主要用于潔凈區(qū)與潔凈區(qū)，潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開門次數(shù)，把對潔凈區(qū)的污染降低到最低程度。

3傳遞窗:

第6頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三●高效過濾器是用超細(xì)玻璃纖維紙作濾料，膠板紙作分隔板，可與鋁合金框、木框及鍍鋅鋼板框組合而成。

●特點(diǎn)：具有低阻高效、輕質(zhì)、容塵量大等特點(diǎn)，●適用于常溫常壓常濕條件下環(huán)境空氣的凈化.4高效過濾器:第7頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三

層流罩是可提供局部高潔凈環(huán)境的空氣凈化設(shè)備。潔凈層流罩是將空氣經(jīng)風(fēng)機(jī)以一定的風(fēng)壓通過高效空氣過濾器后，使?jié)崈艨諝獬蚀怪睔饬魉腿牍ぷ鲄^(qū)，從而保證了工作區(qū)內(nèi)達(dá)到工藝所需的高潔凈度。5潔凈層流罩:第8頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三6超凈工作臺

超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

第9頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三

一種既能使操作造成無菌、無塵的局部空氣環(huán)境，保證檢驗(yàn)、檢測不受污染，又能保證被研究的對象（如病菌、細(xì)菌等）不外溢，保護(hù)周圍環(huán)境及操作人員的安全隔離設(shè)備。

該設(shè)備可廣泛應(yīng)用于低、中等危險(xiǎn)度的臨床細(xì)菌學(xué)，病毒學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、生物學(xué)及生命科學(xué)的研究，加工、檢驗(yàn)部門。

7生物安全柜:

第10頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三8紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒。

9電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒。10蔡氏（Zeiss）濾器：過濾除菌，濾器中的濾膜一般用0.2～0.3μm孔徑的微孔濾膜。凡在高溫或射線下易發(fā)生變性或失去功能的物質(zhì)，如人工合成培養(yǎng)液、血清、消化用胰酶等都須用濾器過濾除菌。第11頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三濾器大容量高壓滅菌器第12頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三(二)細(xì)胞生長條件純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清第13頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三1自動雙重純水蒸餾器2純水儀反滲透

精濾、活性碳吸附

第14頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三3標(biāo)準(zhǔn)型細(xì)胞培養(yǎng)板（TissueCulturePlates）

6孔，12孔，24孔，48孔，96孔

第15頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三4培養(yǎng)瓶第16頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三5CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱主要由箱體結(jié)構(gòu)件、溫度控制系統(tǒng)和CO2濃度控制系統(tǒng)三部分組成。CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。再現(xiàn)活體環(huán)境對于溫度、PH值CO2濃度、氧分壓（O2濃度）、相對濕度等細(xì)胞生長關(guān)鍵的因素，

第17頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三6移液器第18頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三(三)細(xì)胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，微孔板震蕩器，高速離心機(jī)，移液器第19頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三15用于微生物、細(xì)胞、細(xì)菌、組織培養(yǎng)、懸浮體、沉淀物等的觀察，并可將此過程中的任一形態(tài)拍攝下來。第20頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三酶標(biāo)儀微孔板震蕩器23通過自動酶標(biāo)儀計(jì)數(shù)來檢測活細(xì)胞數(shù)量。主要用于酶標(biāo)板、細(xì)胞培養(yǎng)板(如6孔板、12孔板、24孔板、48孔、96孔板等)等溶液的混勻或細(xì)胞的混勻。

第21頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三(四)細(xì)胞保存條件：液氮罐-196℃

第22頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三(五)實(shí)驗(yàn)室安全：生物實(shí)驗(yàn)室安全，P1,P2,P3實(shí)驗(yàn)室安全第23頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三實(shí)驗(yàn)室安全層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則一級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室二級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室三級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室四級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室第24頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室的總體要求：經(jīng)濟(jì)、有序、高效、安全。初步制定相關(guān)制度如下：局部小環(huán)境空氣達(dá)到潔凈度等級

層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則

第25頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三一級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對健康成年人已知無致病作用的微生物，如用于教學(xué)的普通微生物實(shí)驗(yàn)室等。實(shí)驗(yàn)室安全級別第26頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三二級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物。第27頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三二級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

1可能產(chǎn)生致病微生物氣溶膠或出現(xiàn)濺出的操作均應(yīng)在生物安全柜(Ⅱ級生物安全柜為宜)或其他物理抑制設(shè)備中進(jìn)行，并使用個體防護(hù)設(shè)備。

2處理高濃度或大容量感染性材料均必須在生物安全柜(Ⅱ級生物安全柜為宜)或其他物理抑制設(shè)備中進(jìn)行，并使用個體防護(hù)設(shè)備。

上述材料的離心操作如果使用密封的離心機(jī)轉(zhuǎn)子或安全離心杯，且它們只在生物安全柜中開閉和裝載感染性材料，則可在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

3當(dāng)微生物的操作不可能在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行而必須采取外部操作時，為防止感染性材料濺出或霧化危害，必須使用面部保護(hù)裝置(護(hù)目鏡、面罩、個體呼吸保護(hù)用品或其他防濺出保護(hù)設(shè)備)。

4在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)穿著工作服或罩衫等防護(hù)服。離開實(shí)驗(yàn)室時，防護(hù)服必須脫下并留在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。不得穿著外出，更不能攜帶回家。用過的工作服應(yīng)先在實(shí)驗(yàn)室中消毒，然后統(tǒng)一洗滌或丟棄。

5當(dāng)手可能接觸感染材料、污染的表面或設(shè)備時應(yīng)戴手套。如可能發(fā)生感染性材料的溢出或?yàn)R出，宜戴兩副手套。不得戴著手套離開實(shí)驗(yàn)室。工作完全結(jié)束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。第28頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三三級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于主要通過呼吸途徑使人傳染上嚴(yán)重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有預(yù)防傳染的疫苗。

例如：艾滋病病毒的研究(血清學(xué)實(shí)驗(yàn)除外)應(yīng)在三級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。例如：重癥SARS病人傳染性較強(qiáng)，這與病人產(chǎn)生的大量呼吸道飛沫有關(guān)。

第29頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三三級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

1實(shí)驗(yàn)室中必須安裝Ⅱ級或Ⅱ級以上生物安全柜。

2所有涉及感染性材料的操作應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。當(dāng)這類操作不得不在生物安全柜外進(jìn)行時，必須采用個體防護(hù)與使用物理抑制設(shè)備的綜合防護(hù)措施。

3在進(jìn)行感染性組織培養(yǎng)、有可能產(chǎn)生感染性氣溶膠的操作時，必須使用個體防護(hù)設(shè)備。

4當(dāng)不能安全有效地將氣溶膠限定在一定范圍內(nèi)時，應(yīng)使用呼吸保護(hù)裝置。

5工作人員在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)前，應(yīng)在專用的更衣室(或緩沖間)穿著背開式工作服或其他防護(hù)服。工作完畢必須脫下工作服，不得穿工作服離開實(shí)驗(yàn)室?？稍俅问褂玫墓ぷ鞣仨毾认竞笄逑础?/p>

6工作時必須戴手套(兩副為宜)。一次性手套必須先消毒后丟棄。

7在實(shí)驗(yàn)室中必須配備有效的消毒劑、眼部清洗劑或生理鹽水，且易于取用?？膳鋫鋺?yīng)急藥品。第30頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三四級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室

實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對人體具有高度的危險(xiǎn)性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。與上述情況類似的不明微生物，也必須在四級生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。待有充分?jǐn)?shù)據(jù)后再決定此種微生物或毒素應(yīng)在四級還是在較低級別的實(shí)驗(yàn)室中處理。

第31頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三

1在實(shí)驗(yàn)室中所有感染性材料的操作都必須在Ⅲ級生物安全柜中進(jìn)行。如果工作人員穿著整體的由生命維持系統(tǒng)供氣的正壓工作服，則相關(guān)操作可在Ⅱ級生物安全柜中進(jìn)行。

2所有工作人員進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時都必須換上全套實(shí)驗(yàn)室服裝，包括內(nèi)衣、內(nèi)褲、襯衣或連衫褲、鞋和手套等。所有這些實(shí)驗(yàn)室保護(hù)服在淋浴和離開實(shí)驗(yàn)室前均必須在更衣室內(nèi)脫下。

第32頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三(六)培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件1細(xì)胞的營養(yǎng)需要2細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃，O2CO2:5%，CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.43無污染4無毒第33頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三1細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制1）水：新鮮配置的三蒸水或去離子水2）平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液，維持一定滲透壓和pH

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加水至1000ml第34頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三3）消化液：

胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制,常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。第35頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三4）培養(yǎng)基：培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。①天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限成分復(fù)雜，影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染第36頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三②合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。

合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。

優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低。缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。第37頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三第38頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三第40頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三

人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：

①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）；

②多種金屬離子；

③激素；

④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；

⑤各種生長因子；

⑥轉(zhuǎn)移蛋白；

⑦不明成分。第41頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三一般說來，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長一般需加10％血清．血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子，同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。第42頁，講稿共48頁，2023年5月2日，星期三③無血清培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴(kuò)展因子等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成